環狀RNA
——腫瘤干細胞中的新角色

陳懿禹, 葉 婷

(西南醫科大學附屬醫院醫學檢驗部, 四川 瀘州 646000)

1 腫瘤干細胞定義及生物學特性

腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSC)是一類具有高度自我更新的不定向分化潛能等特征的細胞亞群[1],它主要來源于成體干細胞[2]、腫瘤細胞[3]、分化細胞[4]及細胞融合[5]。腫瘤干細胞假說提出腫瘤干細胞是腫瘤發生、耐藥和轉移等不良生物學行為的根源[6]。腫瘤干細胞的生物學特性包括:(1)自我更新能力。腫瘤干細胞利用干細胞獨特的細胞分裂方式,維持腫瘤干細胞未分化狀態[7]。此外,腫瘤干細胞處于靜止狀態及缺氧環境也會誘導其自我更新[8]。腫瘤干細胞高度自我更新潛能是導致腫瘤發生的直接誘因。(2)多向分化潛能。腫瘤干細胞利用不對稱分裂方式并在多種信號通路及轉錄因子調控下,產生不同分化程度及表型的子代細胞,以構成腫瘤主體、確定腫瘤組織學類型和維持腫瘤異質性[9, 10]。而腫瘤干細胞的分化過程并非單向和不可逆的,已分化的腫瘤細胞也能去分化或轉分化形成腫瘤干細胞,兩者之間相互轉換可驅使腫瘤惡性進展[11-13]。(3)致瘤性。利用免疫缺陷型實驗動物通過原位接種腫瘤干細胞構建腫瘤干細胞異種移植模型,通常以原位接種1 000個細胞/只動物作為經典操作[14]。同時,觀察一定時間內成瘤情況,包括:成瘤動物數量、腫瘤體積及重量,證實腫瘤干細胞具有更強的腫瘤形成能力[15, 16]。(4)治療抗性。當前,腫瘤治療方式多樣,包括手術、化學藥物治療、放射治療、靶向治療和免疫治療等,但治療抵抗所引起的復發是導致腫瘤死亡的主要原因[17]。目前,多種機制調控腫瘤干細胞治療抗性,例如:多重耐藥基因表達、DNA修復能力增強、抑制細胞凋亡、活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除劑及細胞代謝改變等方式參與腫瘤干細胞介導的治療抵抗[18]。(5)高轉移潛能。作為腫瘤干細胞的關鍵特征之一,腫瘤干細胞通過分化為轉移性起始細胞(metastasis-initiating cells,MICs)、與腫瘤干細胞微環境相互作用等[19]多種途徑獲得高轉移潛能,進一步賦予腫瘤啟動和維持的能力[20, 21]。

2 環狀RNA結構及生物學功能

CircRNAs(circular RNAs)是由3′和5′末端通過外顯子或內含子環化連接,形成共價閉合環狀非編碼RNA[22]。因其不含3′和5′端特殊結構,不易被核酸外切酶降解,其結構更穩定[23]。CircRNAs按其來源分為:外顯子circRNAs(exon-derived circRNAs,EcRNAs)[24]、內含子circRNAs(intron-derived circRNAs,CiRNAs)[25]和外顯子-內含子circRNAs(circRNAs containing both exons and introns,EIciRNAs)[26],絕大多數circRNAs屬于EcRNAs。

研究表明,circRNAs存在于不同物種間且具有一定進化保守性,大多真核生物中circRNAs具有組織、發育階段及亞細胞定位特異性,證實circRNAs屬于功能分子[27],通過發揮多種生物學功能參與不同生理及病理過程[23]。(1)CircRNAs充當微小RNA(microRNA,miRNA)海綿作為其經典功能之一。根據競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)假說提出,ceRNA通過miRNA應答原件(microRNA response elements,MREs),可競爭性結合miRNA影響其剪接和轉錄,進而影響mRNA穩定性及翻譯,間接調控miRNA靶基因表達,這種競爭性結合miRNA被稱為miRNA海綿作用[28]。雖然miRNA海綿作為circRNAs功能最為常見,但并非所有circRNAs具備miRNA海綿功能模型,因此,仍需進一步探究其他功能[29]。(2)CircRNAs與蛋白質相互作用,以circRNAs與RNA結合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)相互作用較為多見。RBPs作為一類廣泛與RNA相互作用的蛋白質,主要參與RNA轉錄后調控和組織發育等過程[29]。因此,circRNAs與RBPs相結合會進一步影響蛋白質活性及功能,調節circRNAs合成及降解,調控基因轉錄和抑制細胞周期等過程。此外,circRNAs與蛋白質相互作用還包括:利用circRNAs中保守的蛋白質結合序列與蛋白質相互結合調節親本基因轉錄,促進多種蛋白質的相互作用,以及改變蛋白質的亞細胞定位,形成蛋白質支架、多元復合物等方式參與機體發育、疾病等各階段[30]。(3)CircRNAs具有翻譯蛋白質的潛能[31]。近年來,circRNAs利用內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)和開放閱讀框(open reading frame,ORF)進行蛋白質翻譯的方式得到證實。同時,N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)甲基化驅動及滾輪擴增方式也能有效啟動circRNAs蛋白質翻譯。但目前circRNAs參與蛋白質翻譯的調控機制及延伸終止的過程仍不清楚[32]。

CircRNAs具有作為潛在腫瘤生物標志物、治療靶點等臨床價值[33],研究人員借助工具和方法分析circRNAs序列、亞細胞定位、生物學功能、對腫瘤的影響及治療潛力,推動circRNAs檢測臨床應用[34]。因此,本文總結了當前circRNAs在腫瘤領域相關檢測技術應用、優勢及局限性(見Table 1)。

Table 1 Applications, advantages and limitations of circRNA detection technologies

RNA印跡雜交(Northern blot)作為RNA分析技術之一,雖可檢測circRNAs大小及表達豐度,但靈敏度低、且耗時費力,并不適用于高通量篩選。實時熒光定量逆轉錄PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)也能檢測circRNAs表達豐度及篩選特異性基因,且在一定程度兼顧靈敏度、特異性、速度和成本,使其更適用于臨床常規操作[35]。雖然該技術已實現檢測及篩選circRNAs,但核糖核酸外切酶R(ribonuclease R,RNase R)可能對含3′末端二級結構的線性RNA消化不足[36]。同時,在逆轉錄過程中,由于鏈置換和滾環復制效應,單個circRNA分子可以產生多個重復的cDNA模板,均可導致circRNAs表達分析錯誤[37]。因此,一定程度限制RT-qPCR用于高通量分析。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技術,可用于circRNAs半定量分析及亞細胞定位。但該檢測技術中其FISH 探針設計僅限于反剪接點,以避免識別線性 RNA。因此,若使用多個FISH探針,可能存在線性RNA干擾[38]。同時,微陣列技術(microarray)通過分析雜交信號強度篩選特異性circRNAs。但僅針對已知探針,不能分析未知變異[39]。隨著高通量circRNAs測序技術(Circ-seq)的建立,該方法能高效識別并分析circRNAs表達豐度、保守性及功能等,但目前成本較高,不利于常規開展[40]。此外,為進一步提高circRNAs檢測靈敏度及速度,還可利用環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、滾環擴增技術(rolling circle amplification,RCA)及微滴式數字PCR(droplet digital PCR,dd-PCR)等新型技術用于檢測circRNAs。由于成本較高、引物設計和特殊儀器等問題,導致目前應用較少[41]。

3 環狀RNA在腫瘤干細胞中的研究

CircRNAs屬于功能性RNA,已成為惡性腫瘤的關鍵調節因子,并在腫瘤干細胞中作為重要介質,發揮不同的生物學功能,調節CSCs自我更新、增殖、分化和轉移等不同表型。

3.1 環狀RNA參與腫瘤干細胞的自我更新

CircRNAs在不同腫瘤類型中發揮促癌或抑癌雙重作用,調控其下游轉錄因子活性、激活相關信號通路,參與腫瘤干細胞自我更新(見Fig.1)。

Fig.1 circRNAs regulate self-renewal of cancer stem cells (A) CircRNAs act directly or as miRNA sponges to regulate self-renewal of cancer stem cells; (B) Interaction between circRNAs and proteins regulates self-renewal of cancer stem cells; (C) CircRNAs regulate self-renewal of cancer stem cells through protein translation. (D) Regulation of self-renewal of cancer stem cells by novel and different sources of circRNAs. CircRNA: circular RNA; RBP: RNA-binding proteins; mRNA: messenger RNA; miRNA: microRNA; GLI1: GLI family zinc finger 1; CCAR1: cell-division cycle and apoptosis regulator protein 1; FMRP: fragile X mental retardation protein. Circ-MALAT1: circular RNA- MALAT1; PAX5: paired box 5; circGprc5a: circular RNA Gprc5a. Gprc5a: G protein coupled receptor family C group 5-member A. rt-cisE2F: read-through circRNA stabilizing E2F6/E2F3 mRNAs; IGF2BP2: insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 2. E2F6: E2F family of transcription factor 6; E2F3: E2F family of transcription factor 3. mcPGK1: mitochondrial circRNA for translocating phosphoglycerate kinase 1; α-KG: α-ketoglutarate; circ-670: hsa-circRNA-000670

3.1.1 環狀RNA促進腫瘤干細胞自我更新 CircRNAs異常表達能有效促進CSCs自我更新,進而利于CSCs所介導的腫瘤耐藥、轉移和復發等過程。在腫瘤干細胞中,circRNAs作為直接調節因子轉錄激活下游轉錄因子介導腫瘤干細胞自我更新。在結直腸癌中cis-HOX與HOXC10 mRNA結合抑制其衰變,從而促進結直腸癌腫瘤干細胞自我更新[42]。Jia等人[43]證實,circFAT1介導信號轉導器和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcript,STAT3)激活并上調干性相關轉錄因子性別決定區Y-box2(sex-determining region Y-box2,SOX2)、克魯珀爾樣因子4(krüppel-like factor 4,KLF4)表達,誘導頭頸部鱗狀細胞癌CSCs成球能力。

CircRNAs還通過與miRNA、mRNA、蛋白質相互作用等方式,在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平調節多種基因,參與腫瘤干細胞自我更新。Hsa_circ_0003222海綿化吸附miR-527促進非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)腫瘤干細胞干性[44]。結合生物信息學方法可篩選特異性circRNAs,circRNA_103809在膀胱CSCs中的表達顯著高于膀胱癌非腫瘤干細胞,并海綿化吸附miR-511促進膀胱CSCs自我更新[45]。Chen等人[46]利用生物信息學預測miR-145-5p作為circPTN下游靶標及干性的負調控因子,證實circPTN海綿化miR-145-5p促進膠質瘤干細胞(glioma stem cells,GSCs)自我更新。另外,circRNAs、miRNAs、mRNAs所構成的ceRNA調控網絡參與調控腫瘤干細胞自我更新。利用全基因組測序篩選結直腸癌CSCs中636個特異性circRNAs,結合生物信息學分析篩選2個主要circRNAs:hsa_circ_0066631和hsa_circ_0082096,且證實其通過ceRNA網絡調控腫瘤干細胞干性[47]。同時,多種腫瘤類型中也存在該調控軸,例如:乳腺癌CSCs中存在circNOLC1/miR-365a-3p/STAT3[48]及circ_002178/miR-1258/KDM7A,促進乳腺癌CSCs自我更新[49]。肝母細胞瘤[50]及骨肉瘤[51]中分別存在circRNA CDR1as/miR-7-5p/KLF4、circPIP5K1A/miR-515-5p/YAP1促進腫瘤干細胞自我更新。腫瘤中p53作為抑癌基因參與腫瘤各階段,在EBV相關胃癌(EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC)中發現ebv-circLMP 2A/miR-3908/TRIM59/p53軸,通過抑制p53誘導其腫瘤干細胞自我更新[52]。缺氧環境會導致基因組失衡,抑制細胞凋亡,維持細胞處于未分化狀態[53]。在缺氧狀態下,circHIF1A充當miR-580-5p海綿靶向CD44,促進乳腺癌CSCs自我更新[54]。

CircRNAs與蛋白質相互作用激活下游靶基因或信號通路并驅動腫瘤干細胞自我更新。Chen 等人[55]證實,circRNA激活肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同系物F(musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog F,MAFF),即circRNA activating MAFF(cia-MAF)在肝癌CSCs中顯著上調,可與TIP60復合物相互作用形成分子支架,募集至MAFF啟動子,促進MAFF表達,驅動肝癌腫瘤干細胞自我更新。核重塑因子復合物(nucleosome remodeling factor,NURF)作為啟動染色質重塑的必要部分,在結腸癌中,circCTIC1會將NURF募集至c-Myc啟動子,驅動c-Myc轉錄促進腫瘤干細胞自我更新[56]。此前,已證實多種信號通路參與調控各種生命過程,而信號通路的異常激活是誘發干細胞惡變及腫瘤發生的潛在機制之一[57]。Hedgehog信號通路與正常組織修復及上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關,有利于維持干細胞自我更新,該信號通路異常激活與惡性腫瘤啟動、轉移和耐藥密切相關[58]。肝癌中發現circIPO11與拓撲異構酶I(topoisomerase I,TOP1)相互作用,并將其募集至膠質瘤相關癌基因同系物1(glioma-associated oncogene homologue 1,GLI1)啟動子以觸發其轉錄,激活Hedgehog信號通路驅動肝癌腫瘤干細胞自我更新[59]。

CircRNAs具備蛋白質翻譯潛能,參與特定蛋白質翻譯調控腫瘤干細胞自我更新。Chen等人[60]提出circRNAs制動機制,即形成circRNA-ribosome(核糖體)-mRNA復合物參與mRNA翻譯。Circ-MALAT1通過circRNAs制動機制延緩腫瘤抑制因子配對盒轉錄因子5(paired Box,PAX5)翻譯,促進肝癌CSCs自我更新。另外,有證據表明,circRNAs具有肽編碼潛力,hsa_circ_02838(circGprc5a)在膀胱癌CSCs中高表達,且通過其肽結構結合Gprc5a,形成circGprc5-peptide(肽)-Gprc5a軸驅動膀胱癌CSCs自我更新[61]。

CircRNAs因特殊的結構賦予其獨特的功能,而不同結構及來源的circRNAs也在腫瘤干細胞中發揮著重要作用。當前,Chen等人[62]在肝癌中鑒定出一種通讀circRNAs(read-through circRNAs,rt-circRNAs)[63],rt-cisE2F(read-through circRNA stabilizing E2F6/E2F3 mRNAs)是由10號染色體上的CYP2C18及CYP2C19的外顯子環化形成。隨后證實,在肝癌腫瘤起始細胞(tumor initiating cells,TICs)中,rt-cisE2F通過轉換E2F6/E2F3與m6A閱讀器胰島素樣生長因子2信使RNA結合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 2,IGF2BP2)、YT521-B 同源域家族成員2(YT521-B homology domain-containing family protein 2,YTHDF2)的相互作用調控肝癌TICs自我更新。其中,IGF2BP2作為m6A結合蛋白質,被證實其具有促進mRNA穩定性的作用[64],而YTHDF2作為m6A修飾閱讀蛋白質,則加快mRNA降解[65]。在肝癌TICs中,rt-cisE2F通過促進E2F6/E2F3與IGF2BP2相互作用并抑制其與YTHDF2的結合,提高E2F6/E2F3 mRNA穩定性,進一步上調Wnt/β-catenin信號通路的下游基因軸抑制蛋白2(axis inhibition protein 2,AXIN2)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1,CCND1)、c-Myc,證實在肝癌TICs中,rt-cisE2F/IGF2BP2-E2F6/E2F3/Wnt/β-catenin軸促進其自我更新。近來,一種新型由線粒體DNA編碼的circRNAs——mcPGK1(mitochondrial circRNA for translocating phosphoglycerate kinase 1),證實在肝癌TICs中表達增強,并通過抑制線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)和促進糖酵解來調節代謝重編程,進一步改變了α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)和乳酸的細胞內水平。由于乳酸能促進β-聯蛋白(β-catenin)穩定性,α-KG則抑制β-聯蛋白啟動子的活化、及其轉錄,即在肝癌TICs中mcPGK1通過調節代謝重編程促進Wnt/β-catenin活化和肝內TICs自我更新[66]。外泌體(exosome)由細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中的膜性囊泡,存在于幾乎所有類型的細胞中。其結構是一種直徑為30～100 nm的脂質包裹體,內部含有蛋白質、mRNA和miRNA等物質[67]。近年來,外泌體來源的非編碼RNA被證實參與腫瘤的發生及惡性進展,具有評估腫瘤進展和預后的潛在價值[68, 69]。Liang 等人[70]在胃癌CSCs中發現煙草/煙霧會促進其外泌體分泌,其中外泌體來源的hsa-circRNA-000670(circ670)在胃癌CSCs中表達升高,并增強胃癌CSCs的成球能力及干性基因表達發揮促進其自我更新的功能。

3.1.2 環狀RNA抑制腫瘤干細胞自我更新 CircRNAs可參與阻斷重要信號通路和/或抑制干性相關轉錄因子活性,破壞腫瘤干細胞干性維持。肝癌作為全球常見惡性腫瘤之一,其中肝細胞癌作為原發性肝癌最常見的病理類型,每年導致約830 000人死亡[71]。Zhu 等人[72]利用RNA免疫共沉淀測序及生物信息學分析circZKSCAN1表達水平與多種肝細胞癌特征相關。生存分析結果顯示,circZKSCAN1 表達水平與總生存期和無復發生存期呈正相關。進一步證實,circZKSCAN1充當RNA結合蛋白(RNA binding protein,RBP)海綿,與脆性X染色體智力遲鈍蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)靶基因細胞周期和凋亡調節因子1(cell cycle and apoptosis regulator 1,CCAR1)競爭,促使Wnt/β-catenin信號通路失活,抑制肝細胞癌腫瘤干細胞成球能力。此外,circZKSCAN1在體內誘導腫瘤靜止,表明其在精準靶向治療方面的潛力。在乳腺癌CSCs中,circRNAs作為干細胞抑制劑并充當miRNA海綿。Yan等人[73]通過生物信息學分析證實,circRNA VRK1可以抑制乳腺CSCs自我更新能力,是治療腫瘤的良好靶點。

以上研究結果表明,circRNAs異常表達與腫瘤干細胞自我更新密切相關。但目前circRNAs發揮抑癌作用的相關研究較少,后續研究還需致力于尋找抑癌性circRNAs,進一步探討其在腫瘤基因治療中的潛在價值。

3.2 環狀RNA調控腫瘤干細胞的增殖與分化

腫瘤干細胞增殖、分化是維持腫瘤異質性的關鍵因素,目前已證明,多種信號通路及轉錄因子參與調控CSCs增殖和分化[74]。原癌基因c-Myc作為轉錄因子,參與細胞的生長、增殖和凋亡[75]。在膀胱癌[76]及腎母細胞瘤[77]中,分別存在hsa_circ_0068307/miR-147及circPHACTR4/ miR-34b-5p軸調控c-Myc表達,參與腫瘤干細胞增殖。同源框(homeobox,HOX)基因構成的轉錄因子家族,在細胞增殖和腫瘤發生中具有重要的調節作用[78]。CircCHAF1A海綿化吸附miR-211-5上調轉錄因子HOXC8表達,促進GSCs增殖[79]。CircATP5B充當miR-185-5p海綿上調同源框轉錄因子B5(homeobox B5,HOXB5)表達。并進一步轉錄調節白細胞介素-6(interleukin- 6,IL6)表達,激活JAK2/STAT3信號傳導促進GSCs增殖[80]。此外,根據circRNAs與mRNAs相互作用功能模型,circ-CCDC66通過HGF/c-Met信號通路有效促進腎癌干細胞增殖能力[81]。

迄今為止,腫瘤干細胞分化的潛在機制受到廣泛研究,包括轉錄因子、信號通路和表觀遺傳修飾等調控方式。CircRNAs作為新型非編碼RNA,對于腫瘤干細胞分化具有調節作用。Zeste2增強子(enhancer of Zeste2 polycomb repressive complex 2 subunit,EZH2)作為一種原癌基因,有利于維持干細胞多能性[82]。Circ-TRPS1在前列腺癌中發揮致癌作用,并形成circ-TRPS1/miR-124-3p/EZH2軸促進腫瘤干細胞分化[83]。羅雯等人[84]在肺癌CSCs中發現,circMYO1C通過促進SOX2、OCT4、Nanog表達,抑制肺癌CSCs分化。已證實端粒酶能有效促進細胞分裂,誘導細胞惡性轉化。Jiang等人[85]證實,circMEG3抑制核糖核糖蛋白H/ACA端粒合成酶組成物(component of telomere synthetase H/ACA ribonucleoprotein,Cbf5)轉錄活性,從而抑制端粒酶復合物活性,達到抑制肝癌CSCs分化的目的。

上述內容表明,circRNAs通過改變增殖/分化相關轉錄因子、端粒酶活性等調控腫瘤干細胞增殖和分化,促進腫瘤惡性轉化(見Fig.2)。但其中是否存在其他因素,例如細胞周期調控和細胞代謝等值得進一步探討。

Fig.2 circRNAs regulating the proliferation and differentiation of cancer stem cells CircRNA: circular RNA; CSCs: cancer stem cells; c-Myc: oncogene MYC; HOXC8: homeobox gene C8; HGF/c-Met: hepatocyte growth factor/cellular-mesenchymal epithelial transition factor; HOXB5: homeobox gene B5. EZH2: enhancer of Zeste2 polycomb repressive complex 2 subunit; circ-TRPS1: circular RNA-TRPS1; circRNA MYO1C: circular RNA MYO1C; Nanog: homeobox-containing transcription factor; SOX2: sex-determining region Y-box2; OCT4: octamer-binding transcription factor 4; CircMEG3: circular RNA MEG3; Cbf5: the component of telomere synthetase H/ACA ribonucleoprotein

3.3 環狀RNA參與調控腫瘤干細胞侵襲與轉移

腫瘤干細胞相較于腫瘤細胞而言,表現出更強的侵襲、轉移潛能。即腫瘤干細胞所介導的轉移性腫瘤,表現出更強的致瘤性及治療抗性[86]。研究證實,circRNA ARF1(cARF1)能有效促進人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cells,hBMECs)侵襲及血管生成,在腫瘤干細胞中作為miR-342-3p海綿抑制其表達,從而上調胰島素基因增強蛋白2(insulin gene enhancer protein,ISL-2)促進膠質瘤血管生成[87]。此外,Lin等人[88]利用人類端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)特異性啟動子VP16-GAL4-土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element,WPRE)集成的系統,放大復合物過表達circRGPD6(TV-circRGPD6),證實TV-circRGPD6/miR-26b/YAF2軸可抑制乳腺癌腫瘤干細胞介導的轉移,為難治性癌癥提供新的治療選擇。

以上研究結果表明,circRNAs通過利用其特殊結構及miRNA海綿等方式參與腫瘤干細胞的侵襲、轉移,可將circRNAs作為評估腫瘤轉移和預后不良的潛在標志物。同時,針對circRNAs的獨特結構聯合其他新型治療技術,增強腫瘤治療效果,為臨床應用提供理論依據。

4 問題與展望

近年來,新型分子檢測技術及生物信息學的高速發展,推動circRNAs在腫瘤干細胞研究領域深入并取得一定成果。已證實失調的circRNAs與腫瘤干細胞生物學特性密切相關,但仍有問題亟待解決。目前,circRNAs在腫瘤干細胞中的研究主要集中于細胞內水平,但對于腫瘤干細胞分裂方式、耐藥性、休眠性腫瘤干細胞等生物學特性的研究仍有待完善。此外,腫瘤干細胞脂類代謝、免疫逃逸等方式作為調控腫瘤干細胞生物學特性、介導腫瘤耐藥的重要機制[89, 90],探究circRNAs在上述過程中的功能,有利于尋求新型治療靶點及積極有效的腫瘤治療策略。CircRNAs作為研究新熱點,仍需不斷完善基礎性研究內容,例如:構建高質量circRNAs數據庫和開發高精度快速檢測方法等。在臨床檢驗診斷方面,由于其閉合環狀結構,具有更高的穩定性,認為其具有成為腫瘤干細胞或腫瘤診斷生物標志物的可能。當前,circRNAs的大量研究仍停留于基礎研究階段,同時存在circRNAs特異性、檢測方法自身局限性及檢測標準化等問題,限制其臨床應用。后續研究應致力于改良circRNAs檢測方法和提高檢測靈敏度。同時,通過篩選新型及特異性circRNAs,與傳統生物標志物聯合檢測以提升診斷效能,并通過多中心、大樣本的臨床研究驗證其臨床價值。