流式細胞儀樣品預處理系統的設計與實現

欒永勝 ，劉佳琳 ，劉 萍 ，吳學麗 ，周 娜 ，欒傳磊

（1.山東省煙臺生態環境監測中心，山東 煙臺 264000；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所公共技術中心，山東 煙臺 264000）

流式細胞儀是一種用于單個細胞多參數快速分析的先進儀器，能對處在快速直線流動狀態中的單細胞或生物顆粒進行多參數、快速的定量分析和分選.檢測時，樣品中的懸浮顆粒在鞘液的包被下呈單行排列，依次流經檢測區域.對于顆粒非熒光物質，在檢測區激光束照射在顆粒上時，由于顆粒大小和內部結構等的差異發出前向角散射光（forward scatter light，FSC）和側向角散射光（side scatter light，SSC），FSC 與被測顆粒的直徑密切相關，基本上可表征顆粒的大小，而SSC 受顆粒內部結構（如細胞質折射率、細胞器等）影響重大，反映的是細胞的復雜程度.而對于顆粒熒光物質，在激光的激發下能發出不同顏色的熒光，這些熒光信號的強弱代表了細胞顆粒內含有相關熒光物質的濃度大小.這些信號通過光電轉換器轉變成電信號被送往計算機分析系統，通過表征這些顆粒不同性質的光信號就可將不同類型的顆粒區分開[1-2].

由于流式細胞儀的工作原理是利用激光照射到單個細胞上產生信號的變化來進行分析，所以樣品的穩定性和均一性能夠直接影響流式細胞儀數據獲取的準確性.樣品的前處理是獲得理想流式細胞儀檢測結果的關鍵步驟之一，傳統的前處理方式是選用孔徑是48~74 μm 的尼龍篩網在樣品檢測之前對樣品進行過濾，但采用傳統方式前處理的樣品上機檢測時，易出現如下問題：（1）流式細胞儀的“單細胞”分析特性要求細胞樣品必須分散成單細胞狀態.由于篩網難以完全去除樣品中的粘連細胞，在上機檢測過程中粘連細胞會造成雙細胞或多細胞復合物“污染”，從而對單細胞數據的分析造成誤導.（2）由于細胞樣品自身的細胞多樣性，容易導致在散點圖中細胞分布范圍太廣泛，SSC-A（side scatter-area）及FSC-A（forward scatter-area）的變異系數（coefficient of variation，CV）值較大（流式細胞儀常用CV 值來表示數據的可信度.CV 值和標準偏差相關，代表的是一組數據分布的離散程度，數據越分散，CV 值越大，數據可信度越低.數值越集中，CV 值就越小，數據可信度越高）.尤其在分析海洋貝類動物細胞時，由于篩網難以有效去除樣品中主流細胞以外粒徑較大的細胞，導致散點圖中細胞“全屏分布”的現象更明顯，因而降低了樣品檢測的準確性.為了解決上述流式細胞儀傳統樣品前處理方法的不足，本工作研制了一套基于微流控芯片技術的流式細胞儀樣品預處理系統.微流控芯片是一種在微米尺度空間內對流體進行操控的技術，它將復雜的微通道集成于面積很小的芯片上，實現生物、化學分析的基本功能.微通道的特征尺寸與細胞尺寸相當，特征尺寸和速度很小，慣性作用可以忽略不計，但在壓力驅動下可以達到很高的流速（0.1~1 m/s），慣性效應開始顯現.雙螺旋微通道利用壓力驅動液體樣品，樣品粒子經過彎曲的管道，受到側向力和迪恩渦粘性阻力的共同作用，在橫截面內達到特定的平衡位置.橫向受力與尺寸相關，不同尺寸的粒子通過聚集在不同的側向位置而分離[3-5].該裝置可以實現對粒徑小于100 μm 的細胞或微粒的驅動和分選，無需對細胞進行標記處理，分選的細胞便于后續流式細胞儀檢測.

1 系統的開發

1.1 流式細胞儀樣品預處理系統的設計

所設計的流式細胞儀樣品預處理系統基于微流控技術，根據不同尺寸細胞特異的遷移機制以及影響細胞聚焦平衡位置的不同因素，實現對不同尺寸細胞的高通量分選.該系統主要包含微流控分選芯片和樣品驅動模塊兩部分（如圖1 所示），其中微流控分選芯片是整個系統的核心部件.

圖1 流式細胞儀樣品預處理系統工作示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sample pre-processing system for flow cytometer

系統整體設計如下：

（1）將所設計的芯片繪制成版圖，通過軟光刻技術將版圖印制在涂覆有SU-8 光刻膠的硅襯底上，形成制作微流控芯片的陽膜.利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作微流控芯片.

（2）搭建基于微流控技術的流式細胞儀樣品預處理平臺.如圖1 所示，該平臺主要包含微流控分選芯片和樣品驅動模塊.其中樣品驅動模塊采用多通道高精度壓力泵來控制樣品流速.

（3）分別選取不同粒徑的聚苯乙烯微球和海洋貝類動物血細胞進行分選性能驗證試驗，以此驗證本工作研發的預處理系統的可行性.

1.2 微流控分選芯片的設計與制作

選擇雙入口螺旋通道來設計微流控分選芯片，設計圖如圖2（a）所示.微流控分選芯片由直線管道和螺旋管道組成，采用雙入口對稱管道，由此可以形成雙鞘液包裹樣品流并使樣品流聚焦在直線管道中心位置，減少樣品流進入螺旋管道時的位置偏離.兩個螺旋轉向相反并以S 形通道相連，每個螺旋結構包含9 圈.共設有2 個入口，3 個出口.雙螺旋微通橫向受力與尺寸相關，不同尺寸的粒子通過聚集在不同的側向位置而實現分離.粒徑小的粒子更靠近通道內側壁面.

圖2 微流控分選芯片的（a）設計圖及（b）實物圖Fig. 2 (a) Design and (b) physical drawings of microfluidic sorting chip

由圖2（b）微流控分選芯片實物圖可見，芯片由對稱管道、直線管道和螺旋管道三段構成.對稱管道、直線管道和螺旋管道依次連接.對稱管道的頂部中間位置連接鞘液入口，底部中間位置連接樣品入口，且和直線管道連通.螺旋管道設置有三個出口，三個出口分別為內出口、外出口、中出口.通過多通道壓力泵將鞘液容器中溶液注入鞘液入口，將樣品液容器中溶液注入樣品入口.芯片澆筑3 mm厚度，尺寸是65 mm×65 mm，與1 mm 厚度的載玻片鍵合.芯片管道尺寸寬300 μm，深100 μm，進口和出口孔徑為1 mm.

1.3 系統的搭建

流式細胞儀樣品預處理系統主要包含微流控分選芯片和樣品驅動模塊兩部分.樣品驅動模塊采用多通道壓力泵控制樣品流速，樣品的流速對慣性分選效果影響很大，通過調節壓力泵的壓強可以為系統提供穩定的樣品驅動速度（如圖3 所示）.

流式細胞儀樣品預處理系統工作流程如圖4所示，鞘液和樣品液通過壓力泵以不同流速分別注入鞘液入口和樣品入口，鞘液經對稱管道形成雙鞘液包裹樣品流進入直線通道，因雙鞘液流速和樣品液流速不同，二者在直線管道中形成層流，使樣品流聚焦在直線管道中心位置，減少樣品流進入螺旋管道時的位置差異，樣品進入旋轉管道后，在迪恩渦流作用下，矩形截面管道中不同大小的粒子在管道內外側的不同位置聚焦，最終實現目標細胞的分選.

圖4 流式細胞儀樣品預處理系統工作流程圖Fig. 4 Workflow chart of sample pre-processing system for flow cytometer

2 系統驗證

2.1 聚苯乙烯微球分選驗證試驗

為了驗證微流控芯片的分選性能以及本工作開發的預處理系統平臺的可行性和合理性，進行了不同粒徑尺寸的聚苯乙烯微球分選試驗.相對于柔性、多分散的細胞粒子而言，剛性的聚苯乙烯微球尺寸更加均一，且不會在剪切應力作用下發生變形，因而其遷移軌跡能更好地反映出流體運動規律，進而表征芯片的聚焦、分選性能.

本試驗采取3 μm 的聚苯乙烯熒光微球，模擬具有相似尺寸的雙殼貝類淋巴血細胞，即小粒子.采用25 μm 的聚苯乙烯熒光微球模擬粘連細胞或大粒子雜質，即大粒子.將兩種顆粒以體積比1︰1加入去離子水中，制作成混合顆粒懸浮液，使每毫升含有1×105個顆粒.取1 mL 混合顆粒懸浮液直接于流式細胞儀檢測，剩余混合顆粒懸浮液進行微流控芯片的分選性能驗證試驗.

樣品入口壓強設為9×106Pa，鞘液入口壓強設為4.5×107Pa，樣品和鞘液分別從樣品入口和鞘液入口注入通道內.內、中、外三個出口用于收集分選后的樣品.小粒子聚焦于通道內側，最終從內出口流出.大粒子聚焦于通道外側，最終從外出口流出.多余的鞘液從中間出口流出.

將三個樣品收集管中的樣品分別于流式細胞儀檢測，聚苯乙烯熒光微球混合樣品經分選預處理后，SSC-A 和FSC-A 的CV 值明顯降低，大粒子和小粒子分選效果明顯（表1 所示）.這表明流式細胞儀樣品預處理系統對不同粒徑聚苯乙烯熒光微球混合樣品分選效果明顯，通過分選預處理成功分選了粒徑分別為3 μm 和25 μm 的聚苯乙烯熒光微球，增加了流式細胞儀檢測結果的準確性.

表1 聚苯乙烯熒光微球混合樣品經樣品預處理分選前后的流式細胞儀分析變異系數Table 1 Coefficients of variation (CV) of mixed samples of polystyrene fluorescent microspheres before and after preprocessing by flow cytometer/%

2.2 細胞分選驗證試驗

太平洋牡蠣為雙殼貝類，屬于底棲生物、濾食性動物，相比于其他海洋生物，更容易蓄積自然界中難以降解的且易于在生物體內蓄積的污染物.其受到污染物的脅迫后能激發免疫防御反應，因而常被作為指示生物來進行海岸帶環境毒理學研究.太平洋牡蠣的血液循環為開管式循環，免疫防御依靠細胞和體液成分介導，由細胞免疫和體液免疫共同組成免疫防御系統以抵御外界刺激，一般通過借助流式細胞儀完成對太平洋牡蠣淋巴血細胞的分析、分選，進而來開展海岸帶環境毒理學研究.因此試驗選取太平洋牡蠣為試驗樣本，抽取其淋巴血細胞用以驗證流式細胞儀樣品預處理平臺的細胞分選效果.

試驗所用太平洋牡蠣均購于煙大農貿市場，體長約10 cm.用注射器從外套膜腔中抽取血淋巴細胞，為防止細胞聚集，將抽取的血淋巴細胞迅速與預冷的等體積抗凝劑1︰1 混合置于50 mL 離心管中，將離心管靜置30 min 后取其上清液用于后續試驗.上清液經74 μm 篩絹過濾后，取1 mL 直接于流式細胞儀檢測，剩余樣品用于微流控芯片的細胞分選驗證試驗.

由于牡蠣血液循環為開管式循環，獲取的淋巴液樣品里除了粒徑為3.5~4.5 μm 的血淋巴細胞外，還有卵細胞等大粒子雜質.因此血淋巴細胞小粒子聚焦于通道內側，最終從內出口流出.卵細胞等大粒子聚焦于通道外側，最終從外出口流出.多余的鞘液從中間出口流出.

將未經分選預處理的樣品以及經本系統預處理的樣品分別在流式細胞儀上進行檢測，結果如圖5 所示.由圖5 可見，經分選預處理系統中內出口收集到的血淋巴細胞分析散點圖相較于未經分選預處理細胞分析散點圖分散更為集中，這表明本工作研發的流式細胞儀樣品預處理系統對牡蠣血淋巴細胞樣品分選效果明顯，通過分選預處理成功去除了血淋巴細胞樣品中的卵細胞等大粒子雜質，使樣品粒徑更加均一.

圖5 （a）未經分選預處理和（b）經分選預處理的樣品的細胞分析散點圖Fig. 5 Scatterplots of cellular analysis of (a) unsorted pre-treated and (b) sorted pre-treated samples

3 結論

流式細胞儀作為一種常見的實驗室儀器，具有強大的細胞分析分選功能，但一直以來其樣品前處理方法存在不足.本工作考慮了流式細胞儀對樣品“均一化”的需求，利用微流控細胞芯片技術，研制了一套流式細胞儀樣品預處理系統，整個分選過程無需對細胞進行標記處理，分選的細胞便于后續流式細胞儀檢測.通過聚苯乙烯微球和細胞的分選驗證試驗，表明了該系統可以實現對不同尺寸細胞的高通量分選，提高了細胞樣品的穩定性和均一性，進而實現流式細胞儀對樣品“均一化”的需求，增加了流式細胞儀檢測結果的準確性.