靶向FOLR1的脫氧核酶提高鼻咽癌移植瘤對紫杉醇的敏感性

張杰，蘇雪萍，楊子飛，吳賢敏，李和清

1.溫州醫科大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 溫州 325015；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 南寧 530023；3.中南大學湘雅三醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長沙 410013

鼻咽癌好發于我國南方地區，其中90%以上的病理類型為低分化鱗癌。對于大多數鼻咽癌患者來說，治療方法首選放療，因為低分化鱗癌對放療十分敏感，但對于中晚期鼻咽癌患者而言，這種以單純放療為主，甚至是化療為主的治療手段，作用十分有限[1-2]。紫杉醇（Taxol/Paclitaxel）是目前最有效的頭頸鱗癌治療藥物之一，也是治療鼻咽癌的常用藥物[3]。然而，隨著紫杉醇的廣泛應用，很多患者因產生了抗藥性而出現化療不成功的情況[4]，因此，研究鼻咽癌對紫杉醇耐藥的機制，并逆轉其耐藥性是必須要解決的問題。

已有研究顯示，與正常細胞相比，腫瘤細胞中葉酸受體FOLR1具有更高的表達水平，并且在耐藥性腫瘤細胞中具有更高的表達能力[5]。早期研究發現，正常的鼻咽部上皮細胞中并無FOLR1的表達，但在鼻咽部癌細胞，以及紫杉醇耐藥細胞中，FOLR1的表達明顯增多，且表達水平與抗藥性指標呈正相關[6]?！?0-23”脫氧核酶（DrzE）作為一種RNA剪切酶，在動脈粥樣硬化、感染、腫瘤等方面已被廣泛應用，在基因治療上發揮著重要作用[7-8]。本課題組早期研究以FOLR1的mRNA堿基序列為基礎設計合成了一種可以剪切FOLR1的DrzE，發現CNE-1/taxol耐藥細胞轉染DrzE后，FOLR1基因表達明顯減少，耐藥細胞對紫杉醇的敏感性明顯增強[6]。筆者進一步通過靶向FOLR1的DrzE干擾鼻咽癌動物移植瘤體內FOLR1的表達，探討其能否提高鼻咽癌對紫杉醇的敏感性。

1 材料和方法

1.1 主要材料

本研究所需要的人鼻咽癌CNE-1 細胞株及紫杉醇耐藥CNE-1/taxol細胞株由湘雅三醫院譚國林教授課題組贈送。RPMI-1640培養基和OPTI-MEM細胞培養液（美國Gibco公司），胰蛋白酶消化液（美國Hyclone公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），紫杉醇注射劑（北京四環醫藥科技股份有限公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（美國Bio-Rad公司），ECL顯色液（美國Abcam公司），FOLR1一抗和二抗（美國Sigma公司），RIPA裂解緩沖液和TRIzol試劑（北京康為世紀生物科技有限公司），PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本Takara公司），THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（日本TOYOBO公司），FOLR1和β-actin引物（上海生工生物工程有限公司），DrzE（上海生工生物工程有限公司）。

本實驗所需BALB/c亞系的裸鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，數量40只，雄性，年齡6～8周，體質量約20 g。動物許可證號：SCXK（湘）2009-0004，SPF級飼養。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇及培養 取凍存的CNE-1 細胞及CNE-1/taxol細胞，37 ℃水浴箱內輕搖使其解凍。常溫下在超凈臺內將解凍的細胞懸液移至離心管，再各加入6 mL含胎牛血清的RPMI-1640培養液，并進行離心（1 000 r/min，5 min）。棄上清液，各離心管內加入5 mL新鮮培養液重懸后移入250 mL培養瓶，并加入10 mL培養液。最后在恒溫培養箱中放入培養瓶進行培養。定期更換培養液，并在細胞覆蓋整個培養瓶壁時進行傳代并繼續培養。

1.2.2 裸鼠成瘤 當細胞生長處于對數期時將其消化，經過離心（1 000 r/min，5 min）和漂洗，再次離心（1 000 r/min，5 min）并加入5 mL培養液重懸。用適量Hank’s液調整細胞濃度至1×107/mL置于冰上。取4只裸鼠用于細胞懸液成瘤，使用注射器將兩種細胞懸液注射到同一只裸鼠的皮下，每個部位注射約0.2 mL。裸鼠按照左為CNE-1細胞，右為CNE-1/taxol細胞的標準分批次、多部位接種。隔日記錄兩種細胞接種后成瘤的情況及其大小變化情況。當移植瘤體直徑到8 mm左右時用斷椎法將裸鼠殺死，并浸泡于75%的乙醇溶液中。在無菌超凈臺上使用無菌手術剪和無齒鉗，解剖瘤體后將其在適量培養液中浸泡。選擇生長良好且沒有壞死的腫瘤組織，并將其剪碎至直徑約1 mm的小塊，浸泡在培養基中備用。使用1%戊巴比妥注射液腹腔注射麻醉裸鼠，背部移植區域予絡合碘多次消毒。選擇相對松弛的皮膚作為移植點，并用手術剪在兩側各開一個直徑約2 mm的小口，使用無齒鑷鈍性分離皮膚和皮下組織。將小塊瘤體放入皮下，輕輕擠壓以排出間隙氣體，最后縫合傷口。根據上述方法，在36只裸鼠的左側背部皮下接種CNE-1小瘤塊，右側背部皮下接種CNE-1/taxol小瘤塊[9]。接種瘤塊后第2天開始記錄裸鼠的瘤情。此外，在標本瓶中放入兩種細胞的瘤塊樣本并置入液氮冷凍，用于后續檢測FOLR1 mRNA和蛋白在給藥前的表達量。

1.2.3 分組給藥及數據測量 除去3只成瘤效果不佳和1只意外死亡的裸鼠，余32只成瘤的裸鼠隨機分成4組，每組8只。14 d后當腫瘤直徑長至約5 mm時，開始統一給藥。具體的分組、給藥方式和劑量見表1。在每次隔日給藥之前，測量腫瘤的體積（V），V=0.5ab2（a和b分別代表移植瘤體的長徑和短徑），并繪制腫瘤生長曲線。每組連續給藥7 d后觀察3 d，最后手術取出移植瘤體，測量腫瘤體積，并計算移植瘤體的增長倍數及其抑制率。移植瘤體的增長倍數=給藥后第10天瘤體體積/給藥前瘤體體積；移植瘤體抑制率（%）=（1-實驗組瘤體增長倍數/對照組增長倍數）×100%。

表1 實驗分組及給藥方式、劑量（1次/d，共7次）

1.2.4 RT-qPCR檢測給藥前后FOLR1 mRNA的表達變化 取液氮罐中凍存的給藥前及給藥后各組鼻咽癌CNE-1及CNE-1/taxol瘤塊，切成約0.5 cm×0.5 cm大小，放入離心管用勻漿鉆頭制備組織勻漿。小瘤塊的總RNA由TRIzol試劑提取，cDNA合成試劑盒反 轉錄得到。Applied Biosystems CFX96實時PCR系 統用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒進行RTqPCR。FOLR1的靶向mRNA的引物（正向：5’GAATGCCTG CTGTTCTACCA3’；反向：5’TGCGACAATCTTCCCACC3’）已反復驗證。qRT-PCR反應條件設置為：預變性溫度95 ℃，15 s，1個循環；變性溫度95 ℃，15 s，退火溫度60 ℃，60 s，延伸溫度72 ℃，20 s，40個循環。用β-actin對各mRNA表達量標準化。ΔΔCt法用于計算結果。

1.2.5 Western blot檢測給藥前后FOLR1蛋白的表達變化 制備各組瘤體的組織勻漿，加入到RIPA裂解緩沖液中裂解，蛋白質濃度用BCA法進行測量。將蛋白樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行分離，后轉移到PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉和0.1% Tween 20的TBS封閉緩沖液進行封閉1 h，在4 ℃冰箱內于TBST中與一抗孵育約20 h。TBST洗膜3次，置于HRP偶聯的二抗溶液（1:5 000）中孵育1 h，用TBST洗膜3次，最后用ECL顯色液對樣品進行顯色。實驗重復3次。

1.3 統計學處理方法

2 結果

2.1 兩種方法裸鼠移植瘤生長情況

裸鼠接種0.2 mL的CNE-1和CNE-1/taxol細胞懸液后，其生命力和生活習性基本同前。裸鼠在接種后7 d內，接種的地方會形成略呈粉色、質地稍軟的粟粒大小結節，見圖1A。后期結節逐漸消退，并進入潛伏期，其時間在28～36 d不等。一般情況下，接種后30 d左右，會再次出現粟粒大小的結節，其顏色同周圍膚色，質地堅韌，見圖1B，后結節迅速增大。移植瘤體的生長時間約為45 d，其平均長徑可長到約8 mm，其形狀可呈橢圓形或呈分葉狀。此外，CNE-1細胞的成瘤率為62.5%（16個成瘤點中成功成瘤10個），CNE-1/taxol細胞的成瘤率為50%（16個成瘤點中成功成瘤8 個）。新鮮小瘤塊移植成功 后，36只裸鼠全部出現腫瘤生成，且無明顯潛伏期，見圖1C。瘤體逐天增大，約14 d見圓球形或橢球形腫瘤，直徑約5 mm，見圖1D。

圖1 裸鼠成瘤情況

2.2 給藥前后裸鼠移植瘤生長狀況

給藥前32只裸鼠CNE-1和CNE-1/taxol移植瘤體都表現為局灶結節狀，且速度相似。瘤塊移植14 d測量瘤體體積，其中CNE-1為（80.13±24.50）mm3，CNE-1/taxol為（59.10±18.72）mm3，CNE-1瘤體體積顯著大于CNE-1/taxol瘤體（t=3.82，P=0.004）。給藥后，各組的移植瘤體生長速度有所差異，其中CNE-1瘤體中紫-脫組及紫杉醇組的生長速度較對照組及脫氧核酶組減慢，而CNE-1/taxol瘤體中紫-脫組的生長速度較其他組速度明顯減慢，見圖2。

圖2 各組移植瘤體的生長曲線

在CNE-1移植瘤體中，3組實驗組分別與對照組相比，瘤體體積增長倍數都有明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），可以認為單獨或聯用紫杉醇和脫氧核酶都可有效抑制鼻咽癌CNE-1細胞增長。對比CNE-1/taxol移植瘤體中的3個實驗組和對照組，發現脫氧核酶組和紫-脫組的瘤體體積增長倍數顯著低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），表明脫氧核酶單用或與紫杉醇聯用可以抑制CNE-1/taxol瘤體的生長。然而，紫杉醇組單用后，瘤體體積增長倍數與對照組比差異無統計學意義（P＞0.05），這表明鼻咽癌耐藥細胞CNE-1/taxol對紫杉醇具有耐藥特性。見表2。

表2 各組裸鼠皮下移植瘤體增長倍數比較（每組n=8，±s）

表2 各組裸鼠皮下移植瘤體增長倍數比較（每組n=8，±s）

與對照組比：aP ＜0.05，bP ＜0.01。

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由于不同的瘤體體積和生長速度都不一樣，為了減少這種差異，采用比較瘤體生長抑制率的方法對不同細胞間及不同藥物間的差異做進一步比較，結果發現，單獨使用紫杉醇時，CNE-1/taxol組的瘤體抑制率低于CNE-1組（P＜0.01）；單獨使用DrzE時，CNE-1/taxol組的瘤體抑制率高于CNE-1組（P＜0.05）；當紫杉醇和脫氧核酶聯合使用時，兩種瘤體均呈現出明顯的抑制作用，但兩組的抑制率差異無統計學意義（P＞0.05）。在同一類型的瘤體內比較，CNE-1和CNE-1/taxol移植瘤體中，聯合使用紫杉醇和脫氧核酶的瘤體抑制率均顯著高于單藥組（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組裸鼠皮下移植瘤體的生長抑制率比較（每組n=8，±s，%）

表3 各組裸鼠皮下移植瘤體的生長抑制率比較（每組n=8，±s，%）

與紫-脫組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與CNE-1移植瘤體比：cP＜0.05，dP＜0.01。

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2.3 RT-qPCR檢測藥物處理前后FOLR1 mRNA表達的變化

RT-qPCR檢測結果顯示，給藥前CNE-1/taxol移植瘤中FOLR1的mRNA表達量為12.47±0.49，高于CNE-1移植瘤的1.00±0.02（t=65.72，P＜0.001）。給藥后紫杉醇組的FOLR1 mRNA在CNE-1和CNE-1/taxol瘤體中的表達量與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），但紫-脫組、脫氧核酶組的FOLR1 mRNA表達量較對照組均顯著下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩種移植瘤FOLR1 mRNA相對表達量的比較

2.4 Western blot檢測藥物處理前后FOLR1蛋白表達的變化

Western blot檢測結果顯示，給藥前CNE-1/taxol移植瘤細胞中FOLR1的蛋白表達量較CNE-1明顯增加（P＜0.01），見圖4A、圖4B。給藥后紫杉醇組的FOLR1在CNE-1和CNE-1/taxol瘤體中的蛋白表達與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），而單用脫氧核酶組和紫-脫組兩種瘤體的FOLR1表達量較對照組有顯著下降（P＜0.05），見圖4C-4F。

圖4 給藥前后兩種移植瘤FOLR1蛋白相對表達量的比較

3 討論

研究發現，鼻咽癌耐藥性與FOLR1[6]、tau[12]、txr1[13]、peg10[14]、dlc1[14]、chfr[14]等基因存在相關性。雖然細胞學實驗顯示FOLR1靶向的DrzE可以提高CNE-1/Taxol對紫杉醇的敏感性，但尚未進行動物實驗。因此，本研究的目標是通過動物實驗建立鼻咽癌CNE-1及CNE-1/taxol的裸鼠移植瘤模型，并進一步探究靶向FOLR1的DrzE是否能夠下調FOLR1的表達來增加CNE-1/taxol對紫杉醇的敏感性。

紫杉醇與微管蛋白結合后微管蛋白發生聚合而解聚受阻，導致細胞在有絲分裂過程中紡錘體形成受阻，細胞停滯于G2/M期，增殖速度減慢并最終死亡[15]。前期研究用紫杉醇大劑量沖擊并逐漸加量的方法誘導并逐步篩選出耐紫杉醇細胞—CNE-1/taxol細胞[16]。耐藥機制考慮與細胞中微管蛋白表達異常并進一步引起微管蛋白結構異常有關[17]。微管蛋白的突變和相關蛋白比例的異常，可能會使紡錘體在細胞復制過程中形成障礙，導致腫瘤細胞G2/M期延長，從而減緩耐藥性細胞的增殖速度[18-19]。 有研究發現，鼻咽癌耐藥細胞株相對于親本細胞，細胞倍增時間略有延長，其G0/G1期顯著下降，而G2/M期則相對上升[20]。此外，瘤體生長依賴瘤內血管增生，其中VEGF發揮了重要的作用[21]。早期研究發現，鼻咽癌CNE-1移植瘤與CNE-1/Taxol移植瘤相比，VEGF表達量明顯增加，導致其血管生成增多，腫瘤生長更快[10]。本研究發現，鼻咽癌CNE-1瘤體的生長速度比CNE-1/taxol瘤體更快，成瘤率也更高，這也進一步驗證了鼻咽癌耐藥細胞增生緩慢的特點。

葉酸參與許多生物過程，如基因合成和修復、細胞分裂和蛋白質代謝等。腫瘤細胞的增殖需要大量的葉酸，而葉酸受體FOLR1在這一過程中扮演著重要的角色，所以大多數腫瘤組織中FOLR1都會顯著增加[5]，并且研究發現在紫杉醇抗藥細胞中，FOLR1的表達更多[22]。本研究通過靶向FOLR1的DrzE的特異性催化作用，對FOLR1的mRNA進行剪切，使FOLR1的表達受到進一步干擾。細胞吸收葉酸的能力在FOLR1數量減少的情況下減弱，造成細胞攝入葉酸的數量減少，使細胞內的RNA、DNA和蛋白質合成進一步受阻。細胞層面的變化包括細胞增殖速度的減緩，以及細胞死亡的增加，而體現在組織層面就會出現裸鼠移植瘤的生長變慢。

有研究發現，細胞凋亡相關基因Bcl-2和Bax的表達受FOLR1所調控，上調FOLR1會增加Bcl-2的表達，而降低Bax的表達，最終通過抑制Caspase信號通路來減弱化療藥物的促凋亡作用[23]。而紫杉醇等化療藥可以介導多種信號通路讓Bcl-2 發生磷酸化而失去活性，進一步導致細胞微管損傷，最終引起細胞死亡[3]。但在FOLR1的作用下，因紫杉醇引起的Bcl-2 發生磷酸化明顯減弱，導致紫杉醇的微管聚合作用減弱，進而引起紫杉醇耐藥細胞的生成。此外，前期研究發現Tau蛋白的高表達與鼻咽癌紫杉醇耐藥相關[12]，且有研究發現Tau和FOLR1的表達互為促進[24]。我們通過實驗比較CNE-1及紫杉醇耐藥的CNE-1/taxol移植瘤的瘤體抑制率，發現相較于單用紫杉醇和DrzE，兩藥聯用時其瘤體抑制率明顯提高，且兩藥聯合時，CNE-1/taxol的瘤體抑制率與CNE-1相比無顯著差異，可能也預示靶向FOLR1的DrzE可以使耐藥細胞CNE-1/taxol對紫杉醇的敏感性提高，逆轉其耐藥性，使其與親本細胞CNE-1對紫杉醇的敏感性相當。但是，分子機制上否通過降低Tau、Bcl-2的表達或是否存在其他可能途徑仍需進一步研究驗證。

綜上所述，本研究顯示靶向FOLR1的DrzE可以成功轉染裸鼠移植瘤體，使得移植瘤體生長減慢，并且增加鼻咽癌紫杉醇耐藥移植瘤對紫杉醇的敏感性，為鼻咽癌紫杉醇耐藥提供了一種可能的解決方案。