沙蠶蛋白酶高效降解變異新冠病毒S蛋白作用與S蛋白的生化特性分析

闞慕潔, 白若倫, 劉智奇, 白 宇, 王少華, 劉劍凱, 洪 敏*

(1)吉林大學基礎醫學院 生物化學教研室, 長春 130021;2)河北建材職業技術學院醫院,河北 秦皇島 066006;3)沈陽科奇醫藥技術開發有限公司, 沈陽 110000;4)吉林大學第一醫院,病毒和艾滋病研究室, 長春 130021)

世界衛生組織(WHO)報告,至2023年9月,SARS-CoV-2簡稱新冠病毒-2(以下簡稱S-C-2)感染7億余人,其中死亡人數接近7百萬,是全世界過去3年最嚴重傳染病。最早出現的病毒稱為野生型(wild,以下稱W-S-C-2),其后出現大量的突變株。WHO曾確定Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron為關切變異毒株(VOC),Lambda、Mu等為關注變異毒株(VOI)。野生型和Delta毒株曾造成大量感染和死亡。當前關切的毒株皆為Omicron的變異毒株,包括本研究中的BA.2、BF.7和XBB.1。

W-S-C-2是單股正鏈RNA病毒,長度為29 903個核苷酸,編碼4種結構蛋白質,分別是刺突糖蛋白質(Spike glycoprotein,簡稱S,由1 273個氨基酸組成,pI為6.24);胞膜蛋白質(E);膜蛋白質(M);核衣殼蛋白(N)。S、E、M為病毒表面結構蛋白質,N為病毒內覆蓋RNA基因組表面蛋白質[1-2]。

S蛋白是病毒感染宿主細胞主要致病因子,是抗體藥物和疫苗的靶點[3];宿主細胞水解激活S蛋白的酶,則是一些小分子抑制劑藥物的靶點。如抑制弗林酶(Furin)的M-1851、抑制跨膜絲氨酸蛋白酶-2(TMPRSS2 ,T-2)的M1-432,抑制組織蛋白酶L(cathepsin L, C-L)的E64d等[3-4]。但是由于病毒經常發生變異,S蛋白結構改變,可導致生物學等性質改變,如S蛋白密度、穩定性、可裂解性、S1蛋白脫離難易和膜融合性等變化[5-6],進一步引起抗體逃逸、免疫失效和致病性等變化[7-9]。因此,詳細解析S蛋白的生物化學特性,可能更深刻認識新冠病毒的結構特性,也可能為抗新冠病毒研究,提供新的認知和途徑。我們曾詳細分析了野生型、5種VOC、2種VOI變異株S蛋白質的生物化學特征,其中堿性增強是突出變化,其次是不能被沙蠶堿性絲氨酸蛋白酶(alkaline serine protease fromNeanthesjaponica,ASPNJ,pI 4.4)裂解的突變賴氨酸(K)和精氨酸(R)增加。研究證實,ASPNJ可以高效地、相對特異性地降解野生型S蛋白質(W-S)[10]。但是目前流行的omicron變異株S蛋白的生物化學特性是什么,是否能被ASPNJ降解,ASPNJ是否能影響假病毒感染受體細胞,尚無資料可查。本文將提供這3個問題的初步研究結果。

1 材料與方法

1.1 材料

W-S-C-2、BA.2、BF.7、XBB.1的S蛋白購自上?；菡\生物公司、北京義翹神州生物公司或為上述公司的贈品。ASPNJ與其多克隆抗體是沈陽科奇生物技術有限公司產品。野生型假病毒(pseudovirus wild)系北京義翹生物技術公司產品。EV71腸道病毒和VP1抗體(腸道病毒結構蛋白抗體),是吉林大學第一醫院病毒實驗室實驗品。

1.2 軟件和數據庫

https://www.uniprot.org/、https://web.expasy.org/compute_pi/、https://web.expasy.org/peptide_cutter/、https://outbreak.info/、Cov-Lineages,用來查閱變異病毒序列、預測和分析S蛋白及相關片段的等電點(pI)、可被ASPNJ裂解和不可裂解的肽鍵位點等數據。BA.2突變序列,見2022-07-22 outbreak.info,BF.7和XBB.1突變序列來自義翹產品介紹。

1.3 沙蠶堿性絲氨酸蛋白酶降解S蛋白反應

各株病毒S蛋白依據樣品說明書稀釋溶解、ASPNJ溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。反應總體積為20 μL,其中含10 μg S蛋白,不同含量的ASPNJ(1、0.2、0.04、0.008、0.0016 μg),對照ASPNJ為30～100 μg。S蛋白質濃度為0.5 mg/mL,5個反應管中ASPNJ濃度,分別為50 μg/mL、10 μg/mL、2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.08 μg/mL。對照ASPNJ濃度為1.5～5 mg/mL。反應37 ℃ 1 h,反應終止后加入5 μL上樣緩沖液,100 ℃變性2 min,常規不連續12% SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍R25染色。

1.4 沙蠶堿性絲氨酸蛋白酶對假病毒感染受體細胞分析

參考抗體中和實驗程序,由試劑公司協助完成。實驗在96孔培養板上進行,每孔依次加入50 μL假病毒、生理鹽水稀釋的不同濃度ASPNJ10 μL,37 ℃度孵育1 h,加入抗ASPNJ多克隆抗體40 μL(40 μg),37 ℃度孵育1 h,加入過表達ACE2的293T-ACE2細胞150 μL,再孵育72 h。孵育結束時拍照片,檢測熒光素酶(luciferase)發光值(RLU),抑制率=1-(樣本RLU-陰性對照RLU)/(陽性對照RLU-陰性對照RLU)。ASPNJ影響病毒感染細胞的對照實驗,在96孔板上進行,程序同上。對照病毒是腸道RNA病毒EV71,感染人胚胎惡性橫紋肌瘤(human rhabdomyosarcoma, RD)細胞,觀察細胞致病變效應(CPE)、蛋白質印跡實驗(WB)檢測病毒結構蛋白質(VP1)的表達情況。

為了直觀了解實驗中4種病毒S蛋白質的異同和討論研究結果,根據文獻將其結構展示在Fig.1中。

Fig.1 Diagram of the primary structure of the S protein of wild type and BA.2, BF.7, XBB.1 SARS-COV-2 From left to right (from the N to the C terminal) of the proteins are the signal peptide, S1 protein, S2 proteins, respectively. The protein length is indicated by aa number. The C terminal sequence(-RRAR)of the S1 protein is a motif CendR, which can recognize, bind and activate the neuropil receptors(NRP1 and NRP2). In the middle of the S1 protein is the RBD segment. There are two fusion peptides in the S2 protein. The K or R and number in bracket are the number of lysine or arginine residues in that protein fragment

2 結果

2.1 野生型與BA.2、BF.7和XBB.1的S蛋白生物化學特性分析

3種新冠病毒S蛋白中突變氨基酸的位置和序列如下,左起第1個中括號內是S1中的突變氨基酸,其中,下劃線是RBD中突變的氨基酸,第2個中括號內是S2中突變的氨基酸。T478K、Q498R、N440K是突變后產生的不能被ASPNJ裂解的K或R殘基,其余K和R均是可以被裂解的殘基。

BA.2:【T19I、L24S、del25/27、G142D、V213G、ins214(EPE)、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H】、【N764K、D796Y、Q954H、N969K】

BF.7:【T19I、del24-26、A27S、del69-70、G142D、V213G、G339D、R346T、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、L452R、S477N、T478K、E484A、F486V、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H】、【N764K、D796Y、F817P、A892P、A899P、A942P、Q954H、N969K、K986P、V987P】

XBB.1 S:【T19I、del24-26、A27S、V83A、G142D、del145Y、H146Q、Q183E、V213E、G252V、G339H、R346T、L368I、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、 N440K、V445P、G446S、N460K、S477N、T478K、E484A、F486S、F490S、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H】、【N764K、D796Y、F817P、A892P、A899P 、A942P、Q954H、N969K、K986P、V987P】

本文用軟件分析了W-S、BA.2、BF.7和XBB.1的S、S1、S2、RBD、CendR、FP蛋白質或肽的aa長度、pI、K和R的數量、可被ASPNJ裂解的K和R位點和數量、不能被ASPNJ裂解的K和R位點和數量,匯總在Table 1中。與W-S比較,變化明顯的參數是,突變型S的pI升高,尤其是S1和RBD;K和R在S中比例增加;不能被ASPNJ裂解的K和R略有增多。上述變化主要發生在S1中,S2變化不大。其余參數總體變化不大或相同,見Table 1。

2.2 野生型和部分變異株S蛋白的furin酶位點多肽及TMPRSS2酶位點多肽氨基酸序列比對分析

ASPNJ降解不同肽段中K和R,對病毒進入細胞途徑影響不同。本文分析了Furin酶裂解位點多肽和TMPRSS2酶裂解點多肽,其序列見Table 2。

序列比對顯示,這2個酶水解位點附近的氨基酸均是較保守的。Furin酶裂解S產生S1-CendR,此模序與NRP1和NRP2受體結合,通過膜融合,病毒感染受體細胞;TMPRSS2裂解815R,暴露FP,融合ACE2,病毒進入細胞。這2個區域的高度保守性,說明病毒雖然變異,但其感染途徑是相同的。

Table 1 Comparison of biochemical characteristic and degradation prediction of wild type and 3 omicron mutant S proteins by ASPNJ

2.3 沙蠶堿性絲氨酸蛋白酶高效降解野生型和omicron突變型新冠病毒S蛋白

結果顯示,ASPNJ可以高效降解S蛋白質:A4(8 ng)可以使10 μg 野生型S蛋白徹底降解(質量比1∶1 250);對BA.2、XBB、BF.7雖然未完全徹底降解,但是全部的BA.2-S和大部分的XBB-S及BF.7-S蛋白被降解,失去完整結構,裂解成大小不一的片段。再者,BA.2-S蛋白對其更敏感,A5(1.6 ng)可使其全部失去完整結構(質量比1∶6 250)。ASPNJ濃度越高,降解作用越強,直至徹底降解(見Fig.2)。

Fig.2 Degradation of wild type and omicron variant SARS-CoV-2 S proteins by ASPNJ (A) Degradation of W-S, (B) Degradation of BA.2-S; (C) Degradation of BF.7-S; (D) Degradation of XBB.1- S. The quantity of S was 10 μg/lane. M: molecular marker, unit: kD. The wild type S was labeled as S, BA.2 as B2, BF.7 as B7, XBB.1 as X1, respectively. AC was the control ASPNJ, the quantity was 30-100 μg, A1 was 1 μg/lane, A2 was 0.2 μg/lane, A3 was 0.04 μg/lane, A4 was 8ng/lane, A5 was 1.6 ng/lane, respectively

2.4 初步結果顯示假野生新冠病毒被ASPNJ處理后,其感染293T-ACE2細胞的作用有降低趨勢

各個孔中ASPNJ濃度(質量/mL)與抑制率關系如下,51.2 pg/mL(0.64%)、256 pg/mL(36.02%)、1.28 ng(39.29%)、6.4 ng/mL(40.02%)、32 ng/ mL(58.9%)。結果顯示,假野生病毒受ASPNJ影響,其感染受體細胞的作用,有降低趨勢。

對照實驗證明,ASPNJ在上述濃度以及更高的濃度4 μg/mL,不能抑制腸道病毒EV-A71(enterovirus A71)的感染與復制,加入ASPNJ后并不能使人橫紋肌肉瘤RD細胞(human rhabdomyosarcoma)的致細胞病變效應CPE(cytopathic effect)減少;同時病毒的結構蛋白VP1的表達未見明顯減少,細胞的形態學未見發生明顯改變。

3 討論

突變型S主要生化改變及ASPNJ的高效降解作用。與野生型比較,3種突變型S蛋白的堿性明顯增高,尤其是S1和RBD結構域;K和R在S蛋白質中占比量增多;不能被降解的K和R少量增加;這是主要的生化改變(見Table 1)。鹽鍵和極性鍵是RBD與ACE2結合的主要化學鍵[11],野生型RBD為223 aa,pI是8.91;宿主ACE2為805 aa,pI是5.36,而3個突變株的RBD的pI均超過9以上,這些變化可能增強變異毒株與ACE2的結合。ASPNJ降解S蛋白實驗結果顯示,ASPNJ依然能高效降解突變株-S,其強度比降解W-S稍低,其原因可能與突變株-S中增加了幾個不能被降解的R和K有關。SARS-CoV2的S蛋白是三聚體結構,未結合ACE2前,部分三聚體呈現1-2個RBD豎立表面的開放式構象。RBD逐步結合ACE2受體后,啟動膜融合[12]。在自然狀態下,病毒S1和RBD可能很容易受外在因素的影響。信息分析顯示,病毒基因組進入細胞的2個主要途徑,都可能因ASPNJ降解S蛋白而被破壞。

病毒感染進入細胞有2種主要途徑。其一是膜融合進入途徑(membrane fusion entry):當病毒黏附在易感組織細胞表面時,病毒RBD直接與ACE2結合,弗林酶(Furin,794 aa)識別S蛋白的682RRAR序列,并在685R↓處裂解成S1和S2兩個蛋白質。宿主細胞跨膜絲氨酸蛋白酶-2(T-2,TMPRSS-2,492 aa,)裂解S2的815R↓,產生S2′。S2′的N端816～837肽段和835～855肽段,為2個融合肽(FP, fusion peptide),參見Fig.1。FP融合并裂解ACE2,病毒基因組RNA進入宿主細胞[13-15]。病毒感染還有另外一種膜融合途徑,S1蛋白的Cend(682RRAR)識別、結合、激活嗅神經細胞、呼吸道黏膜細胞表面神經纖毛蛋白受體(NRP1,neuropilin receptors,923 aa)、NRP2(931 aa),病毒基因組RNA進入宿主細胞[16-17]。另一種是內體進入途徑(endosomal entry)。在TMPRSS2表達不充分的細胞,或病毒-ACE2復合物未遇到TMPRSS2,病毒ACE2經過胞膜內吞進入細胞,在酸性環境下,組織蛋白酶L(cathepsin L)裂解S2,產生S2′蛋白質,將病毒表膜與內體質膜融合,病毒基因組RNA進入宿主細胞質[18-19]。

ASPNJ是從渤海灣生長的日本刺沙蠶提取的一種堿性絲氨酸蛋白酶(pI是4.4)、分子量接近30 kD,用生色底物S-2238、S-2444和 S-2251的酰胺鍵水解實驗證實,該酶水解蛋白質中K和R殘基的C端肽鍵[20]。催化性質類似胰蛋白酶(trypsin),因此,用軟件分析ASPNJ對S蛋白的裂解時,采用胰蛋白酶作對照。作者在研究ASPNJ降解W-S實驗時,比較了兩者的活性,ASPNJ活性至少大于胰蛋白酶300倍以上[10]。ASPNJ對RBD的降解作用,破壞了病毒與宿主細胞膜的結合。無論野生型還是突變型的RBD中都含有20多個可裂解的K和R殘基,不能被裂解的K和R只是少數,詳見Table 1。因此,ASPNJ降解RBD,使病毒不能再與ACE2結合。S1的C末端模序(CendR)中的3個R,均可以被ASPNJ降解。CendR被破壞后,病毒不能結合宿主細胞膜上的NRP1和NRP2受體,因此,使其失去這種膜結合途徑。再者,3個omicron變異株的674K、675K、676K也可以被降解,同樣也破壞了CendR結構(Table 2)。ASPNJ對S蛋白質的T-2裂解位點臨近序列的降解,既破壞了S2′的形成,也破壞了FP的結構。以野生型為例,T-2815R↓位點的臨近序列(808～837aa)也是高度保守的,甚至SARS-CoV-S也相似。此中816S,對T-2識別位點和裂解位點是必不可少的[4][21]。FP中825K、835K均可裂解,因此,S2′失去融合裂解ACE2的功能,病毒基因組RNA不能進入宿主細胞(詳見Table 2)。

綜上所述,理論上ASPNJ可以裂解S蛋白質中絕大部分R和K,使RBD不能結合ACE2、S1不能結合NRP1和NRP2、FP不能融合裂解ACE2。ASPNJ既能破壞了膜融合途徑,也破壞了內吞進入途徑,而且這種作用具有廣譜性。

ASPNJ對W- S假病毒感染293T-ACE2的影響。假病毒模型依然有效地用于抗體藥物評價和篩選等研究[22-23]。本文研究的目的,是觀察被ASPNJ處理后的假病毒感染受體細胞的情況。結果顯示,處理后的假病毒感染受體細胞作用有所降低。分析其作用機制可能與ASPNJ降解假病毒細胞表面S蛋白有關。而對照實驗顯示,ASPNJ未顯示出抗腸道病毒EV-71的作用。當然該實驗僅是初步研究,仍需要更多實驗來驗證其作用,例如ASPNJ處理后分離假病毒方法的優化、對新冠病毒作用的廣譜性等。有研究證實,胰蛋白酶能滅活SARS-CoV假病毒。早在2011年,在研究宿主的不同蛋白酶激活SARS-CoV S蛋白質實驗中,感染293T-ACE2細胞前,用胰蛋白酶(0.01～10 μg/mL)處理假病毒,3～10 μg/mL能使野生型假病毒和含有K672L突變的假病毒感染性顯著降低,3 μg/mL以下至0.1 μg/mL滅活作用顯著降低,直到幾乎無作用;對野生型假病毒,血纖維蛋白溶解酶(plasmin)、食糜蛋白酶(chymotrypsin)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)等有同樣作用,但是對R667A突變株無作用,S蛋白的667R是最容易被胰蛋白酶降解的位點[24]。667R應該是最易降解的位點,但不是唯一的降解點,理論上應該有93個胰蛋白酶裂解點,對假病毒是激活還是滅活顯然與劑量有關。在培養基中,胰蛋白酶通過促進病毒進入受體細胞的方式,增加了SARS-CoV-2的感染性。2022年一個研究顯示,當受體Vero E6細胞先用1 MOI(multiplicity of infection,感染復數)的SARS-CoV-2感染1 h,然后用無血清但是含有不同濃度胰蛋白酶的培養基(0,1.25,2.5,5,10 μg/mL)進行培養,感染24 h,再測上清滴度。結果顯示,2.5～10 μg/mL組,其滴度比低濃度組或無胰蛋白酶組的滴度要高,細胞病變效應更明顯,因此提出,胰蛋白酶促進了假病毒的感染[25]。2020年一個報告顯示,在培養基中,加入胰蛋白酶促進了HEK-293T 細胞與293/hACE2細胞融合。形態學和定量的熒光素酶分析都表明,合胞體明顯增多[26]。這些研究顯示,胰蛋白酶對病毒活性的影響,可能與作用途徑、劑量以及作用時間有關[24-26]。

值得關注的是T-2不僅能降解S蛋白質,也能降解ACE2。2014年一篇文獻顯示,ACE2的697～716肽段中的R和K(697RTEVE702KAI705RM S708RS710RINDAF716R)被T-2裂解后,可增加SARS-CoV進入宿主細胞,并且是進入細胞的重要條件[27]。2020年一篇文獻報告[4],T-2在SARS-CoV-2-S蛋白中的裂解位點的aa序列是K815R↓S(詳見Table 2),但是ACE2中未見KRS序列,T-2卻可以將其降解。由此可見,準確定位T-2在ACE2中的識別序列與裂解位點和分析其作用,可能仍需要做更多的研究工作。

總之,本文通過軟件預測分析表明,3株變異病毒S蛋白堿性增強,S1和RBD更明顯、不能被ASPNJ裂解的堿性氨基酸K和R略有增加,其余生化性質,與wild型類似;還預測了ASPNJ對不同肽段K和R的降解對病毒活性的影響。研究證實,ASPNJ同樣可以高效降解這幾種變異新冠病毒的S蛋白質;初步研究顯示,ASPNJ可能有抑制野生型假病毒感染細胞作用,但確切結論,仍有待更多實驗證實。本文結果可能為研究新冠病毒提供一個新的工具酶和新的思路。