基于網絡藥理學結合設計空間的金銀花-連翹藥對水提取工藝研究

崔婷,李美洲,甘力帆,林嘉明,梁麗金,黃醒鵬,張志鵬

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室,廣東 佛山 528244)

中藥藥對是經過歷代醫家反復實踐提煉,符合中醫藥對七情配伍理論,臨床發揮協同、抑制或新生功用,且已形成相對固定形式,經常配伍使用的兩味藥物[1]。金銀花、連翹配伍使用,代表性方劑為吳鞠通《溫病條辨》所載的銀翹散。金銀花味苦性微寒,入肺、心、胃經,具有清熱解毒、疏散風熱的功效;連翹味苦、微寒,入肺、心、小腸經,具有清熱解毒、疏散風熱的功效,二者相須為用,既可用于外感溫熱而解表,又可用于瀉里熱而解毒[2]?，F代藥理研究表明,金銀花-連翹藥對具有較好的抗病毒、抗菌及解熱抗炎作用,且按1∶1配伍使用,解熱作用最明顯[3-5]。網絡藥理學是一門新興的學科,是在系統生物學與計算機技術高速發展的背景下發展起來的,通過揭示中藥化合物的作用和治療機制來研究藥物、靶點和疾病之間的關系,闡明中藥對疾病的作用機制[6-7]。網絡藥理學的系統性質與中醫的整體觀念基本一致,為中藥藥效物質基礎及作用機制研究提供了一種新的思路,在一定程度上反映了中藥研究的趨勢[8]。

質量源于設計(Quality by design,QbD)是通過實驗設計來評價關鍵質量屬性(Critical quality attributes,CQAs)和關鍵工藝參數(Critical process parameters,CPPs)之間的關系模型[9]。QbD的理念運用于中藥制劑的生產,可找出對工藝參數產生影響的物料屬性和工藝參數,建立控制策略,為關鍵物料屬性和關鍵工藝參數建立可接受的范圍而不是固定值。徐冰等[10]提出中藥制劑生產工藝中建立設計空間的設想,認為設計空間法建立的設計空間可以使中藥生產工藝參數在一定范圍內波動,當藥品生產工藝參數在設計空間內時則無需申報,可提高藥品監管的靈活性,節約人力、物力及財力。本研究借助網絡藥理學并結合《中國藥典》2020年版及文獻報道對金銀花-連翹藥對活性成分進行篩選得到指標成分群,采用設計空間法優選金銀花-連翹藥對水提取工藝,以期為金銀花-連翹藥對的工業化生產提供理論指導與技術支持。

1 材料

1.1 儀器

Waters Arc型高效液相色譜儀(Waters公司);XP26型百萬分之一電子天平(Mettler Toledo公司);實驗室Milli-Q超純水系統(默克股份有限公司);JJ2000B百分之一電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠);ME203E千分之一電子天平(Mettler Toledo公司);ME204E萬分之一電子天平(Mettler Toledo公司);KQ-500DE數控超聲機清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試藥

金銀花(批號:YM2104006)購自山東中平藥業有限公司;連翹(批號:YC2106018)購自哈爾濱福順堂藥材有限公司,經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定,金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾,連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl的干燥果實,且為青翹。新綠原酸(批號:DSTDX001503,純度:99.58%)、隱綠原酸(批號:DST210427-035,純度:98.24%)對照品均購自成都德思特生物技術有限公司;綠原酸(批號:110753-202018,純度:96.1%)、咖啡酸(批號:110885-201703,純度:99.7%)、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?批號:111894-202104,純度:95.1%)、連翹苷(批號:110821-202117,純度:94.9%)、連翹酯苷A(批號:111810-201707,純度97.2%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇(分析純,西隴科學股份有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,默克股份有限公司);磷酸(色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司);水為超純水(實驗室Milli-Q超純水系統,默克股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 金銀花-連翹藥對網絡藥理學研究

2.1.1 金銀花-連翹藥對活性成分收集與篩選 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP),通過設定口服生物利用度(Oral bioavailability,OB≥30%)和類藥性(Drug-likeness,DL≥0.18)閾值來篩選金銀花、連翹的活性成分,同時為避免將金銀花、連翹潛在抗病毒的有效成分篩除,還參考金銀花、連翹在《中國藥典》(2020年版)中規定的質量標志物及文獻調研等,對有明確藥理活性的成分進行整理、分析,從而得到金銀花-連翹藥對主要活性成分集[11-14],成分合集見表1。

表1 金銀花-連翹藥對主要活性成分基本信息

2.1.2 活性化合物靶標蛋白、疾病基因靶點的篩選及韋恩圖構建 利用TCMSP數據庫中的靶點預測功能收集金銀花-連翹藥對活性成分的靶標蛋白,借助UniProt數據庫,導入蛋白名稱及設定物種為人,將檢索得到的蛋白靶標校正為UniProt ID并得到靶標蛋白對應的基因名。以“Respiratory tract infection(RTI,呼吸道感染)”為關鍵詞,分別在GengCards數據庫、OMIM數據庫進行搜索,合并除去重復值,得到RTI相關疾病靶點,根據“Relevance score”,以中位數法選取得到2 551個基因靶點。將上述疾病靶點與成分靶點取交集,構建韋恩圖,篩選二者共同靶點,則為藥對活性成分治療呼吸道感染的潛在靶點,韋恩圖結果見圖1。

圖1 金銀花-連翹藥對成分靶點與疾病靶點韋恩圖

2.1.3 靶點通路分析 將靶點導入DAVID數據庫進行基因本體(Gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05為篩選條件,得到GO條目555個,其中生物過程(BP)條目439個,細胞組成(CC)條目46個,分子功能(MF)條目70個,分別占79.1%、8.3%、12.6%。KEGG通路富集分析篩選得到144條信號通路,分別選P值最小的前20個富集結果進行可視化分析,見圖2～3。GO-BP分析篩選的前20條富集結果主要涉及基因表達的正向調控、凋亡過程的負向調控等;GO-CC分析篩選前20富集結果主要涉及細胞核、細胞質等;GO-MF分析篩選前20條富集結果主要涉及肽酶活性、蛋白同源二聚體活性、細胞因子活性等。KEGG分析篩選前20條富集結果涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路等,主要與病毒感染、炎癥反應、機體免疫等相關[15]。

圖2 金銀花-連翹藥對成分作用靶點GO功能分析

圖3 金銀花-連翹藥對成分作用靶點KEGG通路富集分析的20條通路氣泡圖

2.1.4 藥物-成分-靶通路相互作用網絡圖的構建 將得到的交集基因導入Cytoscape3.7.2軟件,設置“度值(Degree)、中介值(Betweenness)、緊密值(Closeness)”3個參數均大于中位數的點作為主要成分和核心靶點,構建藥物-成分-靶點-通路相互作用網絡圖。該藥物-成分-靶點-通路相互作用網絡共108個節點(包括1個藥物、31個活性成分、56個靶點、20條通路)和696條邊,見圖4。根據網絡拓撲參數分析可知,連接化合物或靶點較多的節點在整個網絡中起到樞紐作用,可能是關鍵的化合物或靶點,且存在一個成分連接多個靶點、多種成分作用到同一個靶點上、一個靶點與多個通路、多個靶點與一個通路相互作用等,這體現了中藥多成分與多靶點、多通路相互作用的整體性與聯系性[16]?；谏鲜鼍W絡拓撲分析活性成分度值排名初步篩選得到的關鍵化合物、結合文獻中有關抗菌抗病毒成分的報道及《中國藥典》2020年版一部中對金銀花、連翹藥材指標性成分規定和預實驗分析結果,最終確定酚酸類成分、連翹酯苷A、連翹苷為金銀花-連翹藥對提取工藝研究質量控制的活性成分群。

注:紅色圓點代表藥物;綠色八邊形代表成分;紫色菱形代表靶點;黃色三角形代表通路。

2.2 活性成分群含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0～5 min,10%A;5～10 min,10%～15%A;10～30 min,15%～18%A;30～40 min,18%～44%A;40～45 min,44%～10%A);流速:0.8 mL·min-1;檢測波長:280 nm;進樣量:10 μL;柱溫:40 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸對照品、綠原酸對照品、隱綠原酸對照品、咖啡酸對照品、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩釋φ掌愤m量,加甲醇制成每1 mL含新綠原酸76.776 2 μg、綠原酸826.940 5 μg、隱綠原酸123.727 8 μg、咖啡酸49.949 7 μg、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?56.059 1 μg的混合對照品溶液。另精密稱取連翹酯苷A、連翹苷對照品適量,分別加甲醇制成每1 mL含連翹酯苷A 1 058.584 8 μg、連翹苷228.424 3 μg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“1.2”項下連翹藥材適量,用裝有不同規格篩網的破碎機破碎,得不同規格的連翹飲片。按1∶1比例稱取金銀花、連翹飲片適量,加水煎煮2次,煎液用350目篩網濾過,冷卻,精密量取續濾液10 mL,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇10 mL,稱定質量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz) 30 min,取出,放冷,再稱定質量,用50%甲醇補足損失的質量,搖勻,用0.22 μm的微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。

2.2.4 專屬性考察 分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液和“2.2.3”項下供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件測定。結果表明,供試品溶液中各組分的色譜峰分離良好,且7個指標成分的色譜峰均能與對照品參照物峰的保留時間相對應,見圖5。

注:A.金銀花-連翹藥對供試品溶液特征圖譜;B～D.對照品特征圖譜;1.新綠原酸;2.綠原酸;3.隱綠原酸;4.咖啡酸;5.連翹酯苷A;6.4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?7.連翹苷

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液,用甲醇稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進行測定,以對照品溶液濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程,結果見表2。

表2 各成分線性關系考察

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次,記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?、連翹苷的峰面積,計算各峰面積RSD值分別為0.70%、0.43%、0.43%、1.10%、0.34%、0.59%、0.43%,表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件,分別在0、2、4、8、12、16、24 h進樣,記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?、連翹苷的峰面積,計算各峰面積RSD值分別為3.03%、2.77%、2.97%、4.51%、3.27%、2.97%、3.22%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取“2.2.3”項下供試品6份,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,并按“2.2.1”項下色譜條件進行測定,記錄新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?、連翹苷的峰面積,計算其含量并計算RSD值分別為0.35%、0.66%、0.78%、0.68%、1.07%、1.91%、0.55%,說明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 稱取已知含量的金銀花-連翹藥對干浸膏粉6份,每份約0.1 g,精密稱定,按供試品中指標成分量與加入對照品量之比1∶1原則,分別加入適量的對照品溶液,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,并按“2.2.1”項下色譜條件進行測定,測定供試品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?、連翹苷的含量,計算平均回收率分別為:101.15%、93.33%、92.16%、106.04%、99.16%、102.85%、101.60%,RSD值分別為1.34%、1.15%、0.95%、0.32%、0.91%、2.76%、1.47%,表明該方法回收率良好。

2.2.10 樣品測定及提取率計算 將“2.2.3”項下制備的供試品溶液按“2.2.1”項下色譜條件進行測定,并參照文獻的方法計算提取率[8]。提取率=各指標成分質量/總投藥量×100%。

2.3 出膏率測定

精密吸取金銀花-連翹藥對提取液25 mL,置于已恒定質量的蒸發皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定質量,計算出膏率。

出膏率=mV/25M×100%

m表示25 mL提取液的干浸膏質量,V表示提取液總體積,M表示提取藥材質量。

2.4 CQAs和CPPs的確定

2.4.1 CQAs的確定 結合金銀花、連翹單味藥及金銀花-連翹藥對臨床藥理活性的研究,將出膏率、酚酸類成分提取率(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩崽崛÷士偤?、連翹酯苷A提取率、連翹苷提取率作為金銀花-連翹藥對提取工藝的CQAs。

2.4.2 CPPs的篩選 采用魚骨圖對關鍵工藝參數進行初步篩選,見下圖6。根據前期實驗研究,可初步判飲片規格、提取時間、提取加水量為影響提取的關鍵因素。

圖6 金銀花-連翹藥對水提取工藝篩選魚骨圖

2.4.3 單因素試驗 取“1.2”項下兩味中藥飲片(1∶1)適量,固定提取時間,連翹規格為整個、破碎1.5 cm、破碎1.0 cm、破碎0.8 cm、破碎0.5 cm進行不同飲片規格單因素考察。固定加水量,提取時間分別為一煎20 min、二煎15 min,一煎30 min、二煎30 min,一煎60 min、二煎30 min,一煎60 min、二煎60 min,進行提取時間單因素考察,結果見表3～4。結果表明,隨著飲片規格的減小,出膏率先增加后基本不變,指標成分提取率先增加后降低;隨著提取時間的延長,出膏率、指標成分提取率增加緩慢。結合金銀花和連翹藥物性質、酚酸類成分的熱敏性質及生產實際情況,確定金銀花-連翹藥對提取工藝考察最小規格為0.8 cm,最長提取時間為一煎60 min、二煎30 min,并參考《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中有關加水量的說明,確定最大加水倍數為一煎加12倍量水,二煎加10倍量水。

表3 單因素提取規格考察

表4 單因素提取時間考察

2.4.4 CQAs和CPPs的確定 基于以上單因素試驗分析,以出膏率(Y1)、酚酸類成分提取率(Y2)、連翹酯苷A提取率(Y3)、連翹苷提取率(Y4)作為水提取工藝考察的CQAs,提取規格(X1)、提取時間(X2)、提取加水倍數(X3)作為水提取工藝考察的CPPs。

2.5 Box-Behnken試驗

2.5.1 Box-Behnken試驗設計 利用Design-Expert 11軟件進行三因素三水平的17次試驗,其中中心點重復5次,試驗設計見表5。

表5 Box-Behnken實驗工藝參數及水平設計與結果

2.5.2 模型的建立與評價 采用二階多項式模型對4個CQAs(Y1、Y2、Y3、Y4)及相應的CPP(X1、X2、X3)進行擬合,建立回歸方程如下:Y1=34.17-0.405 0X1+0.891 3X2+0.764 3X3+0.132 5X1X2+0.032 5X1X3+0.075 0X2X3-0.421 5X12-0.049 0X22-0.274 0X32;Y2=2.30+0.017 5X1+0.053 8X2+0.041 3X3+0.022 5X1X2-0.017 5X1X3+0.010 0X2X3+0.000 0X12-0.002 5X22+0.037 5X32;Y3=3.34-0.230 0X1-0.038 7X2+0.103 8X3+0.107 5X1X2+0.022 5X1X3-0.005 0X2X3-0.017 5X12-0.105 0X22+0.025 0X32;Y4=0.242 0-0.013 8X1+0.018 7X2+0.015 0X3+0.005 0X1X2+0.002 5X1X3+0.007 5X2X3-0.001 0X12+0.004 0X22-0.003 5X32。

二階多項式擬合方程相關系數R2分別為0.943 1、0.871 0、0.926 3、0.935 4,調整R2分別為0.869 9、0.705 0、0.831 6、0.852 4。方程的擬合相關系數R2均大于0.87,表明該模型能解釋大部分響應值的變化,調整相關系數R2均大于0.70,表明回歸模型擬合度較好,可以用該模型進行分析。

2.5.3 方差分析 采用Design-Expert 11軟件對試驗結果進行方差分析,方差分析結果見表6。

表6 回歸模型方差分析結果

由表6可以看出,出膏率、酚酸類成分提取率、連翹酯苷A提取率、連翹苷提取率二項式回歸模型方差均顯著(P<0.05),失擬項不顯著,表明所建模型有統計學意義,各因素與響應值之間可用此模型函數化。Y1、Y4項下X1、X2、X3的P值均小于0.05,表明該三個因素對Y1、Y4均具有顯著影響,Y2項下僅X2、X3的P值小于0.05,表明X1對Y2無影響,三個因素影響程度排序為X2>X3>X1,X1X2、X1X3、X2X3的P值均大于0.05,表明三個因素的交互作用對Y1、Y2、Y4的影響不顯著。Y3項下僅X1、X3的P值小于0.05,表明X2對Y3無影響,三個因素影響程度排序為X1>X3>X2,X1X3、X2X3的P值均大于0.05,表明因素的交互作用對Y3的影響不顯著,X1X2的P值為0.037 4,小于0.05,表明X1和X2的交互作用對Y3的影響較大。

2.5.4 響應面分析 用Design-Expert 11軟件對Y1、Y2、Y3、Y4進行響應面分析,等高線圖及響應面圖如圖7～10。由圖可以直觀看出,各因素對Y1、Y2、Y4的影響大小排序為X2>X3>X1,對Y3的影響大小排序為X1>X3>X2,與方差分析結果一致。在規定范圍內,水量越大,煎煮時間越短,出膏率和酚酸類成分提取率越高,這與固形物溶出率及酚酸類成分的不穩定性有關;連翹酯苷A存在于連翹中,易溶于水,水量越大,連翹規格越小,連翹酯苷A越易溶出,提取率則越高。

圖7 出膏率的等高線及響應面圖

圖8 酚酸類成分提取率的等高線及響應面圖

圖9 連翹酯苷A提取率的等高線及響應面圖

圖10 連翹苷提取率的等高線及響應面圖

運用Design-Expert 11軟件優化所得金銀花-連翹藥對最佳水提取工藝為:連翹規格為0.91 cm、提取加水量為一煎12倍量水、二煎10倍量水,煎煮時間為一煎58.92 min、二煎29.46 min,在此條件下,出膏率為35.53%、酚酸類成分提取率為2.43%、連翹酯苷A提取率為3.38%、連翹苷提取率為0.29%。根據響應面結果及實際生產情況,優化最佳水提取工藝為:連翹規格為1.0 cm,提取加水量為一煎12倍量水、二煎10倍量水,煎煮時間為一煎60 min、二煎30 min。

2.6 設計空間的建立

2.6.1 設計空間的建立 生產實踐表明,中藥制劑所含組分復雜,變異來源較多,實際生產中單一工藝操作模式具有一定的局限性,不能很好地保證產品質量的均一穩定,基于此,通過上述模型預測的最佳提取工藝,在設定的參數空間內尋找滿足實驗設計要求的最優化參數區域組合,確定工藝參數范圍,即構成設計空間[17],按此空間內的工藝參數進行生產,可滿足實際需要。前期研究表明,該批次金銀花-連翹藥對基準樣品出膏率為33.92%、酚酸類成分提取率為2.30%、連翹酯苷A提取率為3.32%、連翹苷提取率為0.24%,且金銀花-連翹藥對水提液經濃縮干燥后出膏率及各指標成分含量均有不同程度的損失,參考《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》《古代經典名方中藥復方制劑基準物質的申報資料要求(征求意見稿)》中有關制劑質量與基準物質質量的一致性要求,在下限70%的基礎上加上成分損失率,確定金銀花-連翹藥對出膏率大于33.92%、酚酸類成分提取率大于2.30%、連翹酯苷A提取率大于3.32%、連翹苷提取率大于0.24%,以此為條件搜索符合目標的子集,構建設計空間,見圖11(Overlay plot 1)。但模型預測值與真實值存在一定的偏差,所設空間的邊界具有不確定性,故在定義設計空間時加入置信水平α=0.05的置信區間,對設計空間進行優化,結果見圖11(Overlay plot 2),淺灰色部分即為加入置信區間后矯正的設計空間,在此空間內所有參數組合的預測值基本符合設定目標,深灰色部分為未加入置信水平的不可靠部分,即此空間內的預測值有5%概率不滿足工藝目標要求。

圖11 金銀花-連翹藥對水提取工藝設計空間

2.6.2 設計空間的驗證 根據圖11中的設計空間范圍,固定提取加水倍量為一煎12倍量水、二煎10倍量水,選取3個點進行設計空間的驗證,試驗點選取見表7,試驗結果見表8。

表7 設計空間驗證試驗點選取

表8 設計空間驗證結果(%)

由驗證試驗結果可知,YZ1中各項均符合要求,YZ2中Y2未達到預設要求,YZ3均未達到要求,表明由于95%置信區間的加入,設計空間邊界的不確定性得到了較好的印證,所得模型是可靠、可應用的。

3 討論

中藥藥對是連接單味中藥與經典復方的重要紐帶,目前多數單味中藥或方劑提取工藝研究多采用醇提且進行提取次數考察,與傳統湯劑水煎煮2次不符,本文在進行提取工藝研究時,按傳統湯劑煎煮模式,直接以水為溶媒煎煮2次,并參考《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》《古代經典名方中藥復方制劑基準物質的申報資料要求(征求意見稿)》中有關基準物質煎煮工藝的要求結合實際提取工藝制備情況,對飲片規格(連翹)、提取時間、提取加水量進行考察。同時采用網絡藥理學對金銀花、連翹的活性成分進行初步篩選,再結合《中國藥典》2020年版金銀花、連翹項下有關成分及相關文獻檢索,最終選取抗菌、抗病毒、抗氧化的酚酸類成分(包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、4、5-二-O-咖啡?？鼘幩?、苯乙醇類成分連翹酯苷A、木脂素類成分連翹苷作為有效化學成分指標,同時出膏率也是評價提取工藝的重要指標,因此選擇出膏率、酚酸類成分提取率、連翹酯苷A提取率、連翹苷提取率作為金銀花-連翹藥對提取工藝考察的評價指標。

本研究基于質量源于設計理念,通過Box-Behnken實驗設計研究金銀花-連翹藥對CPP與CQA的相關性,并建立金銀花-連翹藥對提取工藝的設計空間,結合實際工業化大生產,確定金銀花-連翹藥對水提取工藝參數操作空間為:連翹提取飲片規格0.8～1.2 cm,煎煮2次,一煎加12倍量水提取30～50 min,二煎加10倍量水提取25～30 min。經驗證,各項結果與預測結果基本一致,大生產中可采用設計空間在原料藥材質量發生波動或生產設備、生產條件變化的情況下達到工藝可調的目的,保證產品質量的穩定與一致性,做到安全有效、均一可控。通過設計空間的建立,可以加深對金銀花-連翹藥對提取工藝的全面理解,大大提升生產效率,保證產品質量。