山核桃茶藨子葡萄座腔菌全基因組的分泌蛋白預測和功能分析

吳怡豪，諸葛君昊，張立華，周樂，杜盛楠，杜世平，蘇秀

( 1. 浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300；2. 泰順縣自然資源和規劃局，浙江 溫州 325500；3. 臨海市河頭鎮農業綜合服務中心，浙江 臨海 317034 )

茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea屬子囊菌門Ascomycota、座囊菌綱Dothideomycete、葡萄座腔菌目Botryosphaeriales、葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae、葡萄座腔菌屬Botryosphaeria真菌[1-2]，其分布極為廣泛，可以侵染多種經濟林、用材林、園林綠化林木，如蘋果Maluspumila、梨Pyrusp.、桃Prunuspersica、核桃Juglans regia、葡萄Vitisvinifera、楊Populussp.、桉Eucalyptussp.[3-10]等，導致嚴重的果實損失和生產減產。該菌可引起山核桃干腐病Macrophomacaryae，對山核桃Caryacathayensis的產量和品質產生了顯著的負面影響[11]。因此，對于了解茶藨子葡萄座腔菌的致病機理以及篩選抗病品種的研究具有重要的實踐意義，可以為山核桃生產提供有力的支持，減少果實損失，維護生產穩定性和生態平衡。

病原菌產生的分泌蛋白與寄主抗性基因的蛋白產物之間的分子互作是病原菌與寄主之間互作的核心[12-13]，分泌蛋白在其中起著重要的作用。研究表明，黃曲霉Aspergillusflavus通過分泌一些細胞外酶和毒素來侵染寄主，這些酶可以破壞宿主細胞壁和木質素，可以誘導宿主細胞凋亡和壞死，從而使得該菌對宿主的感染更加容易發生[14]；果樹炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides分泌的氧化還原酶可以降低植物的抗氧化能力，導致宿主細胞的損傷和死亡[15]；稻瘟菌Magnaportheoryzae利用分泌外源蛋白，包括纖維素酶、蛋白酶和細胞壁水解酶等，破壞植物細胞壁和膜結構，從而增加了其侵染的能力。此外，該病原體還釋放毒素，如稻瘟菌素和谷氨酰胺酰胺酶，導致植物細胞的死亡和壞死[16]。分泌蛋白不僅對真菌自身的生長和代謝有重要的調節作用，還能夠通過對植物細胞的破壞、毒素的作用等方式，導致植物的損傷和病害發生。因此，研究茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白的功能和作用機制，對研究該病害的發病機理與防控具有重要意義和應用價值。

茶藨子葡萄座腔菌全基因組測序數據的公開，為開展該菌分泌蛋白的研究提供了堅實的基礎。本研究以山核桃茶藨子葡萄座腔菌BDLA16-7 的全基因組蛋白序列為基礎，以經典分泌蛋白特征為依據，結合Augustus、SignalP、Funannotate、WoLF PSORT、Ensembl Fungi、GenomeTools 等網站和軟件，對BDLA16-7 的分泌蛋白組進行了預測和功能分析，為進一步深入研究該病原菌與寄主互作的分子機制提供了基礎，并為挖掘病原菌關鍵致病基因提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

山核桃茶藨子葡萄座腔菌BDLA16-7 是從浙江省杭州市臨安區的一棵患有潰瘍病的山核桃樹的樹干上分離出的山核桃茶藨子葡萄座腔菌菌株。最初，該真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上的菌落呈淡白色，隨后逐漸轉變為黑色。子囊座pycnidia通常是單獨存在的，呈灰黑色、球形，并被菌絲覆蓋。該菌株的基因組DNA 和mRNA是從培養了10 天的菌絲體中提取而得。山核桃茶藨子葡萄座腔菌BDLA16-7 全基因組蛋白質氨基酸序列，來自中國生物信息中心（CNCB-NGDC 成員和合作伙伴2021）的基因組倉庫（GWH）（https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/），注冊號為GWHBEBO00000000，原始序列來自CNCBNGDC 的基因組序列檔案（https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/）上公開訪問，登錄號為CRA004612（生物項目PRJCA005744）[17]。

1.2 預測方法

1.2.1 茶藨子葡萄座腔菌全基因組蛋白N-端信號肽預測 使用SignalP 5.0 在線工具(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)和Phobius (https://phobius.sbc.su.se/)來預測基因組編碼的所有蛋白質是否帶有N-端信號肽[18]。

1.2.2 茶藨子葡萄座腔菌蛋白的亞細胞定位 使用蛋白亞細胞定位在線預測軟件Cell-PLoc 2.0[19](http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)來確定帶有N-端信號肽的蛋白質的亞細胞定位。

1.2.3 茶藨子葡萄座腔菌分泌型蛋白的跨膜結構預測 使用蛋白跨膜結構預測軟件TMHMM[20](https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM)，對全蛋白序列中具有信號肽且主要定位于細胞外的蛋白進行是否含有跨膜結構預測。

1.2.4 茶藨子葡萄座腔菌分泌型蛋白的錨定位點預測 使用GPI 錨定位點預測軟件GPI-SOM(http://gpi. unibe.ch)[21]，對全蛋白序列中具有信號肽、主要定位于細胞外且不包含跨膜結構域的蛋白序列進行GPI 錨定位點的預測。

1.2.5 分泌蛋白中效應蛋白的預測和功能分析 使用EffectorP3.0(http://effectorp.csiro.au)[22]軟件對全蛋白序列中具有信號肽、主要定位于細胞外、不包含跨膜結構域且不包含GPI 錨定位點的蛋白序列進行效應蛋白的預測。同時，通過eggnog-mapper[23]數據庫和Pathogen Host Interactions[24]數據庫對預測出的效應蛋白的組成和功能進行分析。

1.2.6 分泌蛋白中碳水化合物活性酶類預測和功能分析 使用CAZymes 在線預測工具dbcan[25]（http://bcb.unl.edu/dbCAN2/）中的HMMER、DIAMOND 和HOTPEP 程序，對分泌蛋白中的碳水化合物活性酶進行預測和功能注釋。

2 結果與分析

2.1 山核桃茶藨子葡萄座腔菌全基因組蛋白N-端信號肽預測

BDLA16-7 基因組編號為GWHPBEBO000001 到GWHPBEBO013130，總共編碼了13 130 條蛋白質序列。通過使用SignalP 5.0 和Phobius 軟件進行分析，結果表明其中含有N-端信號肽序列的有1 402 條蛋白質序列，占總蛋白質序列數量的10.67%。這些具有N-端信號肽序列的蛋白質全部屬于標準的Sec/SPI 型分泌蛋白質，它們會在信號肽序列的引導下進入細胞的內質網腔中。

2.2 山核桃茶藨子葡萄座腔菌全基因組蛋白的亞細胞定位

在BDLA16-7 全基因蛋白序列中，將含有信號肽的1 402 條蛋白序列經Cell-PLoc 2.0 軟件分析發現，其中有1 188 條蛋白序列屬于胞外分泌型，而其余214 條序列雖然具有信號肽，但其并不分泌到細胞外，而是轉運到了細胞中不同的細胞器或質膜上。

2.3 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌型蛋白的跨膜結構預測

在BDLA16-7 全基因蛋白序列中，有一些蛋白具有信號肽序列，并且屬于胞外分泌型。經過跨膜結構域預測軟件TMHMM 分析，發現1 188 條胞外分泌型蛋白序列中，有97 條蛋白序列具有跨膜區。因此，這些序列有可能是離子通道蛋白、膜錨定蛋白或膜受體蛋白，而無法分泌到細胞膜外。除此之外的1 091 條蛋白序列沒有跨膜結構域，具有典型的分泌蛋白特征。

2.4 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌型蛋白的GPI 錨定位點預測

在BDLA16-7 全基因蛋白序列中，有一些蛋白具有信號肽序列，屬于胞外分泌型蛋白，并且沒有跨膜結構域。經過GPI-SOM 軟件預測，發現1 091 條蛋白序列中有193 條含有GPI 錨定位點，不符合經典的分泌型蛋白特征，因此將其去除。除此之外，有898 條分泌型蛋白序列不含GPI 錨定位點，符合經典的分泌蛋白特征，因此將其認定為BDLA16-7 的分泌蛋白組（表1）。

2.5 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組特征分析

2.5.1 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組的氨基酸長度分析 對BDLA16-7 分泌蛋白組的序列長度進行分析，發現分泌蛋白的長度分布跨度較大。其中，存在長度小于100 個氨基酸的小分子蛋白，最短的為66 個氨基酸；同時也存在長度超過1 000 個氨基酸的大分子蛋白，最長的蛋白為2 028 個氨基酸。分泌蛋白的氨基酸長度主要分布在100～600 個氨基酸范圍內，共有721 條序列，占分泌蛋白序列總數的80.29%（圖1）。

圖1 山核桃茶 藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質組的長度分布Fig. 1 Length distribution of secretory proteome of B. dothidea

2.5.2 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組的氨基酸組成分析 在BDLA16-7 分泌蛋白組的氨基酸組成分析中，發現不同的氨基酸含量有顯著差異，按照含量從高到低的順序排列如下：A 丙氨酸、G 甘氨酸、S 絲氨酸、L 亮氨酸、T 蘇氨酸、V 纈氨酸、P 脯氨酸、D 天冬氨酸、N 天冬酰胺、E 谷氨酸、I 異亮氨酸、F 苯丙氨酸、Y 酪氨酸、Q 谷氨酰胺、R 精氨酸、K 賴氨酸、W 色氨酸、H 組氨酸、C 半胱氨酸、M 蛋氨酸，氨基酸可以被分為不同的類別。其中，非極性疏水氨基酸（A、G、L、V、P 和I）的含量最高，占總含量的43.6%，顯示出明顯的優勢，親水的極性氨基酸（S、T、N、Q、M 和C）的含量相對較低，為27.7%；酸性氨基酸（A 和E）的含量為14.8%，堿性氨基酸（K、R、H）的含量為8.7%，芳香族氨基酸（F、Y 和W）的含量為9.7%（圖2）。

圖2 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質組中氨基酸組成比例Fig. 2 Composition of amino acids of secretory proteome of B. dothidea

2.5.3 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組信號肽的氨基酸長度分析 BDLA16-7 分泌蛋白組中的信號肽序列具有不同的氨基酸長度，這個長度范圍從14 到41 個氨基酸。在這些信號肽序列中，長度為16 到24 個氨基酸的序列最為常見，總共有806 個，占了分泌蛋白組總數的89.76%。其中，信號肽長度為19 個氨基酸的序列最多，共有169 個，占了分泌蛋白組總數的18.82%。其次，長度為18 個氨基酸的信號肽序列有132 個，占了分泌蛋白組總數的14.70%。相反，信號肽長度為31、35、39 和41 個氨基酸的序列最為罕見，每個長度僅有1 個序列（圖3）。

圖3 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質組信號肽長度分布Fig. 3 Length distribution of signal peptides of secretory proteome B. dothidea

2.5.4 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組信號肽的氨基酸組成分析 根據對BDLA16-7 分泌蛋白組信號肽的氨基酸組成進行的分析，發現20 種氨基酸在信號肽中的出現頻率存在顯著差異，按頻率從高到低排列如下：A、L、S、V、T、M、F、I、G、P、R、K、Q、H、C、N、Y、W、D 和E。其中，非極性氨基酸丙氨酸（A）的出現頻率最高，占總出現頻率的22.40%，亮氨酸（L）的出現頻率次之，為19.29%。相反地，天冬氨酸（D）和酸性氨基酸谷氨酸（E）的出現頻率最低，分別僅為0.29%和0.27%（圖4）。

圖4 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質組信號肽中氨基酸組成比例Fig. 4 Composition of amino acids of signal peptides of secretory proteome in B. dothidea

2.5.5 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組信號肽切割位點分析 通過對BDLA16-7 分泌蛋白組信號肽的切割位點（-3 到+2 位點）進行統計分析，得到以下結果：在-3、-2、-1、+1 和+2 位點出現頻率最高的氨基酸分別為A、S、A、A 和P，它們分別占據了50.56%、18.93%、81.74%、25.61%和37.08%的比例。具體來說：在-3 位點，除了A 之外，V（24.28%）和S（8.91%）也比較常見，而E、F、H、K、M、N、W 和Y 沒有被使用。在-1 位點，除了A 之外，G（8.24%）和S（5.90%）也相對常見，而D、E、H、I、L、M、N、V、W 和Y 沒有出現。在-2、+1 和+2 位點，所有的氨基酸都被使用。這些結果表明，在BDLA16-7 分泌蛋白組信號肽中，切割位點-3 和-1 位置上的氨基酸相對來說比較保守，可能在信號肽酶的識別過程中起到關鍵作用。其他位點則更加多樣化，容納了各種不同的氨基酸（表2）。

表2 信號肽酶切割位點周圍20 個氨基酸殘基的頻率Tab. 2 The frequency of 20 amino acid residues around the signal peptidase cleavage sites

2.5.6 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組的功能注釋

通過使用eggnog-mapper 數據庫、PHI 數據庫和Geneious Prim Trial 數據庫對BDLA16-7 分泌蛋白組的898條序列進行功能分析。結果表明，共有600 條序列可以被注釋到具有完整功能。通過COG（Clusters of Orthologous Genes）數據庫對這些功能進行分類，發現最多的分泌蛋白被歸類為G 類，即碳水化合物的運輸和代謝（Carbohydrate transport and metabolism），總共有229 條序列歸入這一類別。其次是S 類，即功能未知類（Function unknown），其中包括一些蛋白的結構域和功能未知的蛋白，如酪氨酸酶中心結構域（Comon central domain of tyrosinase）、泛素3 綁定蛋白But2 的C-端結構域（Ubiquitin 3 binding protein But2 C-terminal domain）、DUF3129和DUF3455 等，總共有152 條序列歸入這一類別。其他類別：O 類蛋白翻譯后修飾和分子伴侶（Post-translational modification, protein turnover, chaperones）86 條序列，E 類氨基酸運輸和代謝相關（Amino acid transport and metabolism）44 條序列，C 類能量產生和轉化相關（Energy production and conversion）24 條序列，以及Q 類次生代謝物的生物合成、轉運和分解相關（Secondary metabolites biosynthesis transport and catabolism）23 條序列。其余的功能分類包含的分泌蛋白數目較少，沒有超過10 個。這些分析結果揭示了BDLA16-7 分泌蛋白組的功能多樣性，其中大部分分泌蛋白與碳水化合物代謝相關，但也包含一些功能未知的蛋白以及其他生物學功能。這種功能分類有助于理解這些蛋白在生物體內的作用和生物過程中的角色（圖5）。

圖5 山核桃茶 藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質組的COG 目錄Fig. 5 COG catalog of the secretory proteome of B. dothidea

2.6 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組中效應蛋白的預測和功能分析

BDLA16-7 分泌蛋白組經TargetP 2.0 Server 軟件分析，再次確認898 條蛋白序列全部含有信號肽，并可以分泌到細胞外。繼而通過效應蛋白預測軟件EffectorP 3.0 對潛在的效應蛋白進行預測，結果發現271 條蛋白序列可被預測為效應蛋白，占分泌蛋白總數的30.18%。其中101 條序列可以被eggnog-map 數據庫注釋到具體的功能，其中42 條序列在COG 分類中屬于S 類，主要包括蛋白結構域和功能未知的蛋白，如：IgE 綁定蛋白（Ig Ebinding protein）、Cupin 家族蛋白、成束蛋白結構域（Fasciclin-domain）、CFEM 結構域（CFEM-domain）等，41 條序列屬G 類，14 條序列屬于O 類，2 條序列屬于C 類，1 條序列屬于A 類RNA 加工和修飾相關（RNA processing and modification），1 條序列屬于E 類（圖6）。

圖6 山核桃茶藨子葡萄座腔菌的效應蛋白質組COG 目錄Fig. 6 COG catalog of the effector proteome of B. dothidea

對預測為潛在效應蛋白的271 條序列，經PHI 數據庫Blastp 比對，有14 條序列可以比對到相應的致病功能注釋。其中 1 條序列（GWHPBEBO006248）可以比對到黃曲霉的致病效應蛋白序列，1 條蛋白序列（GWHPBEBO004805）可以比對到禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum和黃單胞菌Xanthomonasaxonopodis的致病效應蛋白序列，1 條蛋白序列（GWHPBEBO011899 和GWHPBEBO003128）可以比對到寄生疫霉Phytophthora parasitica的致病效應蛋白序列，1 條蛋白序列（GWHPBEBO008334）可以比對到稻瘟菌的致病效應蛋白序列，2 條序列（GWHPBEBO008083 和GWHPBEBO000994）可以比對到禾谷鐮刀菌的致病效應蛋白序列，2 條蛋白序列（GWHPBEBO006043 和GWHPBEBO006222）可以比對到擴展青霉Penicilliumexpansum的致病效應蛋白序列，5 條蛋白序列（GWHPBEBO010105、GWHPBEBO006002、GWHPBEBO003061、GWHPBEBO003727 和GWHPBEBO001912）與褐腐菌Moniliniafructicola致病性增強的效應蛋白序列有較高的相似性，其同時也與柑橘褐斑菌Alternariaalternata的致病效應蛋白序列存在較高的相似性。

2.7 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白組中碳水化合物活性酶類（CAZymes）預測

碳水化合物活性酶類（CAZymes）是病原菌分泌蛋白組的重要組成部分，其主要參與對寄主細胞壁的降解作用，與病原菌的致病性有緊密的聯系。利用HMMER、DIAMOND 和HOTPEP 三個軟件，在BDLA16-7 分泌蛋白組898 條蛋白序列，共預測到293 個分泌蛋白屬于CAZymes 酶類，分屬于糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases,GHs）、氧化還原酶（Auxiliary Activities, AAs）、糖酯酶（Carbohydrate Esterases, CEs）和多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases, PLs）四個分類，占總分泌蛋白數的32.26%。其中基于序列相似性的HMMER 軟件預測發現282 個分泌蛋白屬于CAZymes，基于結構域的DIAMOND 和HOTPEP 軟件分別預測到了188 個和275個分泌蛋白屬于CAZymes。三個軟件都預測到CAZymes 的數量為169 個（圖7）。

圖7 Hmmer Diamond 和Hotpep 對山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質組碳水化合物酶類預測結果Fig. 7 CAZymes prediction on secretory proteome of B. dothidea by Hmmer diamond and Hotpep

在預測到的169 個CAZymes 中，GHs 數量最多為99 個，主要包括GH3、GH28、GH92、GH1 和GH31 等多個亞家族；其次為AAs，有42 個，主要包括AA3_2、AA1_3、AA3 和AA9 等亞家族；CBMs 為12 個，主要包括CBM1、CBM35 和CBM18 等亞家族；PLs 為9 個，包括PL1_4、PL3_2 等亞家族；CEs 為6 個，包括CE0、CE1、CE16、CE4 和CE8 亞家族；CTs 的數量最少，為1 個，屬于GT32 亞家族（圖8）。

圖8 山核桃茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質組碳水化合物酶類亞家族分布預測Fig. 8 Prediction of distribution of carbohydrate enzyme subfamily in secretory proteome of B. dothidea

在BDLA16-7 分泌蛋白組的169 個CAZymes 中，參與寄主細胞壁纖維素、木聚糖和果膠降解的CAZymes數量有85 個，而在絲孢堆黑粉菌Sporisoriumreilianum、玉蜀黍黑粉菌Ustilagomaydis、水稻稻瘟病病菌Magnaporthegrisea、禾谷鐮刀菌、灰葡萄孢Botrytiscinerea、大麗輪枝菌Verticilliumdahliae分別有26、30、128、127、87、165 個（表3）[32]。

表3 不同營養類型真菌參與寄主細胞壁纖維素、木聚糖和果膠降解的CAZymes 數量Tab. 3 The number of CAZymes involved in the degradation of host cell wall cellulose, xylan and pectin by different trophic fungi

3 討論

病原真菌分泌蛋白的預測最為重要的是對信號肽進行預測。為了提高信號肽預測的準確性，本文通過SignalP 和Phobius 相結合的方法，排除了與信號肽具有相似結構導肽（transit peptide）的影響，保證了含有信號肽分泌蛋白預測的準確性。通過Cell-PLoc 2.0、TMHMM、GPI-SOM、EffectorP3.0、dbcan 等軟件的分析，本文成功預測了山核桃茶藨子葡萄座腔菌BDLA16-7 分泌蛋白組898 條蛋白序列，占其蛋白序列總條數的6.84%；與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum（7.5%）[26]、假禾谷鐮孢菌Fusariumpseudograminearum（5.5%）[27]、新月彎孢菌Curvularialunata（7.7%）[28]、禾谷炭疽菌Colletotrichumgraminicola（5.2%）[29]分泌蛋白在全基因組蛋白序列中所占的比例相似。

分析BDLA16-7 分泌蛋白組的氨基酸構成顯示，非極性疏水氨基酸（包括A、G、L、V、P 和I）的含量為43.6%，明顯高于親水極性氨基酸（S、T、N、Q、M 和C）的含量（27.7%）。這表明，分泌蛋白通常需要在其折疊和穩定化過程中形成一個疏水核心結構。這個核心結構有助于保護蛋白質免受水分子和其他極性分子的干擾，同時有助于維持蛋白質的結構完整性，從而使其能夠正確履行其功能。特別值得注意的是，信號肽長度為19 個氨基酸的分泌蛋白數量最多，這可能意味著這個長度的信號肽對于茶藨子葡萄座腔菌分泌蛋白質的正確轉運和定位至關重要。這也可能是生物進化過程中的結果，即這個長度的信號肽的功能在生物進化中被保留下來并廣泛應用。需要強調的是，這個結論是基于統計學推斷的，不一定適用于所有分泌蛋白。此外，需要進一步的研究來驗證這一結論，并探索不同長度信號肽的功能和進化意義。對于BDLA16-7 分泌蛋白組的信號肽氨基酸構成，發現20 種氨基酸在信號肽中的出現頻率存在較大差異。前六位出現頻率最高的氨基酸均為脂肪族氨基酸，這可能與信號肽需要穿越細胞質膜有關。此外，分泌蛋白組的信號肽切割位點在-3 和-1 位置的氨基酸相對保守，其氨基酸組成為A-S-A，屬于A-X-A 型，這是真核生物中相對典型的信號肽切割位點，可被SpaseI 型信號肽酶所識別。

效應蛋白（effector）是一種在植物病原微生物中廣泛存在的重要致病因子，它們通過干擾寄主植物的免疫反應來感染宿主[30]。因此，效應蛋白既是病原微生物致病的關鍵分子，也是用于篩選植物抗病性基因的重要工具[31]。研究表明，在對葡萄座腔菌效應蛋白預測中，預測為潛在效應蛋白的119 條序列，有11 條序列可以比對到相應的致病功能注釋[32]。當在對BDLA16-7 分泌蛋白組效應蛋白的預測中，我們發現271 條序列（30.18%）符合效應蛋白的定義，其中101 條序列可以被eggnog-map 數據庫注釋到具體的功能，經PHI 數據庫Blastp 比對，有14 條序列可以與黃曲霉、禾谷鐮刀菌、黃單胞菌、寄生疫霉、稻瘟菌、擴展青霉、褐腐菌、柑橘褐斑菌比對到相應的致病功能注釋，其中5 條蛋白序列與褐腐菌M.fructicola致病性增強的效應蛋白序列有較高的相似性，但其同時也與柑橘褐斑菌A.alternata致病性降低的致病效應蛋白序列存在較高的相似性。相比較而言，我們研究比對的潛在效應蛋白序列更多（271 條），這意味著它在研究潛在效應蛋白與致病菌之間的關系時有更多的數據支持，可以提供更全面的信息；比對到的致病菌種類更多，從細菌到真菌，從黃曲霉到寄生疫霉等，這增加了研究的多樣性和廣泛性。但目前尚不清楚這些潛在的效應蛋白如何具體影響茶藨子葡萄座腔菌的致病性，需要進一步通過實驗手段來驗證和研究其功能。

CAZymes（碳水化合物活性酶類）在真菌中指的是一組各種酶類，參與碳水化合物的分解和代謝，這些酶在生物質降解、病原菌感染宿主、形態變化、寄生植物侵染以及真菌與寄主的相互作用等方面發揮著作用[33]。為了準確預測BDLA16-7 中的CAZymes 數量，我們使用了三種不同的軟件，包括Diamond、Hmmer 和Hotpep，通過對這三種軟件的預測結果求交集的方法來進行預測。在眾多CAZymes 中，特別是在直接參與植物細胞壁成分降解的GH、AA、PL 和CE 亞家族中，這些酶發揮著關鍵作用[34]。在三種軟件都預測到的169 個CAZymes中，GHs 數量最多，共有99 個，這些亞家族主要負責果膠和纖維素的降解。此外，BDLA16-7 的CAZymes 中還包括大量的輔酶模塊，其中AAs 有42 個，PLs 有9 個，CEs 有6 個，這進一步增強了茶藨子葡萄座腔菌對細胞壁的降解能力，有助于病原菌成功侵染寄主植物。許多研究表明，植物病原真菌分泌的CAZymes 與其寄生性之間存在一定的相關性[35]。通常認為，寄生性更強的植物病原真菌編碼的胞外CAZymes 數量較少[36]。通過比較不同營養型真菌的CAZymes 數量，本研究發現，半活體營養型的茶藨子葡萄座腔菌中，參與寄主細胞壁纖維素、木聚糖和果膠降解的CAZymes 數量與活體營養型真菌相比顯著增加，但與死體營養型真菌相比，CAZymes數量基本相同或更少。這一研究結果與對終極腐霉Pythiumultimum[37]、穎枯殼多孢Stagonosporanodorum[38]、大麗輪枝菌[39]等非活體營養型病原菌CAZymes 數量的研究結果相一致。

4 結論

本文以山核桃茶藨子葡萄座腔菌BDLA16-7 全基因組蛋白序列為基礎，采用生物信息學的方法，對BDLA16-7 分泌蛋白組進行了預測，明確了BDLA16-7 分泌蛋白的長度分布特征，功能分類、信號肽切割位點的氨基酸組成、切割位點的類型和CAZymes 數目，以及CAZymes 中纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶的亞家族組成，并篩選到14 個GWHPBEBO0（06248、04805、11899、03128、08334、08083、00994、06043、06222、10105、06002、03061、03727、01912）與致病性緊密聯系的潛在效應蛋白，為從分子水平上解析茶藨子葡萄座腔菌的致病機理奠定了基礎。