基于干細胞與生物3D打印技術的皮膚組織工程研究與應用進展

李 玲, 丁 文, 劉 明

(1)黑龍江省黑河市疾病預防控制中心 檢驗科, 黑龍江 黑河 164300;2)浙江工業大學 材料科學與工程學院,材料成形與控制工程研究所, 杭州 310014;3)浙江省腫瘤醫院 中國科學院杭州醫學研究所, 細胞治療技術研究與工程實驗室, 杭州 310022)

皮膚作為具有大表面人體最外層的器官,大約占人體重的15%,其平鋪開的面積約1.7 m2[1,2]。近年來,與皮膚相關的炎癥、衰老和糖尿病傷口愈合等問題是臨床和研究中的難題[3]。迄今為止,最常用的治療皮膚缺損的方法是自體皮膚移植。然而,供體部位的缺乏、繼發性損傷和感染風險限制了自體皮膚移植的應用。與傳統的治療方法相比,組織工程皮膚(tissue engineering skin , TES)為治療皮膚缺陷提供了一種新的方法[4,5]。Naik團隊首次發現當人體有病原菌入侵時,誘發的炎癥會使上皮干細胞中負責損傷和修復的AIM2基因,從而當病原體再次入侵相同部位時,帶有“記憶”的上皮干細胞會快速分泌損傷與修復蛋白,召集大量的免疫細胞和上皮干細胞快速消滅病原菌。他們證明了皮膚中上皮干細胞會對炎癥反應產生記憶,這種皮膚“記憶”能力將可能改變我們對多種自身免疫疾病和癌癥的認識[6]。Yu團隊報道基于可穿戴交聯聚合物(wearable crosslinked polymer layer,XPL)凝膠系統人工皮膚可以模擬正常的皮膚性質,XPL可以局部應用,在皮膚界面快速固化,XPL的發現可能為皮膚功能屏障受損、藥物傳送和損傷修復方面提供先進的解決方案[7]。目前的研究在皮膚炎癥、衰老和皮膚修復上取得一定的進步,但在創建功能性齊全的皮膚上仍然存在局限。

皮膚是人體內非常復雜器官,主要由3層結構組成包括表皮、真皮和皮下組織,表皮主要由角質形成細胞和黑素細胞組成,物理屏障、免疫防御和感受器的作用;真皮主要由成纖維細胞、膠原纖維、血管、神經、毛囊和汗腺組成,為皮膚提供氧氣和營養物質,調節體溫促進傷口愈合,支持和保護的作用;皮下組織作為皮膚的最內層,主要由成纖維細胞、脂肪細胞和巨噬細胞組成,避免寒冷和劇烈的創傷,儲存能量促進傷口的修復[8,9]。為了構建用于藥物篩選、化妝品測試和可以移植的仿生皮膚模型,皮膚結構的復雜性需要更加可控的成型技術來實現。如:3D生物打印。

生物打印工程技術提供了一個完全自動化和先進的平臺,可以利用計算機輔助設計通過一層一層的打印工藝,實現活細胞、生物材料和生長因子的沉積,具有高度的靈活性和可重復性[10,11]。3D生物打印技術有助于高度自動化地構建復雜的組織構建物,可以同時沉積多種細胞類型和生物材料,以增強與天然皮膚結構的相似性。目前主要的生物打印包括微滴噴墨式生物打印[12]、擠出式生物打印[13]、激光式生物打印[14]立體光刻式生物打印技術[15],并且對于皮膚的打印也已經實現了便攜式生物打印機的構建[9]。三維生物打印在TES制備方面具有一些優勢,包括:(1)根據創面的形狀和深度,計算機掃描成像技術可以快速打印出與傷口匹配的植皮,具有及時性、高通量重復性高的特點。(2)有多種生物墨水的可用性。它們可以靈活、準確地沉積不同的生物制劑(包括活細胞、核酸、生長因子、預明膠化溶液等),構建組織結構,其形態和生理學表現出相似的正常皮膚。(3)利用逐層沉積的原理,可以在傷口表面原位打印皮膚組織。(4)具有互聯的孔隙和一定的表面積,支持細胞附著、生長、細胞間通信以及氣體和營養物質的交換,在過去的十年中,3D生物打印技術已被用于各個領域的生物組織的制造,如血管系統、心、骨骼、軟骨、皮膚和肝[1,4,14]。

細胞來源是生物打印的重要組成成分。大規模的工業化細胞培養是生物打印應用的必要條件,使用干細胞可能提供潛在的解決方案來克服細胞數量的局限性[7,10]。自2006年日本科學家山中伸彌團隊將4個轉錄因子的組合轉入到皮膚纖維母細胞中得誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)后,多能干細胞的增殖和分化方向得到廣泛重視[16]。近年來,有多研究致力于iPSCs分化來的角質細胞和成纖維細胞以及其他皮膚相關細胞,減少了移植后產生的排斥反應[17]。另外,脂肪來源的間充質干細胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)和毛囊干細胞(hair follicle stem cells,HFSC)分化來的汗腺和毛囊附屬器等也備受關注,而3D生物打印的MSCs被證實具有更好的細胞增殖和表達生物因子的能力,種子細胞的來源解決了皮膚組織工程對于細胞數量的需求[7,18]。干細胞技術方面的突破使我們能夠建立更可靠、更復雜的生理或病理體外皮膚模型。

Yu等人以3D生物打印技術為基礎,詳細的介紹了體外輸送各種類型的干細胞及其抗生素促進傷口愈合等進展[19]。Ishack等人介紹了3D生物打印的基本原理,3D生物打印皮膚的應用[13]。目前,國內外更多的研究集中在干細胞、3D生物打印和皮膚結構構建上,但從皮膚的應用需求到下游應用的綜述卻少。本文綜述介紹4種3D生物打印技術,并與來源于干細胞的皮膚細胞最新進展進行詳細的介紹,重點討論了不同的3D生物打印工藝構建皮膚的特點和皮膚種子細胞的來源,并剖析了皮膚構建物的下游應用需求,為本領域在體外生理或病理模型構建、藥物篩選、再生醫學和臨床等研究提供參考。

1 皮膚的應用需求

皮膚是人體內非常復雜的組織,通過執行關鍵功能來確保生存,如保護、體溫調節、排泄、吸收、代謝功能、感覺、蒸發管理和美學。開展皮膚相關問題的研究及應用對于高仿生皮膚構建有著廣泛的需求。

1.1 化妝品及藥物篩選需求:化妝品、疫苗、膏藥、皮膚病藥物

根據ISO 10993《醫療器械生物相容性標準》,皮膚刺激是生物風險評估中必須考慮的3個毒理學實驗之一[20]。Akagi等利用逐層細胞包被技術構建人表皮模型進行刺激物驗證,并從化學物品中分離出了有效的藥物或化妝品成分。皮膚表皮層的建立已經取得了大的進展,但是化妝品及藥物篩選的需求對于仿生的皮膚構建物要求越來越嚴格[21]。隨著科技的不斷進步,細胞和分子生物學方法被引入到現代毒理學研究,新的檢測方法亦隨之出現。如體外培養的永生化細胞、組織器官再生、計算機預測毒性等新的體外檢測方法替代傳統的動物實驗檢測方法。近年來,歐洲聯盟完全禁止對化妝品進行動物試驗,這就需要開發試驗應用的替代模型[22]。不同的跨國公司和3D打印公司之間正在不斷的增加研發合作,凸顯了對于3D生物打印應用于工程化皮膚構造方面的重視。

1.2 皮膚移植:糖尿病、燒傷、皮膚病(大皰性表皮松懈癥、牛皮蘚)

因靜脈淤滯、糖尿病或其他疾病引起的皮膚潰瘍等疾病正在日益增加,因此人們對于皮膚修復的需求越來越多。Jackw團隊通過基因編輯(CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)介導的同源定向修復技術(homology directed repair,HDR)來靶向來源于大皰性表皮松懈癥患者成纖維細胞誘導的iPSC,矯正了突變基因COL7A1,從基因修復后的iPSCs分化為成纖維細胞和角質形成細胞,且在皮膚創傷的治療過程中不會產生免疫排斥。這項重要研究將會給皮膚潰爛的大皰性表皮松懈癥患者帶去福音[23,24]?；蚓庉嫷某霈F改變了一些遺傳性疾病帶來的困擾,但仍存在基因突變風險評估。隨著科技的進步,在患者來源細胞和動物模型中基因編輯療法為其在遺傳性皮膚病的臨床應用提供了進一步的可能[25]。3D打印技術不僅可以形成仿生的皮膚構建物,并且可以擺脫基因突變和新傷口炎癥等困擾,為皮膚移植和臨床應用打下良好的基礎。

1.3 仿生層次的需求:色素、毛囊、神經、汗腺

皮膚構建包含多種功能結構,除了表皮和真皮外,皮膚還有其他附屬結構包括毛囊、神經汗腺等,它們對于皮膚功能發揮非常重要的作用,通過執行關鍵功能來確保生存,如保護、體溫調節、排泄、吸收、代謝、感覺、蒸發管理和美學等[22,26]。目前,傳統的皮膚構建物已經為燒傷或慢性創傷患者提供了有益替代物,但現有的生物工程構建物在色素沉著、毛囊和汗腺再生等功能結構重建方面仍遠遠不夠理想[7,9,27]。生物打印方法有助于高度自動化地構建復雜的皮膚構建物,其在生物學、材料學和計算機設計領域的潛力將有望使全功能皮膚結構得以實現。

2 3D生物打印技術

生物打印技術是從3D打印技術發展而來的,目前主要包括噴墨式生物打印、擠出式生物打印、激光輔助式生物打印和立體光刻式生物打印。3D生物打印技術有潛力直接創建梯度宏觀結構,以更好地模擬自然細胞外基質,從而同時增加多種類型細胞的附著和增殖,為高仿生皮膚的制備提供了可能。

2.1 噴墨式生物打印皮膚

由于噴墨式生物打印技術簡單、靈活、多功能性并能良好控制沉積模式,使其在皮膚組織構建中得到廣泛的應用。Ng等利用噴墨式生物打印來源不同供體的角質形成細胞、黑色素細胞和纖維母細胞,所形成的表皮區域厚度從51.6±3.4 μm(第1周)增加到143.5±6.7 μm(4周),并且在氣液相界面(air-liquid interface , ALI)培養2周,表皮區域的細胞形態顯示了角質細胞分化的早期跡象,這對黑素體吸收至關重要。通過上述打印方式,他們成功的構建了色素沉著的皮膚構建物,且表現出與人類皮膚類似的色素沉著,并與傳統手工鑄造的含有色素皮膚構建體相比發現,存在明顯的表皮層和一層連續的基底膜蛋白[27]。3D生物打印技術的發展促進了三維體外皮膚著色技術的發展。Kim團隊開發了一種混合3D細胞打印系統,可以同時使用噴墨式生物打印和擠出式生物打印構建含有真皮的皮膚模型。首先,通過使用擠出式打印系統將聚己內酯材料構建成一個網狀基層,然后利用噴墨式打印系統均勻的分配含有角質形成細胞的膠原材料。所構建的組織模型在ALI條件下培養14天,通過HE染色切片發現成纖維細胞被拉伸,并且與在天然真皮細胞拉伸情況相似,這一現象也表明角化細胞在第14天分化。層狀表皮厚度(97±3 μm)也保持在75 ～ 150 μm的正常范圍內?；旌舷到y構建的皮膚模型顯示了良好的生物學特性,如穩定存在的纖維生長因子以及成熟的表皮層[28,29]。同時使用基于噴墨式和擠出式系統或者其他分配模塊,為構建仿生的生理或病理模型奠定了良好基礎。

2.2 擠出式生物打印皮膚

擠出式生物打印是生物打印方法中較簡單的一種。價格低廉、打印速度快擴充性強,對細胞的損傷較低,是進行皮膚構建較好的打印方式[30]。Huang團隊使用明膠和海藻酸鈉對真皮組織進行了3D生物打印,他們創建了附有小鼠上皮祖細胞的真皮,并且發現負載細胞的真皮結構至少可以保持3周。在培養7天后,發現細胞良好的附著在生物材料上,表現出明顯的活力。在體外,將小鼠足底真皮和表皮生長因子同步加入細胞外基質模擬物中,為表皮祖細胞創造了良好的微環境,維持細胞活力,促進細胞擴散和基質形成,實現了特異性細胞分化。在體內,直接將生物打印細胞外基質移植到小鼠燒傷的爪子中,恢復了汗腺的功能[31]。Albanna帶領團隊開發了可移動的皮膚生物打印系統,促進了自體或異體成纖維細胞和角質形成細胞直接進入損傷區域,形成表皮和真皮的分層結構。在6周的時間內對小鼠傷口面積進行評估,發現與未接受皮膚打印的小鼠相比,傷口愈合速度更快。將負載自體成纖維細胞和角質形成細胞的水凝膠載體孵育在豬的切除性傷口,促進了傷口快速閉合、增加收縮并加速了再上皮化大規模的發展[32]。應用擠出式3D打印技術構造的皮膚構建物在形態和功能上與人體皮膚組織相似,為再生醫學移植探索了新的方法[32]。

2.3 激光輔助式生物打印皮膚

激光輔助生物打印能夠將活細胞按照預設計的模式排列,實現功能性皮膚構建物的體外制造[33]。Koch等利用激光輔助生物打印實現成纖維細胞、角質形成細胞和人源間充質干細胞(human mesenchymal stem cell,hMSC )的有序排列,實現真皮組織打印。打印后幾天皮膚細胞和間充質干細胞的存活率分別為98%±1%和90%±10%,保持其增殖能力。此外,皮膚細胞和hMSC顯示出細胞凋亡或DNA斷裂的增加,且細胞表型不變[34,35]。此發現可能會制造出更仿生的皮膚替代物改善糖尿病或燒傷病人的損傷。Koch等還利用激光輔助生物打印將成纖維細胞、角質形成細胞和膠原蛋白材料,構造打印形成仿真的表皮皮膚模型,細胞之間處于分層狀態且不易發生混合。打印后10 d,細胞定位和增殖分析發現在成纖維細胞與角質形成細胞之間形成了層黏連蛋白[36]?？梢?激光式生物打印技術為產生具有完整血管網絡的組織提供了巨大的潛力,激光輔助生物打印技術甚至可能實現打印完整器官的長期目標。

2.4 立體光刻式生物打印皮膚

立體光刻式生物打印進行皮膚組織打印的研究少,更多應用于打印微針陣列,用于胰島素經皮給藥[37]。Economidou等利用立體光刻打印光聚合樹脂連續聚合形成微針,通過噴墨打印在針的表面形成了薄層胰島素和糖醇或二糖載體。打印工藝的優化使得3D打印微針的透皮能力優于金屬陣列,最小的作用力變化范圍在2～5 N。并且與皮下注射相比,胰島素包被3D打印陣列顯示出顯著的穩態降糖效果,促進了血中胰島素濃度的迅速增加,血漿中葡萄糖水平迅速下降。胰島素作用快,低血糖控制良好,在60 min內血糖水平降低,且穩定血糖超過4 h[38]。立體光刻打印技術精準打印的結構微針被視為皮下注射針優良的微創替代物,它可以穿過皮膚角質層但不會對表皮下區的神經末梢造成干擾,因此不會引起疼痛。Yadav等利用微立體光刻打印技術,構建了平均長度、寬度和厚度分別為13.05±0.11 mm、13.07±0.15 mm和3.50±0.05 mm微針陣列,實現了利福平的透皮遞送,在移除微針陣列后穿透痕跡在45內完全消失[39]。微立體光刻生物醫學應用是一個有吸引力的制造技術,尤其是對微米尺寸制造,是一種潛在的治療皮膚癌的方法。4種生物3D打印方式在再生組織醫學的研究具有前景(見Fig.1)。

Fig.1 Summary of four 3D bioprinting approaches. (A) Principle of inkjet bioprinting. (B) Principle of extrusion-based bioprinting. (C) Principle of laser-assisted bioprinting. (D) Principle of stereolithography bioprinting

2.5 便攜式3D打印機

隨著3D打印技術的發展,手持式皮膚打印機的出現使傷口部位的皮膚組織原位修復成為可能。Hakimi等人的杰出工作代表了便攜式3D生物打印機的發展(重量< 0.8 kg),在體外,他們發現包埋在纖維蛋白基質中的人真皮成纖維細胞培養10天后的存活率為90%。在體內,使用微流控打印機對皮膚組織進行了原位生物打印。研究表明,在直徑8 mm的小鼠切除傷口上原位形成了生物聚合物纖維陣列,同時沉積在彎曲和柔順的傷口表面上。沉積的條紋片狀或條紋陣列牢固地附著在傷口上,并周期性地跟隨呼吸周期或人工組織變形。皮膚的原位形成是使用生物墨水中的特異性皮膚細胞直接治療的結果[5,40]。這種便攜式3D打印機在目前的醫療保健市場是革命性的創新,因為病人不必等待實驗室培養的細胞再進行皮膚移植。另外,該技術也用于燒傷或外傷等緊急情況,并在救護車上進行實時治療。一般來說,傷口敷料根據其在傷口愈合中的作用分為被動敷料和主動敷料。理想的創傷敷料不僅要保護創面不受微生物感染,允許氣體交換,吸收多余的滲出物,還要保持濕潤的環境,促進上皮的再生。近年來,電紡納米纖維聚合物已顯示出作為傷口愈合敷料的巨大潛力[5,9]。Dong等首次提出一種抗菌且生物相容的誘導型聚集排放物(aggregation-induced emission,AIE)的納米纖維敷料,通過人臍帶靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)和小鼠胚胎成纖維細胞在納米纖維敷料上粘附牢固并且復制能力增強。同時他們利用手持式靜電紡絲裝置完成了AIE納米纖維敷料的原位沉積,電紡后在對其基本性能如表面形貌、結構、熱穩定性和疏水性進行表征發現AIE納米纖維敷料對沙門氏菌具有高效的抗菌活性,在皮膚傷口模型的體內研究中,沉積的AIE納米纖維敷料能夠消除多藥耐藥細菌感染并促進傷口愈合[41]。這種個性化納米纖維敷料經濟、耐用可以無痛去除,還能防止細菌滲透。電紡個性化敷料是一個理想的和安全的解決方案,滿足傷口治療的臨床需要。

3 皮膚種子細胞的來源

為了構建仿生的皮膚模型,細胞的選擇是非常重要的環節,皮膚干細胞是三維皮膚模型和皮膚再生的首選細胞來源,其以自我更新和多向分化能力,易于收集和免疫原性弱的特點,在皮膚重建中得到了廣泛應用。

3.1 間充質干細胞

間充質干細胞如骨髓來源的MSCs(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)和脂肪來源的干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, Ad-MSCs)已被廣泛研究用于燒傷的創面修復和瘢痕緩解。多項研究表明,MSCs通過分泌獨特的細胞因子和生長因子促進血管生成和加速傷口愈合,通過抑制肌成纖維細胞活動和減少膠原沉積,進而減少增生性瘢痕[42,43]。Bian團隊利用高糖誘導創建了人類真皮衰老模型,并發現來源于子宮蛻膜的間充質干細胞(decidua-derived mesenchymal stem cells, dMSC)形成的小細胞囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)不僅能顯著促進人類真皮成纖維的增殖、遷移和分化,還能改善其衰老狀態。此外,體內發現dMSC-sEVs局部應用加速膠原沉積,促進糖尿病小鼠創面愈合[44]。同年,Yao等利用擠出式生物打印創建了汗腺(sweat gland,SG)樣基質,介導間充質干細胞轉化為功能性的汗腺,并促進了小鼠SG的恢復[45]。Ge團隊從miR-132基因過表達的脂肪干細胞(miR-132-overexpressing adipose stem cells,miR-132-exo)中獲取工程外泌體,在體外,證實了其對HUVECs的增值和遷移的促進作用,在體內,基于核因子KB蛋白信號通路介導的miR-132-exo可以有效減輕炎癥反應,顯著提高皮瓣存活率,促進糖尿病創傷的愈合?？梢?間充質干細胞已經成為一種有潛力的治療皮膚損傷的的來源種子[46]。間充質干細胞經三維打印基質包封后,可提供一個仿生的微環境,促使細胞分化為組織所需的細胞,使其具備再生醫學的重要應用價值。

3.2 毛囊干細胞

新毛囊是由位于毛囊突起區的毛囊干細胞及其繼發胚芽中的子代驅動再生的,組織依靠干細胞來維持自身平衡和修復傷口[47]。Gur-Cohen等發現在適當的刺激下靜息態的毛囊干細胞可以被激活,驅動生長期開始,并開始一個新的毛發周期。在皮膚中,淋巴毛細血管作為關鍵的干細胞生態成分可以在干細胞周圍形成密集網絡[48]。并有研究表明Wnt信號通路對毛囊干細胞的維持、激活和分化具有重要作用,其失調將導致毛囊干細胞失去干性或不能被正常激活。Xu等通過在裸鼠傷口原位生物打印表皮干細胞(epidermal stem cells,Epi-SCs)和皮膚多能干細胞(skin-derived precursors,SKPs)促進了毛囊的再生過程,4周,成功觀察到表皮、真皮、血管和皮脂腺的形成。此外,研究發現打印后的表皮干細胞和皮膚多能干細胞依然分別表達高水平的CD49f基因和BMP6基因,證實了原位打印細胞依舊保持高的細胞活力和增殖能力[49]。Abaci團隊通過使用3D打印再現毛囊微環境,演示了在人類皮膚構建物中生成人類毛囊的仿生方法。另外,Lef-1基因在真皮乳頭細胞(dermal papilla cells,DPCs)中的過表達顯著提高了人類皮膚構建物中毛囊分化的效率。此外,在移植前對有毛的皮膚構建物進行血管化,使免疫缺陷小鼠的毛發有效生長[50]。從培養的人類細胞中再生整個毛囊的能力將對不同類型的脫發和慢性傷口的醫療管理產生革命性的影響,這迎合了現階段皮膚損傷修復領域迫切的醫療需求。

3.3 多能干細胞(iPSCs)

iPSCs的研究是再生醫學的重大突破,特異性iPSC的建立為在培養系統中模擬生理和病理模型創造了機會,并有可能迅速促進藥物的發現。iPSCs是一類具有自我更新和分化功能的細胞,在皮膚細胞的分化中得到廣泛的應用[51]。Abaci團隊利用iPSC來源的內皮細胞在3D打印技術下構建了灌注的血管網絡,并證實帶血管化的人體皮膚移植物可以形成強健的表皮和建立內皮屏障,從而允許藥物的局部和全身遞送的再現[52]。同樣,iPSC不僅可以分化為內皮細胞,還可以分化出皮膚附屬器其他細胞包括黑色素細胞[53]、神經細胞和施萬細胞[54]。為了建立一個受神經支配的組織工程皮膚模型,Muller等利用iPSCs分化成感覺神經元和施萬細胞構建了工程皮膚組織,施萬細胞是神經元功能和軸突遷移的主要細胞,當受到誘導神經肽刺激時,來自iPSCs的神經元釋放P物質和降鈣素基因相關的肽。這種獨特的人體神經細胞模型對于皮膚神經炎癥的研究非常有用[54]。同時,臍帶血單個核細胞(cord blood mononuclear cells,CBMCs)已成為再生醫學的潛在細胞來源。Kim等利用CBMCs-iPSCs分化而成的角化形成細胞和成纖維細胞發育成表皮層和真皮層。將表皮層疊加于真皮層上,形成復雜的三維皮膚類器官,該類器官移植入皮膚受損的小鼠模型中,改善了皮膚損傷[55]。iPSCs是很有吸引力的候選細胞,因為它們除了在倫理上被接受外,還可以分化成任何所需要的細胞。在重編程過程中,它們是根據患者的基因定制的,干細胞技術的發展可能有助于為皮膚打印提供合適的細胞源替代品,根據種子細胞的來源及其病理性作用見Table 1。

Table 1 Stem cell types and differentiated skin cell types and roles

4 3D生物打印與相關的下游應用

生物3D打印能夠很大程度重建天然皮膚的宏觀結構和微觀特征,保障了高仿生皮膚制備的可能性,為化妝品及藥物應用、皮膚移植和仿生層次等下游應用提供了條件。

4.1 化妝品及藥物應用

Episkin?是法國歐萊雅旗下子公司Episkin體外重建的表皮模型,是用人膠原I型蛋白 和膠原III 型蛋白做底部基質支架,然后在其上涂一層膠原IV型蛋白,干燥后形成IV膠原的薄膜,將人正常角質細胞接種到覆有IV型膠原的支架上,經過13的氣液相培養形成一種類似人表皮的具有分層結構的體外重建表皮模型[56]。EpiSkin?模型不僅可以作為表皮替代物,還在化妝品領域內可用于透皮吸收分析、皮膚腐蝕性驗證、皮膚刺激性分析、光毒性分析UV暴露及保護分析[56,57]。SkinEthic?模型同樣可進行形態學的分析,培養基中細胞因子,炎癥因子等水平檢測及基因方面的分析,相較于 Episkin?模型其優勢在于使用化學限定培養基培養,與血清培養基相比,培養基中各組成成分及濃度都是確定的,有利于表達通路中某些特定上調或下調的因子。作為表皮替代物,在化妝品領域內可用于透皮吸收分析、皮膚刺激性分析、皮膚致敏性分析、光毒性分析、UV暴露及保護分析美白/美黑作用分析[57,58]。此外,Strat-M?模型也是一種模擬人體皮膚多層結構的合成膜替代品,在體外滲透中,其優異的多孔結構和疏水性再現了皮膚的擴散屏障機制,在不含滲透增強劑的制劑中,間苯二酚的穩態通量對于水溶液為42±5 μg/cm2h,水凝膠為42±6 μg/cm2h,以及水包油乳液為40±6 μg/cm2h,這更接近于離體皮膚(5±3、9±2、13±6 μg/cm2h)的滲透指標。Strat-M?模型作為一種可靠的人類皮膚替代品在化妝品研發過程用作快速篩選潛在親水活性分子的高效益工具[59]。

4.2 皮膚移植應用

含有異體細胞的多層皮膚替代物已被用于治療非愈合性皮膚潰瘍。Xie等利用3D生物打印制作了植入的多層血管化皮膚移植物。該移植物使用的生物墨水含有人包皮纖維細胞、臍帶血人內皮細胞和人類胎盤周細胞,并將這些細胞懸浮在鼠尾I型膠原上來形成一層真皮。第二層生物墨水含有人類包皮角質細胞來形成表皮。當這些3D打印的移植物被移植到免疫缺陷小鼠的背側時,人的內皮細胞與小鼠創面上的微血管相融合,并促進了表皮網的形成,促進了傷口的修復和愈合[60,61]。Dai等利用人成纖維細胞、內皮祖細胞和明膠建立了皮膚真皮層結構,利用聚氨酯和角質形成細胞作為生物墨水,形成皮膚表皮結構。當植入體內時,雙層皮膚構建物在裸鼠模型中,28天后達到90%的傷口愈合率,并且有76%的表皮層出現上皮化[62]。在使用基質蛋白或異種來源的成分生產出的皮膚替代品中,較高的過敏反應免疫排斥風險一直是皮膚移植領域中的難點。Baltazar 團隊利用生物打印的皮膚替代品成功實現了人內皮細胞、成纖維細胞、周細胞和角質形成細胞的無異源分離、擴增和冷凍保存。含有人膠原蛋白質和纖連蛋白質的無異源生物墨水經過分層在接種到人角質形成細胞以形成表皮層。這一雙層皮膚移植物的制造,為皮膚組織工程的無異種移植提供了可行性[63]。在皮膚移植領域,皮膚的軟組織和分層結構使其較其它生物材料的沉積更為容易,3D打印技術能夠為患者提供更加定制化和生物相容性的移植皮膚。通過構建與患者本身相匹配的組織,移植的成功率和效果得以顯著提升。這對于燒傷患者、先天性皮膚病患者以及其他需要皮膚移植的患者來說是一項重大的醫學進步。

4.3 皮膚附屬器的應用

3D生物打印含有色素、毛囊、神經和汗腺的皮膚模型,為藥物開發、化妝品測試、生理或病理模型和皮膚移植開創新的策略。色素沉著皮膚模型可以通過3D打印黑素細胞來實現。Min等利用3D打印技術成功構建了含有色素沉著的皮膚模型。利用包括成纖維細胞的膠原水凝膠構建真皮層,將黑素細胞和角質形成細胞打印到真皮層的頂端進行培養誘導色素沉著,在表皮層和真皮連接處觀察到雀斑樣的色素形成[64]。利用3D打印技術結合干細胞培養,實現人工皮膚更加真實的外觀。生發研究員、頭發修復外科醫生以及制藥和化妝品行業對3D技術的應用將對含有毛囊的人體皮膚組織維護和再生產生重大影響[49];Motter Catarino團隊在含有成纖維細胞的預凝膠真皮層中印刷DPCs和HUVECs誘導的球狀體,并結合角質形成細胞和黑素細胞的遷移條件,成功在成熟組織中發育毛囊樣結構,其形態和組成與天然皮膚組織基本一致,作為毛發的移植模型用來測試化妝品的安全性,這對再生醫學的研究無疑會產生巨大的推動性[65]。針對含有神經細胞特定疾病皮膚模型,并分析這些模型在瞬時受體電位陽離子通道A1激動劑刺激下,神經肽釋放后感覺神經的潛在影響。這種模型特別適合于銀屑病的建模,以探明由皮膚神經支配調節的疾病發生機制,且這種免疫功能皮膚模型具有很強的個性化藥物治療潛力[54];擠出式生物打印技術已被應用在構建來自iPSCs的皮質神經元和神經膠質前體產生的神經構建體,經過進一步分化,表達了神經元和膠質細胞標志物,這為 3D生物打印構建更為復雜的人類神經系統奠定了堅實基礎[66]。此外,胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)是SG再生的種子細胞,鑒于細胞外基質中的真皮成分和生長因子對于上皮胚胎干細胞命運發揮著重要作用,將ESCs和表皮生長因子同時加入到明膠和海藻酸鈉的混合物中制成生物墨水,打印并構建體外生態模型培養14 h后成功觀察到SG細胞,依靠生物材料支架為細胞分化提供結構空間和附著位點,能夠準確誘導細胞定向分化以實現SG細胞的增殖[45,67]。這對于基于干細胞的3D打印在臨床應用和治療中是有價值的。

5 問題與展望

3D生物打印具有高分辨率、操作靈活、可重復打印高通量輸出等優點。然而,所有的技術,包括3D生物打印,都受到一定的限制和挑戰。首先,3D皮膚模型代表了一種全層結構,缺乏免疫細胞、血管分布、神經和汗腺。盡管3D生物打印皮膚有部分臨床成功的,但患者和臨床醫生越來越多的要求解決現有的局限性,如改善表面感覺和再生[1]。在3D打印皮膚誘導的新組織形成過程中,神經再生依賴于新形成的血管。由于缺乏血液供應,神經再生幾乎被完全抑制[1,61]。其次,在生物墨水中仍存在一些關鍵的技術問題需要解決:(1)人體皮膚具有獨特的物理力學特性,這對于與皮膚組織特征相對應的生物材料要求很高。(2)所選的打印材料必須與3D打印材料相兼容,由于這些材料在打印后的收縮或強度下降,它們不能滿足3D生物打印的使用要求。(3)三維生物打印水凝膠的機械強度不足,壓縮后的結構穩定性保持困難。因此,確定一種優越的凝膠方法,在不影響細胞活力的情況下快速穩定的預凝膠溶液是很重要的[68]。另外,3D生物打印需要在打印階段進行優化,[8]。最后,種子細胞也是三維生物打印技術中需要考慮的一個重要方面。干細胞作為組織工程種子細胞的重要來源,已經引起了廣泛的關注。近年的研究表明,干細胞可以在促進皮膚附屬物再生、傷口愈合和組織重建方面發揮重要作用。干細胞在TES領域具有巨大的潛力,但倫理問題、成本和技術要求阻礙了干細胞的充分利用[68,69]。

三維生物打印技術在組織修復和再生領域的應用仍是可行的。施旺細胞作為皮膚感覺神經再生的關鍵細胞成分,在體外可以添加到3D打印支架中,是3D打印皮膚感覺神經再生的良好方法。在未來,可以考慮在TGS中加入施旺細胞,以促進神經纖維的定向生長,增殖和聚集形成類似于“神經導管”的管狀結構,促進神經再生[1]。另外,3D生物打印的研究現狀表明,一種理想的生物墨水仍有待確定。在未來,生物墨水的材料組成可以進一步優化,如通過引入納米材料,以提高組織或器官的再生。此外,隨著皮膚老化模型,細胞衰老的概念仍在研究中,對于再現與年齡相關的皮膚模型至關重要。這兩個領域都相對較新,在獲得最優模型之前需要進一步的研究。到目前為止,該領域的研究表明,3D生物打印將允許精確地放置所有各種類型的天然皮膚細胞,并精確地并可重復地制造結構來替代受傷皮膚。然而,復制天然皮膚的結構完整性和功能,以允許傷口修復、溫度控制和感覺有待實現。隨著相關技術的進步和多學科合作的探索,三維生物打印有望克服這些障礙,在生物工程和皮膚仿生學中發揮重要作用。