凝脂蓮香精成分分析及最優提取方式研究

陶厚璜，周泓彬，郭明

( 浙江農林大學 化學與材料工程學院，浙江 杭州 311300）

景天科Crassulaceae 多肉植物可以散發出香味[1]，比如凝脂蓮Sedumclavatum，原產于墨西哥，生長于巖壁或安山巖上，現已在世界多地廣泛種植[2]。在經過人類百年的培育后，基因穩定[3]，生產鏈完善。在國內屬于多肉植物中的入門級品種，價格低，產量又高[4]，因其經過日曬后香味更加濃郁，成為多肉香精提取的主要對象[5]。多肉香精的提取不僅可以直接解決部分多肉植物現階段價格低迷、供大于求的問題，還可以解決農民囤積的問題，為農戶們帶來新的創收，同時可為我國多肉產業鏈調整提供參考[6]。

對相關精油的提取，現國內主要采用的是微波輔助水蒸氣法（Microwave Assisted Hydro-distillation，MAHD）[7]，相較于傳統的水蒸氣蒸餾法（Steam distillation，HD）存在提取過程長，提取原料需要加熱，不適用于化學性質不穩定組分提取的問題[8]，MAHD 既有水蒸氣蒸餾法設備簡單、易操作和易分離純化的優點[9]，又結合了微波輔助技術對某些組分的高效選擇性和省時、產物提取率高的特點，兩者結合可以大大加快香精提取的速度以及提高產物的提取率[10]。MAHD 已經在天然產物的提取中有過較多報道，是一種可靠的方法，而關于其在景天科多肉植物香精提取研究則較為少見[11]。

本文通過MAHD 法提取凝脂蓮香精，采用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）分析儀[12]分析和鑒定原植株香精與葉片、莖稈香精化學成分的差異，對比三者成分，探求三者的關系；同時，利用單因素試驗法[13]，探討固液比、浸泡時間、微波功率、提取時間四個因素對香精提取率的影響，總結凝脂蓮香精的最佳提取條件，得出最高提取率。目前，已發現景天科多肉植物相對于其他多肉植物的香精揮發性物具有抑菌[14]、抗氧化、消炎、抑制細胞毒性[15]等作用。本文也希望提取出的香精在幫助種植戶們解決囤積問題，增加收入的同時，能為植物種植領域[16]做出獨特的貢獻，成為一項有意義的研究。

1 材料與方法

1.1 材料準備與實驗儀器

試驗所用凝脂蓮購于山東欣美多肉植物種植基地。取新鮮凝脂蓮的地上部分，將葉片和桿莖分別切出小口，避免在干燥過程中爆裂[17]，再放入干燥箱中，初始溫度定為40 ～ 50 ℃，時間為2 h，中期控制溫度在55 ℃左右，放置10 h，后期升溫至60 ℃，等待5 h，最后取出并趁熱使用粉碎機分別粉碎，得到的產物使用目篩篩至10 目，隨后及時使用密封袋裝取備用。

試驗所用試劑無水硫酸鈉、異丙醇（分析純，質量分數為98%）均購于上海阿拉丁試劑有限公司。

真空干燥箱（北京益康科學儀器有限公司）；XH-300A 微波-超聲波合成萃取儀（北京祥鵠科技發展有限公司）；氣相色譜-質譜聯用分析儀（Agilent，美國）。

1.2 微波輔助水蒸氣法提取凝脂蓮精油

分別準備25 g 的凝脂蓮葉片及桿莖干樣和200 g 蒸餾水即固液之比為1∶8，將干樣浸泡到蒸餾水中，等待2 h，結束后加入至微波-超聲波合成萃取儀中，上端連接冷凝管和揮發油測定器進行微波輔助-水蒸氣蒸餾。微波提取功率為400 W，無餾分蒸出后關閉微波提取裝置，收集冷卻至室溫后的精油，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液經無水硫酸鈉脫水后得到凝脂蓮葉片及桿莖香精[18]，精確稱量其質量并記錄，密封后保存于4 ℃冰箱。計算凝脂蓮精油提取率：

式（1）中，mg是脫水后香精的質量，mo是凝脂蓮使用的質量。

1.3 香精成分分析測定條件

1.3.1 植株香精成分測定-頂空固相微萃取[19]

（1）將一年生的新鮮凝脂蓮植株清洗干凈晾干，把植株均勻剪成小粒，稱取1.0 g 放入頂空瓶，加入9 mL蒸餾水，插入萃取頭于45 ℃下萃取，時間30 min，在氣相色譜儀進樣口250 ℃下熱解析6 min，啟動氣質儀采集，進行GC-MS 分析。

（2）氣相色譜條件[18]：RTX-5MS 型彈性石英毛細管色譜柱，載氣為高純度氦氣（99.999%），柱內載氣流量1.30 mL·min-1；進樣口溫度230 ℃。升溫程序：從60 ℃開始保持2 min；以4 ℃·min-1升溫至80 ℃，保持1 min；再以10 ℃·min-1升溫至120 ℃，保持1 min；以5 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持1 min；最后以20 ℃·min-1升溫至220 ℃；不分流進樣。

（3）質譜條件：電子轟擊離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；倍增器電壓0.9 kV；溶劑延時5 min；掃描范圍35 ～ 600 m·z-1。

1.3.2 葉片和莖稈香精成分測定

（1）在1 mL 異丙醇中溶解100 μL 葉片或莖稈的香精，充分震蕩搖勻作為待測液，進行GC-MS 分析。

（2）氣相色譜條件：同1.3.1（2）中的條件。

（3）質譜條件：同1.3.1（3）中的條件。

1.4 單因素實驗

通過1.2 節的實驗發現莖稈香精提取率遠高于葉片，所以單因素實驗只考慮莖稈香精的提取率。按照1.2節方法，每次改變1 個因素條件，研究固液比即不同量凝脂蓮莖稈干料與水的比例（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 W/W）、提取時間（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、浸泡時間（30、60、90、120、150 min）、和微波提取功率（100、200、400、600、800 W）對凝脂蓮莖稈香精提取率的影響。

1.5 正交試驗設計

通過單因素實驗考察，固液比發生變化會影響微波功率下微波集中吸收量，改變香精的提取率，兩者互相影響，不可同時改變，故以固液比為1∶8，凝脂蓮莖稈香精得率為考察指標，選擇浸泡時間、微波功率和提取時間3 個因素進行正交試驗，因素水平設計見表1，結果見表4、表5。

表1 微波輔助水蒸氣法提取凝脂蓮莖稈香精的水平因素Tab.1 Level factors of extracting essential oil from stem of S. clavatum by microwave-assisted hydro-distillation (MAHD)

2 結果與分析

2.1 葉片與莖稈香精提取率

由表2 可知，凝脂蓮葉片與莖稈的香精提取率相對比，莖稈的香精提取率要遠高于葉片，但是莖稈的香精提取時間大約為葉片香精提取時間的兩倍，耗時差異較大可能是因為莖稈處細胞間隙較大，組織細胞充分膨脹裂開時間較久。

表2 微波輔助水蒸氣法對凝脂蓮葉片與莖稈香精的提取率Tab. 2 Yield of essential oil from leaves and stems of S. clavatum by MAHD

2.2 植株、葉片、莖稈香精成分分析

在上述色譜與質譜條件下，得到凝脂蓮植株、莖稈、葉片香精氣相色譜-質譜總離子流量圖，如圖1。共檢測出39 種主要化學成分，凝脂蓮香精組分分析鑒定結果見表3。由圖1、表3 可得，從凝脂蓮植株香精揮發物中共鑒定出17 種主要化學物質，其中烯烴類7 種，占總揮發物質種數的39.58%；酸類3 種，占總揮發物質種數的11.18%，脂類2 種，占總揮發物質種數的6.63%。主要揮發物成分及占總揮發物質種數比例是1R-α-蒎烯（15.50%）、(+)-α-長葉蒎烯（10.82%）、檸檬烯（8.95%）、軟脂酸（6.27%）、9,12-十八碳二烯酸丁酯（3.92%）、3,5-二叔丁基-4-羥基苯基丙酸（3.76%）。從凝脂蓮莖稈所提取的香精揮發物中鑒定出14 種化學物質，其中烯烴類3 種，占總揮發物質種數的5.45%；醇類3 種，占總揮發物質種數的36.94%，無醛類。主要揮發物成分及占總揮發物質比例是桉葉油醇（31.40%）、2,4-二叔丁基苯酚（12.04%）、皮蠅磷（7.88%）、異辛烷（6.04%）。從凝脂蓮葉片所提取的香精揮發物中鑒定出8 種化學物質，其中酮類2 種，占總揮發物質種數的3.95%；醇類1 種，占總揮發物質種數的10.15%，無烯烴類。主要揮發物成分及占總揮發物質種數比例是2,4-二叔丁基苯酚（28.38%）、4-萜烯醇（10.15%）、2,6-二羥基苯乙酮，雙（三甲基甲硅烷基）醚（8.95%）、油酸腈（6.18%）。

圖1 凝脂蓮香精氣相色譜-質譜總離子流量圖Fig. 1 GC-MS total ion current of volatile aromatic compounds from S. clavatum essential oil

表3 凝脂蓮香精組分分析（主要成分）Tab. 3 Components of essential oil of S, clavatum

2.3 單因素對凝脂蓮莖稈香精提取率的影響

2.3.1 固液比對凝脂蓮香精提取率的影響 研究凝脂蓮莖稈干樣與水的各種比例對凝脂蓮香精提取率的影響，結果如圖2。由圖2 可知，不同固液比對凝脂蓮香精提取率的影響比較明顯，隨著水量的增加，提取率增加，這是因為更多的極性水滲入植物器官與腺體，當傳輸系統中存在極性分子相互作用時，導致局部過熱，更多的極性水會使植物體內的壓力梯度增加，細胞壁破裂，導致香精成分更容易被釋放到溶液中去。當固液比在1∶8 時，莖稈的香精提取率最高，隨著水的比例持續增加，香精在水中的溶解度增大導致水介質中香精含量損失[20]，香精提取率降低。

圖2 不同固液比對香精提取率的影響Fig. 2 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction rate of essential oil

2.3.2 浸泡時間對凝脂蓮香精提取率的影響 浸泡時間對凝脂蓮香精提取率的影響，結果如圖3 所示。由圖3 可知，浸泡時間從60 min 到150 min 之間，香精提取率相對穩定，其中，浸泡時間為60 min 時，香精提取率相對較高，浸泡60 min 后，香精提取率下降，在120 min 到150 min 之間時，香精提取率又上升，但未超越浸泡60 min 時的香精提取率，因此，確定最佳浸泡時間為60 min。

圖3 不同浸泡時間對香精提取率的影響Fig. 3 Effect of different soaking time on the extraction rate of essential oil

2.3.3 微波功率對凝脂蓮香精提取率的影響 微波功率對凝脂蓮香精提取率的影響，結果如圖4 所示。由圖4 可知，揮發性香精的提取率會隨著微波功率的增加而增加，這是由于在較高的微波功率下，微波能集中被水吸收，從而提高了凝脂蓮揮發性香精的釋放率，當微波功率超過400 W 時，更高的功率會使整個傳輸系統在短時間內發生相互碰撞，減少了香精的組分，因此微波最佳功率為400 W。

圖4 不同微波功率對香精提取率的影響Fig. 4 Effect of different microwave powers on extraction rate of essential oil

2.3.4 提取時間對凝脂蓮香精提取率的影響 提取時間對凝脂蓮香精提取率的影響，結果如圖5 所示。由圖5 可以看出，隨著時間的增加，凝脂蓮揮發性香精的提取率不斷增加。因為提取時間增加植物細胞間隙增大，組織細胞充分膨脹，使細胞內、外液交換速度更快，有利于香精提取率的提高。在提取時間為3 h 時香精提取率達到頂峰，但提取3 h 之后，隨著香精在水中的溶解，精油提取率降低。綜合考慮，最佳提取時間為3 h。

圖5 不同提取時間對香精提取率的影響Fig. 5 Effect of different extraction time on the extraction rate of essential oil

2.4 正交試驗結果

由表4、表5 可知，微波輔助水蒸氣法提取凝脂蓮莖稈香精的各因素中，微波功率影響最大，其次是提取時間，浸泡時間影響最小，但三者影響均無顯著性。最佳提取工藝是A1B2C3，即浸泡時間60 min、微波功率400 W、提取時間3 h，固液比1∶8。

表4 微波輔助水蒸氣法提取莖稈香精正交試驗的結果Tab. 4 Result of orthogonal experiment on extraction of essential oil from stem by MAHD

表5 方差分析結果Tab. 5 ANOVA result

3 討論與結論

本研究采用GC-MS 測定發現凝脂蓮莖稈香精與植株香精重復成分為2 種，分別是1R-α-蒎烯、石竹烯，在原植株揮發物總種數中占比分別為15.60%、1.31%。而葉片所提取的香精與植株香精無重復成分。將兩者對比，莖稈香精在重復成分以及香精的含量上都要高于葉片香精。凝脂蓮莖稈香精成分中含有大量的醇類及烯烴類化合物，相對于王利國等[21]采用GC-MS 檢測梔子Gardeniajasminoides花香精化學成分主要有酯類、萜烯類、烴類化合物；劉更濤[22]采用GC-MS 檢測牡丹Paeoniasuffruticosa香精化學成分主要有醛類及醇類化合物。上述報道中有關凝脂蓮香精成分與其他植物香精成分差異較大，推測主要原因可能與植物本身特性以及各自的提取方法有關，有待于進一步深入研究闡明。

本研究中使用凝脂蓮莖稈來提取香精效果要遠高于葉片提取香精效果。原因有以下幾個方面：第一，葉片香精提取率遠低于莖稈香精提取率，大約只有莖稈香精提取率的1/4；第二，由于其葉片為肉質結構，在干燥烘干過程中一旦沒有事先切出小口容易發生爆裂，而莖稈干燥烘干則無爆裂危險。遂在單因素實驗和正交試驗中只考慮對莖稈香精的提取率影響。由單因素實驗和正交試驗可知，在實驗室環境下，在固液比1∶8、浸泡時間60 min、微波功率400 W、提取時間3 h 的條件下，凝脂蓮香精提取率最高，平均提取率達到了0.96%，在現實產業化過程中，此數據可供參考。通過實驗研究我們可以得到，無論是在提取率還是在香精成分研究上都是使用莖稈來提取為優。再加上實際中，凝脂蓮由于其葉片厚實，莖稈香精含量高[23]，大多使用葉片“葉插”繁殖，且春秋為凝脂蓮的生長季，所以在實際產業化時，可以采用“春秋葉片扦插，冬夏莖稈提取”的輪作型產業方式。對凝脂蓮的香精成分分析旨在通過對其揮發物成分進行定性和定量分析[24]，同時為今后對凝脂蓮的其他科學研究提供參考價值。