過量表達大豆異丙基蘋果酸脫氫酶基因GmIPMDH 促進植株開花和生長

劉 薇 王玉斌 李 偉 張禮鳳 徐 冉 王彩潔 張彥威

山東省農業科學院作物研究所 / 山東省特色作物工程實驗室, 山東濟南 250100

亮氨酸是一種重要的支鏈必需氨基酸, 只能在植物或微生物體內從頭合成, 對哺乳動物骨骼肌蛋白周轉、蛋白質合成、機體免疫功能和氧化供能等方面起到重要的生物學作用[1]。異丙基蘋果酸合成酶(isopropylmalate synthase, IPMS)和異丙基蘋果酸脫氫酶(isopropylmalate dehydrogenase, IPMDH)是亮氨酸生物合成中的重要限速酶。在IPMS 的作用下,α-羧基異戊酸與乙酰輔酶A 縮合形成α-異丙基蘋果酸, 隨后發生異構化形成β-異丙基蘋果酸。β-異丙基蘋果酸在IPMDH 的催化作用下進行脫羧反應形成α-羰基異己酸, 最后發生基于谷氨酸的轉氨反應后形成產物亮氨酸[2]。

目前, 在水稻、油菜和擬南芥中對IPMS 基因進行了分離。擬南芥中, 3 個IPMS基因在根、葉、莖和花中都表達。缺少5′葉綠體引導序列的IMS2和IMS3能夠補充大腸桿菌的亮氨酸營養素[3]。在水稻中,OsIPMS1參與調控了發芽種子中的淀粉水解、糖酵解活性和能量水平, 進而影響水稻發芽。同時, 研究發現在osipms1突變體中11 個與脅迫耐受、赤霉素生物合成和三羧酸(TCA)循環相關的基因表達量顯著降低[4]。在擬南芥中過量表達油菜BrIPMS基因改變了擬南芥的氨基酸代謝, 提高了芥子油苷的含量[5]。在油菜、馬鈴薯和擬南芥中對IPMDH進行了分離和克隆[6-8], 但只有擬南芥中AtIPMDH基因的功能得到了驗證。AtIPMDH1基因能夠調節芥子油苷的氧化還原反應, 影響亮氨酸的生物合成[9]。同時有研究表明, 擬南芥中AtIPMDH2和AtIPMDH3不僅在亮氨酸生物合成中起作用, 對花粉發育也至關重要, 并且是胚胎囊發育所必需[10]。以上研究表明,IPMS和IPMDH在植物的生長發育中發揮了重要作用。

大豆是人類重要的植物蛋白質來源, 然而關于大豆亮氨酸合成途徑的關鍵酶未見報道。本研究以擬南芥AtIPMDH2的大豆同源基因GmIPMDH為研究對象, 通過實時熒光定量PCR、遺傳轉化、轉錄分析等方法, 解析GmIPMDH的功能。研究發現GmIPMDH參與大豆花期和株型的調控。相關研究結果為大豆花期和株高改良提供了基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用大豆品種Williams 82 (Wm82)由本課題組保存; 轉基因煙草受體品種Havana425 由東北農業大學大豆研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析 利用擬南芥基因AtIPMDH2的氨基酸序列, 在phytozome數據庫(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)[11]進行序列比對,選取bitscore最高的基因作為本研究的目標基因。利用引物GmIPMDH-s和GmIPMDH-a(表1)克隆GmIPMDH的CDS序列, 擴增產物交由擎科生物技術有限公司測序; 利用CDD 在線分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[12]進行氨基酸序列的保守結構域分析; 利用在線分析軟件SOPMA (https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)[13]進行二級結構分析; 利用Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)[14]預測蛋白的3D結構。在Phytozome數據庫提取GmIPMDH上游2056 bp的序列作為啟動子序列,并利用引物GmIPMDH-pro-s和GmIPMDH-pro-a進行啟動子的克隆。通過在線分析網站PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[15]分析啟動子的順式作用元件。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2GmIPMDH基因的表達分析 大豆品種Wm82 種植在草炭土中, 于人工氣候室(25℃, 12 h光照/12 h 黑暗)培養, 播種7 d 后挑選長勢一致的大豆幼苗每盆定植3 株, 分別提取大豆播種15 d 后的根、莖尖、葉片、子葉和下胚軸和播種45 d 后的花和幼莢RNA 進行GmIPMDH的組織特異性表達分析;分別提取大豆播種12 d、15 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d、33 d 葉片RNA 進行大豆營養生長階段GmIPMDH的表達分析。參照諾唯贊生物科技股份有限公司植物RNA 抽提試劑盒(RC401-01)提取樣品總RNA, 參照寶生物科技有限公司反轉錄試劑盒(RR047A)操作說明合成 cDNA 第 1 鏈。根據GmIPMDHCDS 序列信息, 利用NCBI Primer Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)[16]設計引物(表1), 利用Roche LightCycler 480II 進行熒光定量PCR, 采用相對定量法(2-ΔΔCt)[17]計算基因的表達水平。

1.2.3 轉基因株系的獲得 將GmIPMDHCDS 序列插入植物表達載體 pCambia3301 中, 構建pCambia3301-GmIPMDH過量表達載體。利用農桿菌介導的煙草葉盤法轉化煙草受體 Havana425[18],利用農桿菌介導的大豆子葉節法[19]轉化大豆受體Wm82。初步獲得的陽性轉基因株系利用PCR 和qPCR 法進行進一步的驗證(表1)。

1.2.4GmIPMDH煙草過量表達植株的表型分析

煙草種子種植于1/2 MS 培養基中, 出苗后挑選長勢一致的幼苗定植于營養土土中, 于人工氣候室(28℃, 12 h 光照/12 h 黑暗)培養, 統計其花期及開花時株高。煙草花期以萌發至開花當天的天數記錄。利用SPSS Statistics19 中的Student’st檢驗分析顯著性差異。

1.2.5GmIPMDH大豆過量表達植株的表型分析

大豆種子種植在草炭土中, 于人工氣候室(25℃,10 h 光照/14 h 黑暗)培養, 播種7 d 后挑選長勢一致的大豆幼苗每盆定植2 株, 統計其花期(播種翌日至開花當天的天數)及開花時株高。利用SPSS Statistics 19 中的Student’st檢驗分析顯著性差異。

1.2.6 大田條件下GmIPMDH大豆過量表達植株的表型分析 將Wm82 和GmIPMDH過量表達株系于2022 年6 月24 日種植于山東省濟南市試驗田(36°42'28″N, 117°05'19″E), 每個株系種3 行, 行長2 m, 株距10 cm, 行距50 cm。試驗設3 次重復。統計各株系的開花天數(播種翌日至小區開花的株數達到50%)。利用SPSS Statistics19 中的Student’st檢驗分析顯著性差異。

1.2.7 轉基因大豆的轉錄組測序 大豆培養條件同1.2.2, 分別于播種14 d 和17 d 后選取Wm82 和GmIPMDH過量表達株系第1 片三出復葉中間葉片送交邁維代謝科技有限公司進行轉錄組測序, 每份樣品9 株混樣, 3 次重復。利用DESeq2 和Benjamini-Hochberg 方法篩選差異表達基因, |log2(Fold Change)|≥ 1, 且FDR ＜ 0.05。在SoyBase 數據庫檢索差異表達基因注釋信息, 利用Uniprot 數據庫(https://www.uniprot.org/)及基因對應的擬南芥同源基因的功能篩選出開花調控候選基因。

2 結果與分析

2.1 AtIPMDH2 同源基因GmIPMDH 的克隆和序列分析

將擬南芥基因AtIPMDH2(AT1G80560)序列提交至Phytozome 數據庫進行比對, Glyma.15G005400的比對bitscore 最高, 為623.624, identity 為74%, 故對其進行后續研究。Glyma.15G005400 基因全長4121 bp, 含有9 個外顯子和8 個內含子(圖1-A)。提取Wm82 葉片RNA 并反轉錄, 以該cDNA 為模板對Glyma.15g005400 進行克隆并測序。結果表明CDS區全長1230 bp, 其編碼的氨基酸從第43 個氨基酸到第400 個氨基酸為Iso_dh 亞家族保守結構域, 表明Glyma.15g005400 編碼一個異丙基蘋果酸脫氫酶(IPMDH), 故將該基因命名為GmIPMDH。對GmIPMDH 蛋白的二級結構和三級結構進行預測表明, 該蛋白主要以α 螺旋和無規則卷曲為主(圖1-C,D)。其中α 螺旋占比為43.52%, 無規則卷曲占比為34.96%, 還含有少量的延伸連(13.45%)和 β 轉角(8.07%) (圖1-C)。

圖1 GmIPMDH 序列分析Fig. 1 Sequence analysis of GmIPMDH

圖2 GmIPMDH 的表達量Fig. 2 Relative expression pattern of GmIPMDH genes

根據大豆基因組信息, 克隆了GmIPMDH起始密碼子上游2056 bp 的序列。啟動子元件分析(表2)表明,GmIPMDH啟動子中包括5 類光反應元件(G-box、BOX4、TCT-motif、AT1-motif 和3-AF1 binding site); 3 類激素應答元件, 分別是脫落酸應答元件(ABRE)、乙烯應答元件(ERE)和水楊酸應答元件(TCA); 2 個應激元件(STRE, WUN-motif)。同時,GmIPMDH還包括多個MYC 結合位點。

表2 GmIPMDH 啟動子元件分析Table 2 Cis-elements of GmIPMDH promoter

2.2 GmIPMDH 的組織表達分析

為闡明GmIPMDH在不同組織的表達模式, 利用qRT-PCR 檢測GmIPMDH在大豆根、莖、葉、子葉、下胚軸、花和莢的表達量。結果顯示,GmIPMDH在各個部位均有表達, 在根、下胚軸、花和和幼莢表達量較高。同時, 檢測了短日下不同天數GmIPMDH在葉片中的表達量, 結果顯示,GmIPMDH在種植第12 天和第15 天時表達量較低, 從第18 天開始表達量上升, 第27 天表達量達到高峰, 隨后下降。

2.3 異源表達GmIPMDH 改變煙草花期和株高

將煙草Havana425 和GmIPMDH煙草過量表達株系種植于人工氣候室, 觀察比較植株的開花時間。與野生型相比, ox-1、ox-5 和ox-21 的開花時間明顯提前(圖3-A, B), 3 個轉基因株系花期分別提前57.1 d、45.8 d 和39.8 d (圖3-B); 同時, ox-1、ox-5和ox-21 的株高顯著提高(圖3-C), 具體表現為節數的增加和節間距的增長(圖3-A)。

圖3 GmIPMDH 過量表達煙草表型Fig. 3 Phenotypes of tobacco with ectopic expression of GmIPMDH

2.4 溫室短日和田間自然條件下過量表達GmIPMDH 大豆株系功能分析

選取GmIPMDH表達量相對較高的大豆過量表達T3代株系ox-4 和ox-5 (圖4-B)于溫室短日條件(10 h 光照/14 h 黑暗)培養, 觀察并統計其花期表型。結果顯示, 在溫室短日照條件下, Wm82 開花時間為35.75 d, 而過量表達株系ox-4 和ox-5 的開花時間顯著早于野生型 Wm82 (比 Wm82 平均提前 2.25～2.75 d); 播種36 d 后, Wm82 株高26.5 cm, 5.1 節, ox-4株系株高36.5 cm, 7.0 節, ox-5 株系株高34.5 cm, 6.8節。因此, 與野生型相比, 過量表達株系株高和節數均極顯著提高(圖4-A, D)。綜上, 在溫室短日照條件下,GmIPMDH過量表達大豆株系生長發育進程顯著加速, 表現出花期提前、株高提高、節數增加的特性。

(圖4)

將大豆過量表達T4代株系ox-4 和ox-5 種植于田間, 檢測GmIPMDH的表達量并統計植株開花天數。在田間種植條件下, 過量表達株系中GmIPMDH表達量較Wm82 提高20～30 倍(圖5-A); Wm82 花期為37.3 d, 比過量表達株系平均延遲3.0～3.5 d, 且達到了極顯著水平(圖5-B)。

圖5 田間GmIPMDH 過量表達大豆株系的開花時間統計Fig. 5 Flowering time statistics of GmIPMDH overexpression lines in the field

2.5 轉錄組學分析

分別提取溫室生長14 d 和17 d 的GmIPMDH過量表達大豆葉片RNA 進行轉錄組分析。GmIPMDH過量表達大豆植株與Wm82 野生型植株基因表達差異較大(圖6-A, B)。在14 d 和17 d 分別檢測到1210個和1768 個差異表達基因(圖6-A, B)。其中, 14 d上調表達基因526 個, 下調表達基因684 個(圖6-C);17 d 上調表達基因866 個, 下調表達基因902 個(圖6-C)。表明隨著大豆的生長發育, 檢測到更多的差異表達基因。在14 d 和17 d 均檢測到的差異表達基因225 個(圖6-D)。對差異表達基因進行功能注釋, 在14 d 檢測到12 個花期相關差異表達基因(表3 和圖6-E); 在17 d 檢測到18 個花期相關差異表達基因(表3 和圖6-F)。這些開花相關差異基因中,REF6、MED13、FPA、FD、PRR5、FKF1、GA3OX1等開花正調控因子上調表達,AGL18、ICE1、GA2ox1、GA2ox2、GA2ox8等開花負調控因子下調表達。同時, 我們還發現赤霉素合成相關基因表達量也發生了顯著變化, 其中GA3ox1上調表達,GA2ox1、GA2ox2、GA2ox8下調表達(圖6和表3)。

圖6 GmIPMDH 過量表達大豆的轉錄組學分析Fig. 6 Transcriptome analysis of GmIPMDH overexpression soybean

表3 花期相關差異表達基因功能注釋Table 3 Functional annotation of DEGs related to flowering time

3 討論

異丙基蘋果酸脫氫酶(IPMDH)是亮氨酸生物合成中的重要限速酶。在擬南芥中,AtIPMDH2和AtIPMDH3不僅在亮氨酸生物合成中起作用, 對花粉發育也至關重要, 并且為胚胎囊發育所必需[10]。但是,IPMDH參與開花期的研究未有任何報道。本研究對擬南芥AtIPMDH2在大豆中的同源基因GmIPMDH進行了克隆和分析。在營養生長階段,GmIPMDH在早期表達量較低, 而在第18天開始上升, 第27天表達量達到高峰, 推測GmIPMDH可能與大豆的生長發育有關。在煙草的異位表達和大豆的過量表達均證明,GmIPMDH對開花期有正向調節作用。同時發現, 轉GmIPMDH的大豆株系株高提高、節數增加。因此, 轉GmIPMDH基因的大豆植株表現出較快的生長發育進程。

通過轉錄組測序發現了若干個開花期相關基因表達量的變化。這些開花基因可能是GmIPMDH改變大豆花期的原因之一。值得注意的是, 本研究發現了赤霉素相關基因GA3ox1、GA2ox1、GA2ox2、GA2ox8表達量的變化。赤霉素能夠促進植物種子萌發、莖和根的伸長、葉片伸展、成花誘導、花粉發育,在植物的整個生命周期有著極為重要的作用[20-22]。GA生物合成代謝途徑涉及多種酶, 其中GA3ox和GA2ox分別是催化赤霉素前體合成活性GAs和非活性GAs的關鍵限速酶, 在特定發育階段維持植物內源GAs活性水平, 保證植物生長發育過程的正常進行[23-24]。GA3ox基因家族編碼的氧化酶可以將GA9和GA20分別氧化為活性的GA4或GA1和GA3, 進而調節植物生長發育。有研究證明, 玉米矮化突變體gad39引起GA3ox蛋白功能不同程度的缺失, 導致活性赤霉素合成受阻, 進而造成植株矮化、分蘗增多,節間數減少, 雄穗、和節間長度降低等各種表型[25]。擬南芥TEM1通過直接調節GA3OX1和GA3OX2的表達, 整合光周期和GA依賴的開花途徑, 調控擬南芥成花誘導[26]。赤霉素GA2ox蛋白是一種與GA失活相關的氧化酶, 可以催化活性GAs并將其轉化為非活性產物, 是降低內源生物活性GA含量并導致植株半矮化和矮化的關鍵基因。其功能在一些植物中得到了驗證: 麻風樹異源表達JcGA2ox6導致擬南芥植株矮化、開花延遲, 在麻風樹中過量表達引起內源性生物活性GA4的減少導致典型的矮化表型[27]; 桃樹PpGA2ox基因家族通過微調桃的內源GA水平, 適當控制桃樹的旺盛生長[28]。本研究中,GmIPMDH在煙草中異源表達及在大豆中的過量表達均導致植株花期提前、株高提高、節數增加、節間伸長。并且,GmIPMDH過量表達大豆中GmGA3ox的表達量顯著提高, 而GmGA2oxs表達量顯著降低。這些基因的變化可能引起大豆內源活性GAs含量的提高, 從而導致大豆花期提前、株高提高、節數增加。下一步需要進一步驗證GmIPMDH參與GA調控大豆株高和成花誘導的分子機制。

4 結論

本研究對大豆異丙基蘋果酸脫氫酶GmIPMDH進行了表達分析和功能驗證, 通過異源表達煙草和過量表達大豆研究發現,GmIPMDH參與植物開花時間、株高和節數的調控, 轉錄組分析推測GmIPMDH可能是通過赤霉素合成通路參與赤霉素介導的植物開花誘導和株型調控。