感染后腸易激綜合征腸道菌群及血清代謝物對內臟敏感性影響

閆 波，潘 穎，田平平

（安徽醫學高等?？茖W校醫學技術學院，合肥 230601）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種持續或間歇發作，以腹痛、腹脹、排便習慣和（或）大便性狀改變為臨床表現，而缺乏胃腸道結構和生物化學異常改變的腸道功能紊亂性疾病。其中感染后腸易激綜合征（post-infection irritable bowel syndrome，PI-IBS）占IBS的10%〔1〕。目前IBS病因尚不明確，研究〔2〕發現IBS 與內臟高敏感性、胃腸道動力異常、腸道低度炎癥刺激、腸道菌群失調等有關。其中內臟高敏感性是IBS 的主要病理生理機制之一，也是IBS患者胃腸功能紊亂、腹痛及癥狀多樣化的最主要病理生理基礎，是IBS的生物學標志〔3-4〕。

腸道菌群在維持腸道內環境、腸道疾病的發生和自穩過程中起關鍵作用，腸道微生態的改變是引發和加重IBS 內臟高敏感反應狀態、影響胃腸道動力的關鍵病理生理環節。腸道微生物代謝產生維生素、脂肪酸、膽汁酸等產物，短鏈脂肪酸多為厭氧菌發酵產物，如乙酸、丙酸、丁酸等對胃腸道功能產生影響〔5〕。本研究采用血清代謝組學分析和16S rDNA 測序分別檢測血清代謝物和腸道微生物變化，探索PI-IBS 小鼠中腸道菌群和代謝的相關性，進一步明確腸道菌群及其代謝物在PI-IBS 發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料SPF 級雄性NIH 小鼠，體質量20~25 g，購自斯貝福生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2019-0010。小鼠飼養于安徽醫科大學實驗動物中心，分籠飼養、自由飲食，12 h 光照、黑暗交替節律。所有小鼠實驗前在同一環境中適應性喂養7 d〔2〕。

1.2 方法

1.2.1 PI-IBS 模型制備與分組 采用含400~500條旋毛蟲幼蟲的0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃NIH小鼠，構建PI-IBS 模型〔6〕。將所有小鼠隨機分為對照組和PI-IBS 組，每組9 只。PI-IBS 組給予旋毛蟲灌胃，對照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，直至感染8 周后評估內臟敏感性，判斷造模是否成功。

1.2.2 腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR） 利用AWR 評分進行各組小鼠內臟敏感性測定。將小鼠放在透明盒上，使之能自由活動，但不能轉身、掉頭。給予不同體積水進行結直腸擴張（0.25、0.35、0.50、0.65 mL）〔7〕，觀察小鼠對不同程度擴張壓力的行為反應。操作者和觀察者采取雙盲的方法根據小鼠對刺激的反應進行AWR 評分〔2，8〕，取3次評定的平均值作為結果。

1.2.3 樣本采集 小鼠糞便樣本置于無菌管中用于16S rDNA 測序。小鼠眼球取血置于EP 管中，靜置2 h后，3 000 r∕min 離心15 min，取上清液-80 ℃保存備用。

1.2.4 16S rDNA 測序與分析 采用CTAB 法提取樣本的基因組DNA，檢測DNA 的純度和濃度。根據測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對選定的V3~V4 可變區進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目標片段進行切膠回收。參照電泳初步定量結果，對PCR 擴增回收產物定量檢測，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。使用NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit 建庫試劑盒構建文庫。構建好的文庫通過Agilent Bioanalyzer 2100 生物分析儀和Qubit 熒光分光光度計質檢，文庫質檢合格后上機測序。

所有樣品的有效數據用Uparse 軟件完成聚類分析，其中有97%相似度的序列聚類成為運算分類單元（operational taxonomic unit，OTU），然后注釋OTU 代表序列的物種。用greengene 數據庫注釋。利用Mothur 軟件計算α 多樣性（Chao1 指數、ACE指數、香農指數、辛普森指數），β多樣性分析計算Weighted Unifrac距離。

用t檢驗和STAMP 分析方法檢驗2 組樣本的物種組成和群落之間是否存在統計學差異。線性判別分析效應大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析顯示關鍵細菌的改變，并設置線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）評分的篩選值為2。

1.2.5 血清代謝組學分析 取血清100 μL，加入400 μL 預冷甲醇∕乙腈（1:1），渦旋混合，-20 ℃靜置30 min，4 ℃16 000 r∕min 離心20 min，取上清液，真空干燥，復溶，渦旋，離心，取上清液進樣質譜分析。采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統HILIC 色譜柱進行分離。流動相A：水+25 mmol∕L乙酸銨+25 mmol∕L 氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0~1 min，85%B；1~12 min，85%~65%B；12~12.1 min，65%~40%B；12.1~15 min，40%B；15~15.1 min，40%~85%B；15.1~20 min，85%B。柱溫25 ℃；流速0.3 mL∕min；進樣量2 μL。分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測。樣品經UHPLC 分離后用Triple TOF 6600 質譜儀進行質譜分析。ESI 源條件如下：離子源氣體1 為60，離子源氣體2 為60，幕簾氣體為30，源溫度為600 ℃，離子噴霧電壓浮動±5 500 V（正負2 種模式）；二級質譜采用信息依賴性采集獲得，并且采用峰強度值篩選模式，參數設置如下：去簇電壓為±60 V，碰撞能量固定在（35±15）eV，動態排除同位素離子范圍為4 Da，每次掃描獲取碎片圖10個。

用MzXML 文檔處理原始數據，然后進行峰對齊、保留時間校正以及用XCMS 提取峰面積。根據峰值強度將原始數據歸一化，處理后的數據采用R 軟件包進行分析。使用置換測試評估模型穩健性。在正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型中，計算變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值以證明其對分類的影響。使用SPSS 24.0 軟件通過t檢驗或非參數檢驗比較2 組間的差異，差異代謝物篩選以VIP>1 和P<0.05 為標準。用KEGG數據庫進一步分析代謝物的通路。

1.3 統計分析采用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以（±s）表示，2 組間的比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。通過Spearman分析差異代謝物和差異菌群的相關性。

2 結果

2.1 2 組小鼠AWR 評分采用AWR 評分評估PIIBS 內臟敏感性變化，與對照組比較，PI-IBS 組小鼠在水體積為0.25、0.35、0.50、0.65 mL時，其結直腸擴張反應明顯增強，AWR 評分均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 2組小鼠AWR評分（±s，n=9）

表1 2組小鼠AWR評分（±s，n=9）

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

組別對照組PI-IBS 組擴張水體積∕mL 0.25 0.67±0.22 1.85±0.74**0.35 1.22±0.57 2.37±0.87**0.50 2.30±0.48 3.11±0.80*0.65 2.30±0.81 3.07±0.60*

2.2 2組小鼠腸道菌群物種的改變小鼠腸道菌群變化結果顯示，Chao1指數、ACE 指數、香農指數、辛普森指數在對照組和PI-IBS 組小鼠間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1?；赪eighted Unifrac距離的β多樣性組間差異分析的結果顯示，2 組間差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 2組小鼠腸道菌群的β多樣性比較

16S rDNA分析小鼠糞便菌群變化，共鑒定出10個門，以擬桿菌門Bacteroidetes 和厚壁菌門Phylum Firmicutes 為主。見表2。在屬水平上，與對照組相比，PI-IBS組小鼠糞便中小鼠腸道宏基因組、糞桿菌屬Faecalibacterium、鞘桿菌屬Ileibacterium相對豐度明顯增加，表皮桿菌屬Cutibacterium相對豐度降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。采用LEfSe分析比較2組腸道菌群豐度在各物種分類水平上的差異，基于LEfSe 線性判別分析結果顯示，對照組的特征細菌是毛螺菌屬的g_Lachnospiraceae_UCG_006，PI-IBS 組的特征細菌是小鼠腸道宏基因組mouse gut metagenome和另枝菌屬的g_Alistipes。

圖3 2組菌群在屬水平上的差異比較

表2 2組菌群在門水平上主要物種相對豐度

2.3 2 組小鼠血清代謝物的改變和代謝通路分析在正、負離子模式下，對照組和PI-IBS 組小鼠中共鑒定出1 296 種代謝物。這些代謝物由多種成分組成，主要包括脂質和類脂質分子、有機酸及其衍生物、有機雜環化合物、含氧有機化合物等。見表3。在OPLS-DA 模式下，對照組與PI-IBS 組的樣本分布不同，表明2 組代謝具有顯著差異。見圖4。以VIP>1，P<0.05為標準，共篩選出22種組間差異代謝物，包括L-瓜氨酸、DL-苯丙氨酸、蘋果酸、乙酰肉堿、乙酰膽堿等。見表4?；贙EGG 富集分析篩選的代謝通路，包括氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸生物合成、突觸囊泡循環等16條代謝通路。見圖5。

圖4 正、負離子模式下2組間OPLS-DA

圖5 差異代謝物富集通路

表3 代謝物中化學成分分類占比情況

表4 2組鑒定后的顯著差異代謝物

2.4 2組小鼠差異腸道菌群與差異代謝物的相關性腸道菌群變化與體內代謝物產生有關，并參與各種疾病的發生。對PI-IBS組小鼠篩選出的差異菌群和差異代謝物進行相關性分析。圖6 直觀展示了差異菌群和差異代謝物之間存在一定的相關性。其中，mouse gut metagenome與乙酰膽堿呈顯著正相關。

圖6 差異菌群和差異代謝物相關性熱圖

3 討論

內臟超敏反應和腸道微生物導致的慢性炎癥是PI-IBS 患者的潛在重要致病因素。內臟高敏反應是PI-IBS 的主要特征之一，在旋毛蟲感染NIH 小鼠后的PI-IBS模型中已經被證實〔9〕。

PI-IBS 的發生與腸道菌群失調密切相關，健康人群和PI-IBS 患者之間微生物群分布存在顯著差異。在PI-IBS 患者中，Bacteroidesssp 顯著增加，Uncultured clostridiales減少〔10〕。研究〔11〕也證實腸道菌群的改變可以明顯改善PI-IBS小鼠的內臟超敏反應。本研究中，與對照組相比，PI-IBS組小鼠中小鼠腸道宏基因組、類桿菌屬、鞘桿菌屬相對豐度明顯增加，表皮桿菌屬相對豐度明顯降低。通過LEfSe 線性判別分析，發現IBS小鼠腸道微生物標志物g_Alistipes，Alistipes屬的不同菌株被證明具有與不同疾病和病癥相關的獨特生理作用〔12〕。Alistipes可產生吲哚，參與色氨酸的代謝〔13〕。由于色氨酸也是血清素的前體，因此增加的Alistipes豐度可能會破壞腸道血清素系統的平衡。本課題組前期的研究中也發現血清素5-羥色胺在PI-IBS 小鼠中發生明顯改變〔14〕。在IBS 患者中，較高水平的Alistipes與腹痛的頻率更高有關，推測Alistipes與腸道炎癥有關〔15〕。因此，Alistipes可能通過影響色氨酸的代謝影響PI-IBS 的發生。

PI-IBS 腸道菌群相關的代謝物會通過腸道屏障入血，作用于相應靶器官，影響疾病的發生。本研究收集PI-IBS 組和對照組小鼠血清進行非靶向代謝組學分析。結果表明，2 組間有22 種代謝物存在顯著差異，這些差異代謝物主要富集于氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸生物合成、突觸囊泡循環等16條代謝通路。PI-IBS組小鼠L-瓜氨酸明顯增加，并參與氨基酸的生物合成和精氨酸生物合成代謝通路。腸道菌群通過影響L-精氨酸代謝改善結腸炎的炎癥反應〔16〕，瓜氨酸和精氨酸代謝改變與微生物態失調有關〔17〕。研究〔18〕證實瓜氨酸也是小腸吸收功能的潛在敏感生物標志物。IBS 存在代謝異常，與L-瓜氨酸參與的氨基酸和精氨酸的生物合成通路有關。

越來越多的證據表明，硫氨基酸在蛋白質結構、代謝、免疫和氧化中起著至關重要的作用〔19-20〕。小兒克羅恩病患者糞便中的氨基酸半胱氨酸和蛋氨酸均顯著增加〔21〕。多種腸道微生物參與半胱氨酸和蛋氨酸的合成和代謝，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等〔22-23〕。本研究發現PI-IBS 組小鼠的半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路上調，參與代謝通路的半胱氨酸硫酸鹽明顯增多，表明腸道菌群可能通過調節含硫的半胱氨酸和蛋氨酸代謝影響PI-IBS。

本研究中，PI-IBS 組小鼠血清中的乙酰膽堿較對照組明顯增加，主要富集在突觸囊泡循環、肌動蛋白細胞骨架的調控等多條通路。研究〔24〕表明增加乙酰膽堿的攝取可以緩解IBS 鼠的內臟敏感性。在一項旋毛蟲制備的PI-IBS 小鼠實驗中，馬來酸曲美布汀通過抑制高乙酰膽堿改善腸道高反應性〔25〕。此外，本研究的相關性分析結果表明，乙酰膽堿與mouse gut metagenome呈顯著正相關。因此，乙酰膽堿參與的代謝通路與其相關腸道微生物可能是PIIBS發病機制的關鍵途徑。

綜上所述，PI-IBS 小鼠不僅存在腸道菌群失調，血清代謝物也發生明顯改變，主要涉及氨基酸代謝和乙酰膽堿參與的代謝通路。這些代謝物的改變可能與腸道菌群失調有關。研究結果從多組學角度為進一步闡釋PI-IBS 的作用機制指明了潛在新方向。但深入探討差異代謝物改變與菌群變化的關系有待進一步研究。