染色體微陣列分析在中樞神經系統畸形胎兒診斷中的應用

徐晨陽，項延包，周麗麗，李煥錚，林小玲，唐少華

溫州市中心醫院 中心實驗室 溫州市出生缺陷重點實驗室，浙江 溫州 325000

中樞神經系統（central nervous system, CNS）畸形是最常見的先天性畸形之一，發病率約為活產嬰兒的1.5/1 000[1]。常見的CNS畸形包括全前腦畸形、腦積水、脊柱裂、露腦畸形和Dandy-Walker綜合征等，且常合并其他系統缺陷，如心臟畸形、骨骼畸形和顱面發育異常[1-2]。CNS畸形的發生嚴重降低胎兒的存活率及出生后的生存質量，為家庭和社會帶來較大的負擔。由于胎兒CNS畸形在孕期超聲檢查中存在明顯的進展性及顯著的形態和功能不相符[2]，使其產前診斷較其他系統更為困難。雖然CNS畸形病因尚未完全明確，但遺傳學分析可以為產前診斷提供理論基礎，也有助于CNS畸形發病機制的深入探討[3-4]。

傳統核型分析是檢測非整倍體或染色體重排的經典方法，但該技術存在分辨率低、檢測周期長等局限性，而染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis, CMA）能夠檢出低至1 kb的拷貝數變異（copy number variations, CNVs），在染色體不平衡的微缺失、微重復檢測方面具有一定的優勢。近年來，CMA已被廣泛推薦應用于結構異常胎兒的產前診斷，各類CNS畸形的基因組CNVs相關研究也陸續被報道[5-7]。然而，CMA應用于產前CNS畸形胎兒的綜合性評估仍然有限。本研究回顧了232例CNS畸形胎兒的臨床和分子檢測結果，探討了各類表型相關CNVs的臨床意義，旨在為CNS畸形胎兒的產前診斷和相關遺傳咨詢提供有用的信息。

1 對象和方法

1.1 研究對象

回顧性分析2014年至2022年期間在溫州市中心醫院進行產前診斷的232例影像學提示為CNS畸形的胎兒，胎兒神經系統畸形診斷標準參照相關指南[8]，包括無腦畸形、露腦畸形、腦膜膨出、脊柱裂、腦積水、胼胝體發育不全、Dandy-Walker綜合征、全前腦畸形、脈絡叢囊腫等。根據超聲表現將232例CNS畸形病例分為孤立性CNS畸形（不伴有其他系統結構異?；虺曑洏擞洰惓＃┖头枪铝⑿訡NS畸形（CNS畸形合并其他系統結構異?；虺曑洏擞洰惓＃?。除案例38和39為同一孕婦的兩次妊娠，其余胎兒和家系之間均無親緣性。所有孕婦均接受詳細的遺傳學咨詢并簽署知情同意。孕婦年齡20～45歲，孕周12～32周。樣本類型包括胎兒皮膚組織23例、絨毛3例、羊水149例和臍血57例。

1.2 方法

1.2.1 核型分析 對209例胎兒樣本（排除23例胎兒皮膚組織）使用320～450條帶分辨率的G-顯帶進行分析。每個樣本至少有20個中期細胞用于檢測染色體結構異常和數量異常。

1.2.2 CMA 使用Illumina Human CytoSNP-12 （Illumina, USA）芯片或Affymetrix CytoScan 750k（Affymetrix, USA）芯片對232例樣本進行檢測。使用相應配套軟件讀取數據并進行分析，基因組版本注釋為GRCh37（hg19）。參考數據庫包括內部CNVs數據庫及國際公共數據庫：DECIPHER（http:// decipher.sanger.ac.uk/）、DGV（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、OMIM（http://www.omim.org）、ClinGen（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen）、PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）等。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics, ACMG）發布指南[9]，將檢測到的CNVs分為良性、可能良性、臨床意義未明、可能致病和致病。必要時通過實時熒光PCR技術檢測進行驗證和溯源。

1.3 統計學處理方法

采用SPSS23.0對數據進行分析。χ2檢驗比較孤立性CNS畸形組與非孤立性CNS畸形組之間致病性變異的檢出率。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果

19例（19/209，9.1%）胎兒存在染色體異常，其中1例三倍體69，XXX，13例非整倍體，5例染色體結構異常。非整倍體包括9例18-三體、3例21-三體及1例13-三體。染色體結構異常包括46，XN，add（6）（p25）、46，XN，del（7）（q34）、46，XN，der（13）t（4；13）（q35；q31）、46，XN，der（2）t（2；3）（p21；p25.1），der（3）dup（3）（p25.1p26.3）t（2；3）及46，XN，del（14）（q12q21）。

2.2 CMA檢測結果

CMA檢出多倍體1例（1/232，0.4%），非整倍體19例（19/232，8.2%），見表1。檢出其他致病或可能致病的CNVs 33例（33/232，14.2%），其中1例（案例21）涉及1號染色體長臂末端重復和3號染色體長臂重復，18例（案例22-39，其中38及39為同一孕婦的兩次妊娠）涉及微缺失/微重復綜合征，8例（案例40-47）涉及單倍劑量不足致病基因DLL1、FOXC1、SHH、ZIC2、CHAMP1，1例（案例53）涉及14號父源單親同二體導致的Kagami-Ogata綜合征，其余5例（案例48-52）涉及1p35.2p35.1、14q12q21.1、16q22.1q23.1 區域的缺失及3p26.3p25.1、7p22.3p21.3區域的重復，見表2和圖1。此外，9例（9/232，3.9%）僅檢出臨床意義未明的CNVs，見表3。其余170例（170/232，73.3%）未檢測到CNVs或僅檢出良性/可能良性的CNVs。

圖1 6例致病性拷貝數變異的染色體微陣列分析檢出圖

表1 CNS畸形胎兒的多倍體及非整倍體檢出結果

表2 CNS畸形胎兒的P/LP CNVs檢出結果

表3 CNS畸形胎兒的意義未明CNVs檢出結果

2.3 CNS畸形類型及異常檢出率

本研究中傳統核型染色體異常檢出率為9.1%（19/209），CMA染色體異常和p/lp CNVs檢出率為22.8%（53/232，），檢出率提高13.7%。不同類型CNS畸形的異常檢出率各有差異，其中全前腦畸形（71.4%）、脈絡叢囊腫（42.3%）和胼胝體發育不良（40.0%）檢出率最高。此外，非孤立性CNS畸形組與孤立性CNS畸形組的異常檢出率差異有統計學意義（27/57vs.26/175，P＜0.01）。詳見表4。

表4 CNS畸形類型及異常檢出率

3 討論

目前，CMA技術在不同類型CNS畸形中的應用已有一定的報道[8，10-11]，但產前CNS畸形與CNVs的綜合性研究仍然有限。本研究對232例CNS畸形胎兒進行CMA檢測，整體異常檢出率為22.8%（53/232），與YANG等[12]報道的21.6%及ZHI等[13]報道的25.1%比較接近。相對傳統染色體核型分析，CMA在染色體微缺失、微重復檢出方面有突出優勢，但CMA無法檢測低比例嵌合以及基因組平衡的染色體倒位和易位，本研究中案例44和47的親本CMA結果未見異常，通過核型分析分別發現母源平衡易位和父源平衡易位，因此，CMA技術結合傳統核型分析可以有效提高檢出率和追溯致病機制，有助于高危家系的再生育指導。此外，親本的隱匿性平衡易位尤其需要警惕。案例45的孕婦曾孕有同樣表現為全前腦畸形的胎兒，而同一家系的案例38和39具有相似的表型和基因型，這兩個家系的胎兒均同時攜帶染色體末端 10 Mb以內缺失和重復且大小相近的CNVs，對于這類隱匿性平衡易位高風險的家系，即使親本核型分析及CMA未見異常，仍有必要采用光學基因組圖 譜[14]等新技術進行變異溯源。

本次檢出的CNVs涉及多個神經發育異常易感位點，包括1q21.1 distal duplication、16p11.2 distal deletion、16p11.2 proximal duplication、 16p11.2 proximal deletion、16p12.2 proximal deletion和16p13.11 deletion，這些易感位點通常與自閉癥、發育遲緩、學習障礙、智力低下等神經發育異常相關，是一類臨床異質性較強且不完全外顯的CNVs，即使攜帶相同變異的同一家系成員，其臨床表型也各有差異[15]。本研究中案例23、32和34攜帶的易感位點即遺傳自無表型的親本。目前，環境、單基因變異、表觀遺傳引發的二次打擊理論被認為可能是導致這類疾病外顯不全和可變表達的原因[16]。神經發育異常易感位點導致的表型通常無法預測及量化，給產前診斷和遺傳咨詢帶來極大困難。本研究表明這類CNVs在一定程度上可導致宮內CNS畸形，但也強調即使攜帶同種變異的胎兒，其影像學表現仍存在相當大的差異，如案例22和23、案例32和33，以及案例34和35，并且鑒于臨床異質性，這類胎兒出生后更需要進行長期的隨訪跟蹤。

除神經發育異常易感位點以外，Miller Dieker syndrome（MDS）以及7q11.23 duplication syndrome 在檢出的微缺失/微重復綜合征中也有較高的占比。MDS是一種以無腦回和特殊面容為特征的遺傳綜合征，發病率約為1.2/10萬，此類患兒通常表現有嚴重的發育遲緩、癲癇和喂養問題[17]。MDS涉及染色體17p13.3區域連續基因缺失，其中關鍵基因LIS1編碼的PAFAH1B1蛋白是神經元遷移所必需的[18]，雖然有報道表明側腦室增寬是最常見的宮內表型[17]， 但本研究3 例MDS患胎均發現胼胝體發育異常。7q11.23 duplication syndrome是7號染色體長臂部分重復引起的罕見綜合征，其表型高度可變，主要為智力低下、語言發育障礙和特征性面容，目前已報道的腦部影像學異常有腦室擴張、白質發育異常和小腦蚓部發育不全等[19]。研究表明GTF2I編碼的蛋白是興奮劑誘導鈣進入細胞質的調節因子，該基因重復與分離焦慮癥相關，缺失與智力低下和自閉癥的程度相關[20-21]，指向該基因在神經發育中起到了重要作用。

研究中多個案例的CNVs包含劑量敏感致病基因，其中SHH基因檢出率最高，其次是ZIC2和CHAMP1。SHH和ZIC2的單倍劑量不足已與前腦無裂畸形建立了明確的疾病關聯，CHAMP1基因內也發現了多個功能喪失型變異與智力障礙等神經發育異常表型相關[22]。案例40檢出的DLL1基因和案例41檢出的FOXC1基因同樣有充分的單倍型證據可以分別導致伴有非特異性腦異常的神經發育障礙[23]和Axenfeld-Rieger綜合征3型。Axenfeld-Rieger綜合征是一種眼睛前段發育異常的常染色體顯性疾病，CNS方面主要表現為小腦蚓發育不良[24]。在其他未能明確致病基因的案例中，本研究篩選了一批與神經系統發育相關的候選基因，但這些基因的劑量敏感仍需要更多的案例和功能實驗的支持。此外，在缺失型CNVs的病因探索中，隱性遺傳病相關基因內呈反式排列的另一致病變異也應納入考慮。

本研究發現了一系列致病或可能致病的CNVs，并試圖說明這些CNVs與CNS畸形之間的相關性，也在一定程度上豐富了CNVs綜合征的宮內表型譜，同時，篩選了一批與神經系統發育異常相關的劑量敏感基因和候選基因，有助于CNS表型與基因型相關性的深入研究。