玉蘭葉多酚物質提取及特性研究

張 順, 惠哲哲, 王宏亮, 楊 瑞, 梁 犇, 楊駿鵬,邱 瑩, 宋鳳敏, 劉存芳, 高艷紅, 史 娟

(陜西省催化重點實驗室;陜西理工大學化學與環境科學學院,漢中 723001)

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的多酚類化合物。近年來,多酚類物質的生物活性及對人體的保健預防作用日益受到人們的關注,其清除機體內自由基、抗脂質氧化、延緩機體衰老、預防心血管系統疾病、防癌、抗輻射等生物活性功能的發現,使多酚的研究和應用越來越受到重視。據報道,抗癌防癌物中最有希望的一類植物化學物質即是多酚類抗氧化劑[1]。在全球老齡化與亞健康普遍化的當下,富含植物活性成分的保健品具有較為廣闊的市場前景。利用植物多酚對人體的多種生理活性,將其開發為保健食品,食品添加劑、風味食品添加劑、風味劑成為綠色保健品的開發熱點[2]。

廣玉蘭為木蘭科、木蘭屬常綠喬木[3]。其葉和花含有多種揮發油、木蘭堿、黃酮類、酚類等化學成分,常用于日常頭痛腹瀉、風寒嘔吐、高血壓、偏頭疼等[4,5]。近年來,超聲波技術多應用于植物中多酚、黃酮、多糖、皂苷、香豆素等生物活性物質的提取。與常規提取方法相比,超聲波提取方法能提高有效成分的溶出速度、縮短提取時間、節省溶劑的消耗、提出率高[6]。目前,利用超聲技術對玉蘭葉中多酚的提取及其抗氧化性能的研究還鮮見報道。本實驗采用超聲波技術提取玉蘭葉中的多酚,設計單因素試驗考察料液比、提取時間、提取溫度等對其多酚提取率的影響,并采用四因素三水平正交實驗優化提取工藝[7-9]。并在此基礎上研究其抗氧化性能及穩定性,旨在為進一步開發利用廣玉蘭資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:廣玉蘭葉(采摘于陜西理工大學南校區)。

試劑:葡萄糖、沒食子酸、福林酚試劑、硫酸亞鐵、VC、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、水楊酸、氯酸鐵、氯酸鉀、DPPH、廣玉蘭葉、濃鹽酸、碘化鉀、可溶性淀粉、乙醚、無水乙醇、冰乙酸、三氯甲烷、酚酞、氫氧化鉀、硫代硫酸鈉等化學試劑均為分析純。

1.2 設備和儀器

AR124CN電子天平,HHS電熱恒溫水浴鍋,UV-2600紫外可見分光光度計,HG71電熱恒溫鼓風干燥箱,SB25-12 DTD超聲波清洗機。

1.3 實驗方法

1.3.1 多酚含量的測定

采用福林酚法測定玉蘭葉多酚的含量,測得標準曲線回歸方程為:

A=0.108 64C+0.105 11,R2=0.993 12

式中:A為沒食子酸的吸光度;C為沒食子酸的質量濃度。

1.3.2 多酚的提取與檢測

將廣玉蘭葉在烘箱中60 ℃烘干,粉碎過60目篩裝袋備用。準確稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末,加入提取溶劑乙醇,在超聲波清洗儀中設定溫度進行超聲波提取后,常壓過濾,濾液收集于100 mL容量瓶中,用提取溶劑乙醇定容[10]。取1 mL該樣液于25 mL容量瓶中,并用提取溶劑定容,即為待測樣品溶液。廣玉蘭葉中多酚的檢測:取適當濃度的樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加入5.0 mL體積分數9.8%福林酚,搖勻反應5～7 min,加入4.0 mL質量分數7.7% Na2CO3溶液,搖勻靜置1 h,于765 nm波長下檢測吸光度值,同時以1.0 mL提取溶劑代替樣品溶液作為空白對照[11]。根據測得的吸光度值按標準溶液回歸方程計算樣品溶液中總多酚濃度,進而計算廣玉蘭葉樣品中總多酚質量分數(w)。

式中:c為測定液的質量濃度/mg/mL;V為測定液的體積/mL;n為擴大倍數;m為測定液的質量/mg。

1.3.3 單因素實驗

對廣玉蘭葉中多酚的提取工藝進行優化,在超聲波條件下,選取乙醇體積分數,料液比,超聲時間,超聲溫度4個因素作為參考因子,尋找最佳提取條件。

1.3.3.1 料液比對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,選取料液比為1∶8、1∶16、1∶24、1∶32、1∶40,在乙醇體積分數為60%,超聲時間30 min,超聲溫度60 ℃的條件下,研究料液比變化對多酚提取率的影響。

1.3.3.2 超聲時間對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,在料液比1∶16,乙醇體積分數為60%,超聲溫度60 ℃的條件下,改變超聲時間為20、30、40、50、60 min,研究時間對多酚提取率的影響。

1.3.3.3 超聲溫度對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,在料液比1∶16,超聲時間40 min,乙醇體積分數為60%的條件下,改變超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃,研究溫度對多酚提取率的影響。

1.3.3.4 乙醇體積分數對多酚提取率的影響

稱取1.0 g廣玉蘭葉粉末5份,在料液比1∶16,超聲時間40 min,超聲溫度70 ℃的條件下,改變乙醇體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%,研究溶劑濃度對多酚提取率的影響。

1.3.4 正交實驗設計

在單因素實驗的基礎上,以超聲溫度、超聲時間、料液比和乙醇體積分數共4個因素,以玉蘭葉多酚提取率為考察指標,選擇L9(34)正交表進行正交實驗,正交實驗設計見表1。

1.3.5 玉蘭葉多酚抗氧化活性實驗

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性的測定

將2.0 mL的DPPH溶液分別和2.0 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL濃度樣品溶液,充分混合均勻,在室溫條件(27 ℃)下避光溫浴30 min后用分光光度計在波長517 nm處測量吸光度A1。對照實驗用等量的無水乙醇代替DPPH溶液測量吸光度A2[12],空白實驗用等量的無水乙醇代替樣品溶液測量吸光度A3。樣品溶液對DPPH自由基的清除率計算公式:

1.3.5.2 羥自由基清除活性的測定

分別吸取6 mmol/LFeSO4溶液、6 mmol/L過氧化氫溶液、6 mmol/L水楊酸溶液和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的樣品溶液1 mL,使其充分混合均勻,并于40 ℃水浴中放置30 min后用分光光度計在波長510 nm處測吸光度為A1。取1 mL蒸餾水代替過氧化氫溶液所測得的吸光度為A2;取1 mL無水乙醇代替樣品溶液所測得的吸光度為A3[13]。樣品溶液對羥自由基清除率的計算公式同1.3.5.1。

1.3.6 廣玉蘭葉中多酚的抗氧化活性穩定性實驗

1.3.6.1 紫外光照射對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

取濃度為1.3 mg/mL多酚提取液裝入100 mL容量瓶中定容并置于紫外光下,光源垂直距離為10 cm,分別照射1、2、3、4、5 h,以原液作為對照,測定其對DPPH自由基抗氧化性的變化,平行測定3次,取平均值[14]。

1.3.6.2 溫度對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

取濃度為1.3 mg/mL多酚提取液分別裝入4個100 mL容量瓶中定容,分別置于20、40、60、80 ℃條件下進行避光處理,分別測定處理1、2、3、4、5 h后,抗氧化性的變化。以原液作為對照,測定其對DPPH抗氧化性的變化,平行測定3次,取平均值。

1.3.6.3 添加劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

取濃度為0.3 mg/mL多酚提取液裝入5 mL透明的玻璃管中,分為3組,分別加入濃度1.0 m的葡萄糖,檸檬酸,苯甲酸鈉溶液1 mL,暗處理,并保證3組均在室溫條件下進行。以原液作為對照,每隔2 h測定1次對DPPH自由基的清除率,平行測定3次,取平均值。根據結果來分析添加劑對DPPH自由基的活性變化。

1.3.6.4 氧化劑與還原劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

向3個100 mL容量瓶分別加入1.0 mL體積分數為 0.6%的H2O2溶液,1.0 mL濃度為0.06 moL/L的KClO3,1.0 mL濃度為0.06 moL/L的VC,30 ℃下攪拌反應后避光處理,以原液作為對照,分別測定處理2、4、6 h后,氧化劑和還原劑處理下其對DPPH清除能力的變化。

1.3.6.5 金屬離子對玉蘭葉多酚的影響

取質量濃度為0.3 mg/mL多酚提取液0.5 mL 9份,分別裝入5 mL透明的試管中。并分別加入2 mL質量濃度為0.2 mg/mL的Fe3+,K+,Co2+,Zn2+,Ca2+,Na+,Cu2+,Mg2+,Al3+溶液,以蒸餾水作為對照,搖勻,在室溫下避光放置1 h后,在517 nm處測定其酚類物質濃度,平行測次3次,取平均值。

1.3.7 廣玉蘭葉中多酚對油脂氧化敗酸的影響

準確稱取50 g油脂置于250 mL錐形瓶中,除空白對照,其他錐形瓶中以質量分數為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%的多酚提取液,混合均勻,置于(60±0.5)℃的恒溫箱中,每隔24 h搖勻1次,并交換其在恒溫箱中的位置。每5 d取樣測定油脂的過氧化值和酸價。每個樣品重復測定3次。

過氧化值和酸價的測定參照GB 5009.37—2003《食品安全國家標準 食用植物油衛生標準的分析方法》;根據GB 10146—2015《食品安全國家標準 食用動物油脂》和GB 2716—2018《食品安全國家標準 植物油》,動物油中的過氧化值應≤0.2 g/100 g,約為7.9 mmol/kg,酸價應≤2.5 mg/g(以KOH計);植物油中的過氧化值≤0.25 g/100 g,約為9.9 mmol/kg,酸價應≤3.0 mg/g(以KOH計)[15]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 最佳料液比的確定

從圖1可以看出,提取率與液料比并不具有一定的線性關系,提取率先隨著料液比的增加而增加,當達到一定的提取率時,隨著料液比的增加提取率反而下降。這是因為繼續增加乙醇會導致其他醇溶性雜質溶出,影響測定結果,導致提取率下降[16]。因此最佳料液比為1∶16。

圖1 不同影響因素的提取效果

2.1.2 最佳超聲時間的確定

從圖1可以看出,在一定范圍內,廣玉蘭葉中多酚的提取率隨提取時間的延長而不斷提高,但當超聲時間超過40 min后,提取率迅速變小,這可能是因為較長時間的超聲處理影響了部分玉蘭葉多酚的組成及結構,并且隨著時間的延長,溶劑揮發也越多,進一步影響提取率[17]。故確定最佳超聲時間為40 min。

2.1.3 最佳超聲溫度的確定

從圖1可以看出,超聲溫度為40～70 ℃時,廣玉蘭葉中多酚提取率隨溫度的升高而增大,溫度高于70 ℃時,提取率下降。這是由于溫度過高,小部分溶劑揮發損失,導致多酚提取不完全。此外,溫度過高,還可引起多酚變質或者分解[18]。綜合各因素考慮,確定70 ℃為最佳超聲溫度。

2.1.4 最佳乙醇體積分數的確定

從圖1可以看出,當乙醇體積分數為50%～80%時,多酚的含量隨著乙醇體積分數的增大而增加,這是因為多酚類物質較易溶于乙醇,乙醇含量越大,廣玉蘭葉中多酚的析出越好。之后提取率略微下降,可能是因為乙醇體積分數的增大,其他一些醇溶性雜質溶出也增多,影響了多酚的測定,同時,乙醇體積分數過高會使蛋白質的變性,對乙醇提取多酚物質有一定的影響,阻礙多酚化合物的溶解。因此,選取最佳乙醇體積分數為80%。

2.2 正交實驗的極差分析

由表2可知,最佳的提取條件是A2B3C3D2,即乙醇體積分數為80%,液料比為1∶16,超聲時間為50 min,超聲溫度為80 ℃。由極差分析可知,在實驗所選水平內4個因素對玉蘭葉多酚提取率影響程度大小順序為:超聲溫度>料液比>超聲時間>乙醇體積分數。在最佳提取條件下進行3組驗證實驗,廣玉蘭葉中多酚得率的平均值為12.8%,即121.477 mg/g,高于正交實驗中各條件的結果得率,證明該條件為廣玉蘭葉中多酚提取的最優工藝。

表2 正交實驗的極差分析

2.3 玉蘭葉多酚抗氧化活性實驗

如圖2所示,多酚對DPPH自由基和羥自由基均具有一定的清除作用,但對DPPH自由基清除能力明顯優于羥基自由基,且隨著濃度的增加而增加,增加較為明顯。玉蘭葉多酚對羥基自由基清除率也與濃度呈正相關。因為多酚對DPPH自由基清除作用明顯,所以選用DPPH自由基作為玉蘭葉多酚抗氧化穩定性的研究對象。

2.3.1 紫外光對玉蘭葉多酚抗氧化性的影響

如圖3所示,紫外光照射使廣玉蘭葉的多酚對DPPH自由基的清除率產生波動,但與對照實驗相比,其波動范圍很小且在6 h后仍保持良好的清除率,說明玉蘭葉多酚對紫外線照射具有較好的穩定性。

圖2 DPPH自由基與·OH清除活性的測定

圖3 紫外光對玉蘭葉多酚抗氧化性的影響

圖4 溫度對玉蘭葉多酚清除DPPH的影響

2.3.2 溫度對廣玉蘭葉提取液中多酚清除DPPH的影響

如圖4所示,玉蘭葉多酚在20、40、60、80 ℃條件下處理1 h后,室溫20 ℃時的清除率最高。隨著時間的增加,在室溫20 ℃的條件下,玉蘭葉多酚對DPPH自由基的清除率基本保持不變;在40 ℃和60 ℃的處理條件下,其對DPPH自由基的清除率在逐漸增大,并且趨于一致;在80 ℃的處理條件下,其對DPPH自由基的清除率相對穩定。在不同溫度處理6 h后,玉蘭葉多酚仍保持良好的清除能力,說明玉蘭葉多酚對DPPH自由基的清除率受溫度影響不大。

2.3.3 添加劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

如圖5所示,2 h內,在3種添加劑的處理下,玉蘭葉多酚清除DPPH的能力都呈現下降趨勢,2～4 h 內略微增長,4～6 h又開始下降較小幅度。與對照實驗相比,6 h后,經添加劑處理的多酚都降低了極大的清除能力?？梢?多酚對DPPH自由基的清除能力在添加劑處理下是不穩定的。

圖5 添加劑對玉蘭葉多酚清除 DPPH 自由基的影響

2.3.4 氧化劑與還原劑對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

如圖6所示,隨著氧化時間的增加,氧化劑H2O2和KClO3對玉蘭葉多酚DPPH自由基的清除能力趨于下降趨勢,因為氧化劑消耗了玉蘭葉多酚中大量的抗氧化成分;還原劑VC使其清除能力增強,這是因為VC對DPPH自由基具有還原作用。實驗說明,在廣玉葉多酚中添加一定量的H2O2,KClO3和VC能顯著降低或提高玉蘭葉多酚的抗氧化性。

圖6 氧化劑與還原劑對玉蘭葉多酚清除 DPPH 自由基的影響

2.3.5 金屬離子對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

如圖7所示,相對于初始玉蘭葉多酚對DPPH自由基的清除能力,在9種金屬離子處理后,添加了Na+和K+的溶液對DPPH自由基的清除能力變大;而其他Fe3+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Al3+溶液,都使玉蘭葉多酚對DPPH自由基清除能力降低,其中添加了Ca2+的溶液對DPPH自由基的清除能力下降最大。Cu2+和Fe3+雖然對清除能力影響不大,但使玉蘭葉多酚溶液顏色迅速變深,說明廣玉蘭多酚不適合用銅質和鐵質的器皿儲存和加工,用鋁制的容器較好。

圖7 金屬離子對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基的影響

2.4 廣玉蘭葉中多酚對油脂氧化敗酸的影響

如圖8、圖9所示:在對大豆油及豬油添加不同質量分數的廣玉蘭多酚進行高強度氧化過程,同空白組做對照實驗,表明不同質量分數的玉蘭葉多酚對油脂的酸價和過氧化值具有抑制作用,且與多酚的質量分數有關。

圖8 玉蘭葉多酚對大豆油過氧化值的影響

圖9 玉蘭葉多酚對大豆油酸價的影響

3 結論

本實驗采用超聲波法提取玉蘭葉多酚,取得了較好的效果。在單因素實驗的基礎上,通過正交實驗選擇出玉蘭葉多酚的最佳提取工藝條件是:乙醇體積分數為80%,液料比為1∶16,超聲時間為40 min,超聲溫度為80 ℃。各因素對生物堿提取率影響程度大小順序為超聲溫度>料液比>超聲時間>乙醇體積分數。并重復實驗進行驗證,多酚提取率均值為12.8%,即121.477 mg/g。本實驗表明,利用超聲波提取玉蘭葉多酚的方法可行,具有提取時間短、原料少等特點。

抗氧化實驗結果表明,多酚對DPPH自由基和羥基自由基都具有一定清除能力。但對DPPH自由基清除能力最強,而對羥基自由基的清除能力較弱?？梢钥闯鲇裉m葉多酚具有明顯的抗氧化活性,從資源利用的角度來看,廣玉蘭葉具有較大的開發潛力。

由玉蘭葉多酚的抗氧化穩定性實驗結果表明,在添加劑,氧化還原劑的處理下,玉蘭葉多酚抗氧化穩定性較差。紫外光照和溫度對玉蘭葉多酚清除DPPH自由基穩定性影響較小。在9種金屬離子的處理下,玉蘭葉多酚適用于鋁制的容器儲存和加工。在對油脂的高強度氧化實驗中,玉蘭葉多酚對油脂的酸價和過氧化值均具有較好的抑制作用。