驅動蛋白家族成員15（KIF15）對肝細胞癌增殖能力的影響及其作用機制

仇建南， 汪 鵬， 曹 胤， 王忠夏， 吳俊華， 江春平

1 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院肝膽外科， 南京 210008

2 南京大學醫學院基礎醫學部， 南京 210093

肝細胞癌（HCC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內的發病率不斷上升。盡管肝部分切除術和肝移植術是目前主要的治療手段，但是很多患者確診時已經喪失了手術機會，預后較差。雖然HCC的治療已經取得一些新的進展，比如靶向藥物治療、免疫治療等［1-2］。但是HCC發生發展的機制仍然需要進一步深入探究。

驅動蛋白家族成員15（KIF15）具有四聚體紡錘馬達結構，其馬達結構域結構以ATP樣構型，頸部接頭與催化核心對接；通過水解ATP 為多種物質的運輸提供能量［3-4］。KIF15 在腫瘤中的作用被廣泛報道，例如KIF15通過激活Raf/MEK/ERK 通路促進非小細胞肺癌的惡性進展［5］；KIF15上調促進泛素特異性蛋白酶15（USP15）介導的DEK 去泛素化導致平滑肌肉瘤細胞生長［6］；KIF15通過抑制活性氧介導的細胞凋亡促進胃癌進展［7］。目前，KIF15 在HCC 中的作用尚不確切，因此本研究旨在探究KIF15在HCC中的潛在作用機制，為HCC的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 人正常肝細胞L02，人HCC細胞株HepG2、LM3、MHCC-97H 和Hep3B（中國科學院細胞庫）；KIF15過表達慢病毒（LV-KIF15）和對應的陰性對照（vector），KIF15 敲低慢病毒（sh-KIF15）和對應的陰性對照（shNC）及相應的轉染試劑HiTransG A/P（上海吉凱生物有限公司）；Trizol 試劑（美國Thermo Fisher 公司）；逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix 檢測試劑盒與CCK8 試劑（諾唯贊生物科技有限公司）；抑制劑LY294002（MCE 公司）；EDU 試劑盒（銳博生物有限公司）；Western Blot 試劑盒（碧云天有限公司）。本研究中抗體包括KIF15、GAPDH、p-PI3K（Tyr458）、PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）。DMEM培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；胰蛋白酶（新賽美公司）；青鏈霉素雙抗（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 使用DMEM（含10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）培養人HCC 細胞株HepG2、LM3、MHCC-97H、Hep3B 和正常肝細胞L02，放于37 °C 含5% CO2的加濕培養箱中培養。每2天換液1次，當細胞生長匯合率超過85%時，胰蛋白酶消化后分皿傳代培養。

1.2.2 慢病毒轉染 將Hep3B 和HepG2 培養至狀態良好，按每孔100 萬接種于6 孔板中，進行慢病毒轉染。Hep3B 轉染針對KIF15 的干擾慢病毒LV-shKIF15（sh1、sh2 和sh3）以及對照（sh-NC）；HepG2 轉染編碼KIF15 的慢病毒載體（LV-KIF15）以及對照（vector）。使用吉凱公司助轉染試劑提高轉染效率。培養2天后用含嘌呤霉素（2.5 μg/mL）的DMEM篩選培養。

1.2.3 qRT-PCR 實驗 將相應的HCC 細胞培養至狀態良好后收集，采用Trizol 試劑提取細胞的總RNA，然后合成cDNA的反應混合物為20 μL/孔，由1 μg總RNA和4 μL 5×HiScript ⅡqRT SuperMix 及無RNase 的ddH2O 組成。qRT-PCR 的反應體系為：1 μL cDNA、5 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、0.2 μL 上游引物、0.2 μL 下游引物和3.6 μL DEPC 水。設定程序：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s， 60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，40 個循環。KIF15 mRNA 的相對表達量按2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 CCK-8 實驗 將穩定轉染的HCC 細胞種在96 孔板（500個細胞/孔）中，分別于第1、2、3、4、5天相同時間，在每個孔加入CCK-8 溶液（10 μL/孔），在培養箱中孵育2 h后，使用酶標儀測量每孔在450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.5 平板克隆實驗 將培養的相應的HCC細胞按每孔500 個/2 mL 培養基密度接種于6 孔板中，連續培養14 天，棄掉培養基，PBS 洗滌后用4%多聚甲醛固定細胞10 min，棄掉多聚甲醛后每個孔加入2 mL 結晶紫染液，避光染色30 min 后，PBS 洗滌，等待自然干燥后，肉眼計數克隆形成的數目。

1.2.6 EdU 實驗 將穩定轉染的細胞株接種于96 孔板（2×104個細胞/孔）中，用DMEM 培養1天。然后，在37 ℃下用50 μmol/L 的EdU 孵育2 h。再用4%的甲醛溶液固定細胞30 min，然后用0.5%的TritonX-100 滲透細胞株10 min。加入400 μL 1×ApolloR 反應物，再加入400 μL Hoechest33342，PBS 沖洗3 次后觀察EdU 陽性細胞。最后通過顯微鏡拍攝細胞的圖像。

1.2.7 Western Blot實驗 收集Hep3B和HepG2細胞，加入包含PMSF和磷酸酶蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞30 min。收集蛋白樣品并檢測其濃度。取30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE（10%）凝膠電泳75 min，繼而進行轉膜。使用Western Blot 快速封閉液室溫孵育30 min。將條帶置于相應一抗（1∶1 000）中4 ℃搖床上孵育過夜。第二天用TBST洗膜3次，每次10 min。然后將條帶置于特異性二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h后，再次TBST洗膜3次，每次10 min。天能凝膠成像儀顯影蛋白條帶。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.2.8 動物實驗 將穩定轉染的sh-NC/sh3 Hep3B 細胞培養至狀態良好，按1×106個細胞/100 μL PBS 的密度重懸，接種于4 周齡雌性BALB/c 裸鼠的皮下，每組3 只裸鼠，皮下注射腫瘤細胞。28 天后摘下皮下瘤，計算腫瘤體積與腫瘤重量。將瘤塊石蠟包埋、切片和脫蠟，分別進行Ki67 和TUNEL 染色。實驗鼠購自揚州大學比較醫學中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2022-0009，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2022-0034。

1.2.9 生物信息學分析 使用TCGA-LIHC 數據集分析KIF15 在HCC 中的表達情況以及表達高低對臨床預后的影響。GEPIA 數據庫分析KIF15 在HCC 中與腫瘤分期的關系以及對預后的影響。

1.2.10 GSEA分析 為了在TCGA-HCC數據集中研究與KIF15相關的潛在信號途徑，故進行GSEA分析。首先，基于與KIF15 表達的相關性，生成TCGA-HCC 的FPKM 轉錄數據中所有基因的有序列表。然后選擇參考基因集“h.all.v6.2.entrez.Gmt”進行分析，最后使用GSEA 軟件（v2.10.1）分析KIF15高、低表達組之間的基因富集情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KIF15 在HCC 中的相對表達情況和對生存率的影響 通過分析TCGA-LIHC 數據集中KIF15的表達，發現在HCC 癌組織中KIF15 的表達量顯著高于正常肝組織（P＜0.05）（圖1a、b）；GEPIA 數據集分析發現，KIF15 與HCC 病理學分期呈正相關（P＜0.05）（圖1c）；qRT-PCR和Western Blot 分析發現KIF15 在HCC 細胞株中表達增高，同時選取表達量最高Hep3B 細胞株和較低的HepG2細胞株做后續探究（P＜0.05）（圖1d、e，表1）。

表1 Western Blot 檢測KIF15蛋白在HCC細胞株中的表達水平Table 1 The protein expression level of KIF15 in HCC cell lines by Western Blot

圖1 KIF15在HCC中的相對表達情況和對生存率的影響Figure 1 The relative expression of KIF15 in hepatocellular carcinoma and its effect on survival rate

通過分析TCGA-LIHC 數據集中KIF15 與HCC 的生存關系，發現KIF15高表達的患者生存率顯著低于KIF15低表達者（P＜0.05）（圖1f）；分析GEPIA 數據集中KIF15與HCC 的生存關系，亦發現KIF15 高表達的患者生存率顯著低于KIF15低表達者（P＜0.05）（圖1g）。綜上，KIF15在HCC中表達增高，且高表達患者生存更差。

2.2 KIF15 對HCC 增殖能力的影響 通過轉染慢病毒敲低Hep3B 細胞株中KIF15 的表達量，qRT-PCR 和Western Blot實驗分析發現sh3慢病毒的敲低效率最高，與sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B細胞的KIF15 mRNA（0.17±0.05 vs 0.99±0.03，P＜0.001）和蛋白水平（P＜0.05）均顯著下降（圖2a，表2），并選擇sh3-Hep3B 細胞用于后續研究。其次，對轉染慢病毒過表達HepG2 細胞株中KIF15的表達量，通過qRT-PCR 和Western Blot 實驗分析發現，與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的KIF15 mRNA水平（11.37±1.17 vs 1.00±0.13，P＜0.001）和蛋白水平（6.12±0.23 vs 0.99±0.06，P＜0.001）均升高（圖2b）。通過CCK-8實驗分析發現，與sh-NC-Hep3B相比，sh3-Hep3B的細胞活力受到抑制（0.765±0.104 vs 1.560±0.135，P＜0.05）（圖2c）；而與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2的細胞活力顯著增強（1.664±0.133 vs 1.056±0.123，P＜0.05）（圖2c）。通過GEPIA數據集分析顯示，KIF15在HCC中與增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達呈正相關（P＜0.05）（圖2d），提示KIF15 對于HCC 增殖能力可能存在促進作用。

表2 Western Blot 檢測KIF15蛋白在Hep3B中的表達水平Table 2 The protein expression level of KIF15 in Hep3B by Western Blot

圖2 KIF15對HCC增殖能力的影響Figure 2 Effect of KIF15 on proliferation of hepatocellular carcinoma

通過克隆形成實驗分析發現，與sh-NC-Hep3B 相比，sh3-Hep3B 的克隆形成數顯著減少（51.67±6.03 vs 118.33±11.59，P＜0.001）（圖2e）；而與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的克隆形成數顯著增多（172.00±7.55 vs 74.67±7.57，P＜0.001）（圖2f）。同時EdU 染色實驗顯示，與sh-NC-Hep3B 相比，sh3-Hep3B 的EdU 陽性率顯著降低［（14.33±2.08）% vs （28.67±2.08）%，P＜0.01］（圖2g）；而與vector-HepG2 相比，LV-KIF15-HepG2 的EdU陽性率顯著升高［（28.67±1.53）% vs （15.00±1.73）%，P＜0.001］（圖2h）。綜上，KIF15能夠促進HCC的增殖能力。

2.3 KIF15 對HCC 體內生長能力的影響 通過構建皮下瘤生長模型，探究KIF15 對于HCC 體內生長的影響。將穩定轉染并生長狀態良好的Hep3B細胞株（sh-NC/sh3）按照每100 μL中1×106個細胞的數量，接種于裸鼠皮下，造模后皮下瘤瘤體見圖3a。研究結果顯示，與sh-NCHep3B 細胞相比，sh3-Hep3B 細胞皮下瘤體積［（350.00±100.00）mm3vs （1 046.67±105.03）mm3，P＜0.001］和重量［（366.67±110.15）mg vs （1 166.67±76.38）mg，P＜0.001］均顯著降低（圖3b、c）。對皮下瘤進行免疫組化染色發現，sh3-Hep3B 細胞皮下瘤Ki67 的組化評分顯著低于轉染sh-NC-Hep3B 的皮下瘤（2.33±0.58 vs 7.33±1.15，P＜0.01）（圖3d）；而轉染sh3-Hep3B 細胞皮下瘤TUNEL 的組化評分顯著高于sh-NC-Hep3B 細胞的皮下瘤（5.33±1.15 vs 1.33±0.58，P＜0.01）（圖3e），提示敲低KIF15 抑制了Hep3B 皮下瘤的增殖能力，而增強了凋亡水平。綜上，敲低KIF15能夠抑制HCC的體內生長能力。

圖3 KIF15對HCC體內生長能力的影響Figure 3 Effect of KIF15 on the growth capacity of hepatocellular carcinoma in vivo

2.4 KIF15 對HCC 增殖能力影響的機制 通過GSEA分析KIF15 在HCC 中發揮作用的潛在機制，發現KIF15與PI3K/AKT/mTOR 通路呈正相關（NES=1.59，P＜0.001）（圖4a）。Western Blot實驗結果表明，與sh-NC-Hep3B細胞相比，sh3-Hep3B 細胞中PI3K/AKT/mTOR 信號通路受到顯著抑制（P值均＜0.001）（圖4b，表3）；而與vector 組相比，過表達KIF15 能夠促進HepG2 細胞的PI3K/AKT/mTOR信號通路顯著增強（P值均＜0.001）（圖4c，表4）；此外，PI3K 抑制劑LY294002 能夠抑制LV-KIF15-HepG2 細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路（圖4d，表5）。CCK-8實驗結果表明，當LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路后，LY294002+LV-KIF15-HepG2 細胞的活力較LV-KIF15-HepG2 細胞明顯下降（1.084±0.118 vs 1.670±0.102，P＜0.01）（圖4e）。平板克隆實驗結果顯示，相較于LV-KIF15-HepG2 細胞，LY294002 處理后的LV-KIF15-HepG2 細胞的克隆形成能力受到顯著抑制（78.33±7.64 vs 161.67±17.56，P＜0.01）（圖4f）。EdU 染色實驗顯示，相較于LVKIF15-HepG2 細胞，LY294002 處理后的LV-KIF15-HepG2細胞的EdU陽性率顯著降低［（18.61±1.24）% vs （28.54±3.83）%，P＜0.05］（圖4g）。綜上，KIF15 通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進HCC的增殖能力。

表3 Western Blot 檢測Hep3B細胞中相關蛋白表達結果Table 3 Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in Hep3B cells

表4 Western Blot 檢測HepG2細胞中相關蛋白表達結果Table 4 Western Blot analysis was performed to determine the expression levels of related proteins in HepG2 cells

表5 LY294002抑制劑干預對HepG2細胞中相關蛋白表達的影響Table 5 The effect of inhibitor LY294002 intervention on the expression of related proteins in HepG2 cells

圖4 KIF15對HCC增殖能力影響的機制探究Figure 4 The mechanism of the effect of KIF15 on the proliferation of hepatocellular carcinoma

3 討論

肝癌發病率和死亡率位列全球惡性腫瘤第6 位和第4位，預計到2040年全球將有140萬肝癌患者，且將有130 萬人死于肝癌［8］。目前HCC 的主要治療方法是手術、介入、化療和免疫治療等，但是患者的復發率仍然較高，5年生存率僅約20%［9-11］。因此，探究HCC 發生和發展的機制，對HCC的診治將提供重要的理論基礎。

KIF15，又名kinesin-12，是一種微管相關蛋白，其功能是微管依賴轉運或紡錘體組織的調節因子［12-13］。已有大量研究［14-15］揭示了KIF15在多種腫瘤中的作用。在胰腺癌中，KIF15通過招募USP10和磷酸甘油酸激酶1增強胰腺癌細胞的糖酵解能力，從而增強其惡性程度［16］；敲低KIF15 后，膠質瘤的增殖能力受到抑制［17］；此外，KIF15在鼻咽癌組織中高表達，與鼻咽癌預后不良相關，敲低KIF15 將抑制鼻咽癌細胞株的增殖和傾襲能力［18］。在前列腺癌中，KIF15通過增強前列腺癌細胞的雄激素受體（AR）信號通路來促進恩雜魯胺耐藥；機制上，KIF15直接結合AR/AR-v7的N端，通過增加USP14與AR/AR-v7 的蛋白結合，阻止AR/AR-v7 蛋白的降解［19］。HCC 作為惡性程度較高的常見腫瘤，KIF15對HCC的作用尚不明確。

本研究通過分析TCGA 和GEPIA 數據庫發現KIF15在HCC組織中表達顯著增高，且KIF15高表達與HCC不良預后相關。通過qRT-PCR 和Western Blot 評估KIF15在HCC 細胞株中的表達水平，選擇HepG2 過表達KIF15以及選擇Hep3B 敲低KIF15，驗證過表達和敲低的效率后進行細胞實驗的探究。結果顯示，過表達KIF15 導致HCC 細胞株的增殖能力增強，而敲低KIF15 能夠抑制HCC 細胞株的增殖；并且敲低KIF15 能夠抑制HCC 的體內生長能力。上述結果表明KIF15 在HCC 中發揮促進增殖的促癌作用。

已有大量研究［20-22］報道，PI3K/AKT/mTOR 信號通路在癌癥進展中發揮關鍵作用。TBK1通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進甲狀腺癌進展［23］；UHMK1通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路促進肺腺癌的發生［24］；STK3通過抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，降低胰腺癌細胞的增殖能力，并且促進癌細胞的凋亡［25］。本研究通過GSEA 分析發現KIF15 在HCC 中與PI3K/AKT/mTOR 的激活呈正相關。通過Western Blot分析發現，過表達KIF15能夠激活HepG2細胞的PI3K/AKT/mTOR 通路，而敲低KIF15導致Hep3B 細胞的PI3K/AKT/mTOR 通路受到抑制。通過進一步實驗發現，PI3K 抑制劑LY294002 能夠抑制過表達KIF15的HepG2細胞中的PI3K/AKT/mTOR 通路，并且導致細胞的增殖能力受到顯著抑制。

綜上所述，本研究證實KIF15 通過激活PI3K/AKT/mTOR通路，發揮促進HCC的增殖能力，為KIF15作為肝癌的診斷標志和預后指標提供了理論依據，但是KIF15在HCC中的精確機制仍需深入探究。

倫理學聲明：本研究方案于2016 年5 月7 日經由南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物保護與福利委員會批準，批號：2016-057-01，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：仇建南負責實驗設計與操作，并撰寫論文；汪鵬、曹胤、王忠夏負責數據分析和文章潤色；江春平、吳俊華提供課題思路，指導實驗內容，審閱最終文稿。