斑馬魚在化學品高通量毒性評價中的應用＊

王 俊 劉 力 徐穎君 劉俊杰 程 波 張 蒙 龐少臣** 梁 勇 宋茂勇,3

（1.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，武漢，430205；2.江漢大學持久性有毒污染物環境與健康危害湖北省重點實驗室，環境與健康學院，武漢，430056；3.中國科學院生態環境研究中心環境納米技術與健康效應重點實驗室，北京，100085）

1 化學品風險評估的新需求（Current requirements of chemicals risk assessment）

截至2022年美國化學文摘社（Chemical Abstracts Service,CAS）登記的現有化學品已達1.95 億種，且每日有數千種新開發的化學品登記入冊.全球化學品管理計劃，如《經濟合作與發展組織高產量化學品》（OECD High Production Volume Chemicals）、《美國國家環境保護局高產量化學品挑戰》（United States Environmental Protection Agency High Production Volume Challenge）和歐盟《關于化學品注冊、評估、授權和限制的規定》（Registration,Evaluation,Authorization and Restriction of Chemicals,REACH）等，都推出了“無數據，無市場”的指令，強制要求只有已知生態毒理學特性的化學品才會被授權商業化和引入市場[1?2].化學品毒性安全評估一般通過哺乳動物毒性測試來實現，一種新藥的開發也需要大量哺乳動物開展安全性評估.然而，隨著全球化學品的不斷增加和測試要求的不斷提高，傳統的毒性分析方法不僅存在成本高昂、效率低以及低劑量效應難以識別等問題，還面臨無法提供化學品發揮毒性的機理信息，在跨劑量、物種和生命階段的數據外推中存在不確定性等困境[3?4].并且，傳統的基于哺乳動物的毒性評價方式不符合“減少，替代，優化”的“3R”（Replacement,Reduction,Refinement）原則.因此，美國國家研究委員會提出了21 世紀毒性測試的新框架，呼吁利用現代計算化學、分子與細胞生物學工具加速發展以高通量體外測試和非哺乳類動物模型替代方法為主的毒性評價新模式[5].模式生物斑馬魚作為優秀的脊椎動物模型，已經成為化學品毒性評價的強大工具[6?7].

2 斑馬魚是高通量的藥物篩選和化學品毒性測試中重要的動物模型（Zebrafish is an important animal model in high-throughput drugs screening and chemicals toxicity testing）

斑馬魚（Daniorerio）是分布于南亞地區溪流中的一種身體略呈紡錘形，頭小而稍尖，全身布滿深藍類似斑馬縱紋的熱帶魚類.斑馬魚的胚胎在體外快速發育，通體透明，易于觀察形態發生和器官形成的過程，是研究脊椎動物胚胎發育的理想模型.斑馬魚的大規模遺傳篩選研究獲得了大量基因突變體，并確定了這些突變基因在胚胎發育中的功能，揭開了斑馬魚可以用于基因、基因組學和脊椎動物發育過程研究的序幕[8?10].斑馬魚和人類基因組有70%同源性，80%的人類疾病相關基因與斑馬魚具有同源性[11?12].斑馬魚與人類的生理組織結構、細胞信號、分子功能和調控過程具有進化上的保守相似性[13].斑馬魚已經成為人類疾病的強大臨床前模型，被用于各種癌癥、腎臟疾病、心血管疾病、血液疾病以及神經系統疾病等疾病及治療藥物的研究[14].

斑馬魚作為藥物活性高通量篩選的脊椎動物模型，在人類臨床候選藥物發現中發揮重要作用[15].2000年，人們證明通過直接在培養液中加入少量化合物，就可以在96 孔板中使用斑馬魚進行藥物篩選[16].斑馬魚胚胎體型微小，胚胎能在24、48、96 甚至384 孔板中培養，使得高通量地開展實驗和檢測成為可能.斑馬魚飼養條件簡單，其對水質要求不苛刻，成本低廉，大大降低高通量篩查的成本.根據歐盟動物保護法，受精5 d 以內的斑馬魚胚胎或幼魚不屬于動物保護范疇，可以替代哺乳動物測試，這使得斑馬魚胚胎的使用符合3R 原則.斑馬魚胚胎及幼魚透明或半透明的特性為光學成像提供便利，允許通過高通量成像技術對細胞、組織和器官等評價終點進行無創測量，以獲取大量生物表型數據.另外，斑馬魚遺傳操作方便，已經建立了許多細胞或組織特異性標記和信號轉導報告的遺傳品系[17]，這些品系不僅可用于表型數據的成像記錄，還可用于活體水平的機制研究.目前，研究人員廣泛使用斑馬魚開展藥物的高通量篩選，已經發現數百個小分子藥物在魚類和人類中具有保守的生物活性，其中部分藥物還進入了臨床轉化研究[18].

斑馬魚在藥物活性發現中的出色表現，為其在化學品毒性高通量篩查方面應用奠定了基礎.斑馬魚作為毒性評價的動物模型，早期更多應用于環境污染物的毒性評價.斑馬魚是經濟合作與發展組織推薦的化學品危害及環境風險評估的常規測試魚種，被廣泛應用于急性毒性、內分泌干擾、發育毒性、生殖毒性和遺傳毒性的測試和評價.在美國環保署開展的ToxCast 化學品毒性測試項目中，斑馬魚和多種體外細胞模型被用于化學品的高通量毒性測試[3].該項目根據所獲得的化學品生物活性和體外特征建立動物體內毒性效應和表型的預測方法，為識別更多潛在有毒化學品奠定基礎.ToxCast Ⅰ和Ⅱ項目利用的斑馬魚毒性評價終點包括死亡率、孵化率和畸形率，這些毒性數據能夠為化學品毒性評估的優先排序提供幫助[19].斑馬魚的發育毒性測試正在成為登記化學品致畸性評估的替代方法被應用于藥物安全性評價[20].在藥物研發前期盡早地識別有毒的候選藥物能夠極大降低后續研發中斷導致的經濟損失，這使得利用高通量技術分析候選藥物對特定器官毒性的研究興趣不斷增加.近年來，利用斑馬魚模型開展神經系統、心血管系統、肝臟和耳聽力等方面高通量毒性評價的研究取得許多新進展[21].

斑馬魚作為一個整體動物其分析通量低于培養細胞.但是，斑馬魚比細胞具有更高的生物學相關性和生理復雜度，可以提供單細胞無法提供的多細胞生物的動態、互動和多器官事件（圖1），可以繞過體外數據向體內轉化的障礙.雖然斑馬魚與人類的相關性低于小鼠，但是利用斑馬魚模型可實現高通量的生物分析，獲取大量的數據（圖1）[22].斑馬魚既有生物相關性和復雜度又具有一定的分析通量，是細胞與哺乳類動物模型之間的橋梁[21].因此，斑馬魚是21 世紀毒性測試中重要的非哺乳類動物替代模型.

圖1 斑馬魚在化學品高通量毒性評價中的應用（A）由于斑馬魚既有生物復雜度又具一定的分析通量，它在高通量的藥物篩選和化學品毒性測試中具有獨特的位置；（B）斑馬魚在化學品高通量毒性評價中的主要應用方向，包括發育毒性、神經行為毒性、心血管毒性、內分泌干擾毒性、肝臟毒性和耳毒性等方面的評價.Fig.1 High-throughput toxicity testing of chemicals in zebrafish（A）Zebrafish has a unique position in high-throughput drugs screening and chemicals toxicity testing due to its relative biological complexity and analytical throughput.（B）The main application directions of zebrafish in high-throughput toxicity testing includes assessment of developmental toxicity,neurobehavior behavior toxicity,cardiovascular toxicity,endocrine disrupting toxicity,hepatotoxicity and ototoxicity

3 斑馬魚高通量毒性評價研究進展（Advances in high-throughput toxicity assessment by zebrafish）

斑馬魚幼魚體長為3—5 mm，可以在多孔板中培養和暴露，發育的前5 d 通過自身的卵黃獲取營養，這些特性為高通量實驗和分析提供了便利.斑馬魚受精后發育至24 hpf（hours post fertilization）所有器官原基基本形成；發育至48—72 hpf，除了消化系統外的大部分器官發育完全；發育至76 hpf，肝臟、胰腺和腸道發育完全；發育至96 hpf，胃腸道發育完全；發育至5 dpf（days post fertilization），所有器官基本發育完全[21].斑馬魚作為一種完整脊椎動物的模型，被廣泛應用于藥物和環境污染物的急性毒性、胚胎發育毒性和神經行為毒性的高通量篩查.近年來一些特定器官的毒性評價如心血管發育、肝毒性、耳毒性和腎臟發育毒性等評估模型持續發展.以下本文將總結斑馬魚高通量毒性測試在藥物毒性預測和化學品毒性風險評估中應用的研究進展.

3.1 發育毒性

發育毒性和致畸性測試是化學品安全性評估的重要部分，這類測試通常是在哺乳動物中評估化學品對母體和胎兒的毒性.由于成本低、操作簡單和效率高的優勢，斑馬魚胚胎越來越多地被用于化學品的致畸性安全評價.許多研究機構和藥物公司利用斑馬魚胚胎開發了致畸性的分析方法和定量預測模型[23?29].這些方法一般在4—6 hpf 開始暴露胚胎并持續至120 hpf，毒性評價的終點包括死亡率、孵化率和畸形情況，其中畸形的評價指標包括脊柱、腦部、眼睛、耳、下顎、心臟、體節、脊索、魚鰭、魚鰾等器官的解剖學結構和形態，以及活動能力、心臟和血液的循環功能、色素形成、水中的姿態等，最后根據濃度-效應曲線、畸形指數或半最大活性濃度判定陽性.這些方法與哺乳動物發育毒性研究結果有很好的一致性，一些實驗室的一致性能夠達到87%[24]，最低的也能達到62%[25].由于許多化學品在不同物種中引起的毒性結局不同，因此不同動物模型的毒性評價結論普遍存在差異.例如，ToxCast 項目中214 種化學品的發育毒性測試結論在斑馬魚與小鼠（52%）、小鼠與家兔（58%）、家兔和斑馬魚（47%）中的一致性約為50%[30].小鼠（55%）、大鼠（61%）和家兔（58%）單獨對120 種致畸性藥物的陽性識別率約為60%，大鼠和家兔組合以后的識別率可達到100%[31].另外，嚙齒動物和非嚙齒哺乳動物模型分別單獨預測上百種已知具有人體毒性的藥物的識別率僅為71%[32].因此，斑馬魚胚胎是非常有價值的發育毒性預測模型，正被探討可作為哺乳動物胚胎發育毒性測試的替代方法用于特殊情況下的風險監管[21].另外，不同實驗室之間數據的差異反映出不同實驗設計、檢測終點、畸形指數計算方法和陽性閾值劃定標準對毒性評估結論的影響.例如，有些實驗室認為去除絨毛膜暴露增加了毒性反應的敏感性[33]，但另一些研究人員認為去除絨毛膜增加了復雜性和不確定性.因此，未來迫切需要科學團體協作建立一個被廣泛接受的測試標準.目前，已經有研究人員對暴露胚胎形態學改變的統一描述術語提供了建議[34].多個實驗室聯合梳理出一些導致斑馬魚發育毒性測試產生性能差異的影響因素，以尋求當前最佳的測試實施方案[35?36].

3.2 神經行為毒性

神經毒性測試評估化學品對神經系統的病理學和神經行為改變，是對化學品基本毒性數據的補充.神經行為不僅能夠反映神經系統在分子、細胞和器官層面的結構完整性，而且能夠綜合指示神經系統的功能，因而是神經毒性評價的重要組成部分[37].斑馬魚具有豐富且穩定的可測量的行為模式，包括運動、探索、焦慮、驚嚇、認知和社交等[38?39].目前，斑馬魚中已開發出一系列評估化學品對感覺、運動和認知功能影響的行為學測試方法[40?41]，并且研究發現精神類藥物、尼古丁、毒死蜱、二嗪農、苯并芘、酒精和重金屬等對斑馬魚行為學改變與其在哺乳類動物中作用相似[42?43].商業化和自主研發的行為學高通量分析系統被廣泛運用于環境化學品神經毒性的評估[44?51].這些系統通過視頻追蹤記錄和軟件分析幼魚（＜ 7 dpf）運動的速度、距離和轉彎角度等信息，實現幼魚睡眠與覺醒[52]、光運動反應[53]、視聽刺激運動[54]、明暗變化運動反應[55]等神經行為的高通量分析.三家實驗室分別利用斑馬魚神經行為毒性高通量測試方法對Tox21 Phase Ⅲ項目確定的91 種參考化學品進行分析，對神經毒物的識別率分別為49%[46]、62.5%[48]和96%[46].不同實驗室之間數據的差異，一方面是由于測試方法設計的差別，例如，胚胎暴露之前的脫膜處理可能會增加胚胎對毒物反應的敏感性，從而增加了陽性率[47].另外一方面則是由于不同實驗室判定神經毒物標準的嚴格程度不同[46,48]，神經行為異?？赡苁怯捎诠趋老到y或者肌肉系統異常導致，在無明顯發育毒性濃度下考察神經行為變化情況的判定方法更加科學合理[48].利用斑馬魚大規模開展化學品的神經行為毒性測試的研究相比于發育毒性研究要少很多，未來需要更多高質量的數據證明斑馬魚神經行為測試方法對人類神經毒物的預測能力.

3.3 心血管毒性

目前，評價藥物和環境污染物心臟毒性的體內和體外方法相對有限，主要評價終點包括心臟的結構、電生理和收縮性等[56].電生理變化是當前主要的心臟毒性評價方法，但由于人類和嚙齒類動物心肌細胞中離子通道表達的差異，導致兩者的心臟電生理存在明顯不同[56].相比于嚙齒類動物，斑馬魚心臟電生理特征與人類更加相似[57]，因而是化學品心臟毒性評價的重要替代方法.研究人員已經在斑馬魚成魚和幼魚中開發出多種心電圖測定的方法[58?60].另外，許多針對幼魚的成像及分析方法可以測定心率、心電圖QT 間隔、射血分數、房室傳導、心房和心室的搏動節律及血液動力學特征[61?64]，為高通量的心血管毒性評價提供了有力工具.利用心率和搏動節律兩個評價終點對23 個已知可導致人類心電圖QT 間隔延長的藥物進行測試，發現斑馬魚識別心臟毒物的特異性為76%，敏感性為80%；針對水溶性差的藥物改用顯微注射的暴露方式可以將預測的敏感性增加至96%[65].針對96 種有心臟毒性報道的藥物，研究人員比較分析人類誘導多能干細胞分化的心肌細胞和斑馬魚幼魚兩種模型的預測能力，發現斑馬魚模型具有更好的心臟毒性預測能力[66].利用針對幼魚的心臟輸出量、心率和血流3 個心血管參數的高通量分析方法，研究人員發現32 個心血管藥物中17 個藥物產生明顯心血管毒性，并且在3 個藥物中觀察到的最低效應濃度接近環境劑量[67].另外，心血管系統是脊椎動物胚胎中第一個發揮功能的器官系統，反映出心血管系統在發育和懷孕期間的關鍵作用.斑馬魚胚胎發育過程中血管新生的動態特征被用于識別阻燃劑對胚胎血管損壞的早期事件[68?69].這顯示出斑馬魚在環境污染物心血管毒性風險評估中的應用前景.

3.4 內分泌干擾

斑馬魚的內分泌系統在發育前5 d 基本發育完全[70].例如，垂體激素基因從48 hpf 開始表達[71]，催化雄激素合成的芳香化酶和雌激素受體等基因在24 hpf 就能檢測到[72?73]，甲狀腺從3 dpf 開始產生甲狀腺激素[74].在斑馬魚中已開發出許多內分泌信號傳導的轉基因報告品系，包括雌激素信號Tg（ERE:GFP）[75]和Tg（ERE:Gal4ff;UAS:GFP）[76?77]，甲狀腺激素信號Tg（tshβ:EGFP）[78]，以及糖皮質激素信號Tg（GCRE-HSV:U123:EGFP）[79].利用這些轉基因品系的幼魚可以開展具有內分泌干擾作用化學品的高通量毒性測試.例如，利用轉基因Tg（ERE:Gal4ff;UAS:GFP）的半透明Casper斑馬魚和高內涵成像系統，研究人員開發了雌激素干擾物檢測的半自動定量方法[80].Casper斑馬魚中的兩個色素基因（roy和nacre）突變，使得在Tg（ERE:Gal4ff;UAS:GFP）-Casper中能夠檢測到更強的報告基因信號.通過共聚焦成像可以檢測到EE2 在環境濃度（ng·L?1）下的雌激素激動作用，展示出該方法在未來活體高通量內分泌干擾評價中的應用前景.但是，高內涵系統成像的分辨率要低于共聚焦，成像精度會影響檢測的靈敏度.例如，該研究中高內涵只檢測到1000 μg·L?1的BPA 暴露胚胎中的信號，而共聚焦成像在62.5 μg·L?1的BPA 暴露胚胎就能檢測到信號.因此，增加高通量檢測的成像分辨率是未來重要的研究方向.

3.5 肝臟毒性

目前，準確預測藥物的肝臟毒性是藥物開發中的一個挑戰.不同物種肝臟中生物轉化和代謝途徑的差異使得肝臟相比于其它器官中毒性預測的準確率要低[81].近年來利用斑馬魚模型開展藥物肝臟毒性高通量篩查的研究興趣不斷增加[81?82].相比于哺乳動物，斑馬魚肝臟包含除免疫細胞（Kuffer 細胞）以外的所有細胞類型，這些肝臟細胞執行膽汁分泌、糖原儲存、外源物代謝與解毒、脂類生成，以及分泌血清蛋白等功能[83].人類肝臟中負責外源物質Ⅰ相和Ⅱ相的代謝酶在斑馬魚都能找到同源基因[84].盡管許多藥物和環境污染物在斑馬魚和人類中的代謝過程不完全相同，但大部分保持相似的代謝路徑[84].通過轉基因導入人源的細胞色素P450 酶基因可以提高斑馬魚肝代謝毒性的預測能力[85].斑馬魚幼魚的肝臟毒性評價終點包括肝臟大小、肝臟組織凋亡、卵黃脂類消耗和滯留情況[64].兩家藥物公司比較了體外培養肝細胞高內涵分析方法與斑馬魚體內基于肝臟表型的分析方法對50 種已知肝毒性藥物的預測能力，發現斑馬魚與哺乳動物預測結果一致率為84%，敏感度為86%，特異性為77%，表明斑馬魚與哺乳類動物模型的肝臟毒性預測有良好相關性[82].并且，將斑馬魚模型與2D 或3D 培養肝細胞的體外模型結合有望提高毒性預測的準確性[82].目前已有一些利用斑馬魚幼魚研究環境污染物對水生魚類肝毒性的研究[36,86?87]，但以斑馬魚幼魚肝毒性模型開展大規?；瘜W品風險分類的研究相對較少.未來需要更多的研究來評估斑馬魚幼魚與人類外源物代謝的相關程度，以及針對幼魚開發更多的肝毒性評價終點.

3.6 耳毒性

斑馬魚的身體外側有一個由毛細胞組成的稱為側線的感覺系統，它能夠感應水流對身體不同部位的微小變化.側線毛細胞的生理行為跟哺乳類內耳的毛細胞很相似.與哺乳類動物的毛細胞被耳朵包裹在內部的復雜解剖學結構不同，斑馬魚側線毛細胞位于身體表面，容易通過成像進行觀察和定量，這使得斑馬魚的側線被開發成篩查具有損傷聽力耳毒性藥物的高通量模型[88].側線毛細胞模型已經被用于評價水環境污染物如雙酚A、銅離子、微塑料、納米銀等對水生生物感覺系統的不利影響[89?95]，目前該模型還沒有被應用于大規?；瘜W品毒性篩查.

4 斑馬魚高通量分析技術的研究進展（Advances in high-throughput technology for assay in zebrafish）

體外培養細胞的高通量自動化分析技術已經非常成熟，但目前斑馬魚的高通量分析還未能達到體外高通量分析的吞吐力，操作、放置和分析斑馬魚胚胎仍然是勞動密集型的工作.下文將總結近年來高通量的藥物篩選和化學品毒性評價中魚卵收集、分類和轉移、培養和暴露、成像及分析4 個步驟中的技術革新情況，以展示斑馬魚高通量毒性測試涉及的實驗室任務自動化的前景.

4.1 斑馬魚胚胎收集的高效化

斑馬魚懷卵量大、繁殖力強，使得斑馬魚胚胎或幼魚特別適合高通量的生物分析.隨著實驗數量和規模的增加，時間、空間和工作量都會不同程度的增加，實驗室收集魚卵的傳統方法不再能滿足大規模和高通量實驗的需求.長期從事斑馬魚化學篩選的Leonard Zon 實驗室開發了一種能夠快速收集大量處于相近發育階段斑馬魚胚胎的新系統[96].這種方法利用魚類在淺水中產卵的自然趨勢，允許多達350 條的斑馬魚同時進行繁殖，同一條魚被安排在多個時間間隔內產卵以收集到發育階段相近的胚胎.整個系統由3 個主要部分組成：外室、產卵平臺和分離器.系統運行時會充滿水，將雌魚和雄魚分別放置在產卵平臺內并且位于分離器下方和上方.分離器被移除，雄魚和雌魚在深水中一起游動，產卵平臺升起后雄魚和雌魚在淺水中交配產卵.受精卵會從產卵平臺的底部掉下來，將魚從繁殖容器中取出后可收集容器底部的受精卵.這種方法極大地利用了斑馬魚的繁殖力，能夠在10 min 內獲得最高可達1 萬顆發育時期相近的胚胎，是對傳統方法的一次巨大的改進.

4.2 斑馬魚胚胎分類和轉移自動化

化學篩選需要將單個斑馬魚胚胎轉移到標準的多孔板中，斑馬魚胚胎的手工轉移是一項繁瑣費力的工作.COPAS（Complex Object Parametric Analyzer And Sorter）系統是能夠分選20—1500 μm 生物顆粒的商業化流式分選和檢測系統.該系統可根據胚胎的光學長度、光密度和熒光信號等分選參數對不同生存情況或熒光信號的斑馬魚胚胎進行分選.類似于流式細胞儀，COPAS 通過鞘流精確地將胚胎分配到多孔板或培養容器中，速度最高可達1 個胚胎/秒，分選純度達98%，并且對斑馬魚胚胎的生存能力沒有明顯的影響.COPAS 的分析和分選功能已被應用于肺結核病的新型抗生素和胰島素治療藥物的斑馬魚高通量自動篩選研究中[97?98].但是，COPAS 的價格接近流式細胞分選儀，高昂的價格限制了該系統的廣泛應用.實驗室研究人員開發了另一種成本相對較低的可將單顆斑馬魚胚胎批量轉移到96 孔板的自動化系統[99].該系統包括一個放置96 孔板的平臺和與之相匹配的用于捕獲和固定胚胎的定制24 孔板.該裝置通過抽掉裝置底部空氣形成的低真空環境達到固定和排列單顆斑馬魚胚胎的效果.隨后，翻轉該裝置并通過相機的幫助與平臺上96 孔板的1/4 相對齊，完成胚胎的轉移.該系統完成一個96 孔板的胚胎轉移大約需要360 s，成功率可達94.3%.此外，研究人員還設計了微機械大顆粒流式分揀機（micromechanical large particle in flow sorter,MILPIS），該系統利用受精卵和非受精卵光學透明度的不同，在微流控芯片中嵌入紅外發射和接收器，通過檢測區分透明度來分選兩類胚胎[100].

4.3 斑馬魚胚胎培養和暴露自動化

斑馬魚胚胎暴露一般在靜態或半靜態的多孔板中進行，一些可編程的自動移液工作站已經廣泛應用于胚胎的暴露和換液操作[101].近年來，微流控芯片技術為胚胎的培養及暴露提供了許多自動化運行的解決策略[102?103].與傳統多孔板相比，微流控芯片技術的獨特優勢是可實現多個操作的自動化.例如，Donald Wlodkowic 實驗室設計的微流控芯片可快速裝入和固定魚卵，并且實現了胚胎暴露微環境的自動灌注，避免了傳統的耗時耗力的液體處理任務[104?105].該微流控芯片設計了可容納12×21 個胚胎的腔室陣列，利用胚胎自身重力和底部的低壓吸力捕獲和固定斑馬魚胚胎[105].微流體芯片通過定制接口與液體蠕動泵相連，使得胚胎長期固定在流動的暴露液中[105].該微流控芯片的培養環境與普通靜態培養條件下測定的硫酸銅等化學品對胚胎的死亡率和致畸率有良好的相關性，但該系統只能捕獲及固定有絨毛膜保護的圓形斑馬魚胚胎，只適用于受精后48 h 之內的測試[105].另外，微流控芯片可實現自動化功能的集成，如梯度發生器[106?109]和溫度控制[110]等功能.研究人員將微流控培養腔室陣列與濃度梯度發生器相結合，設計出一種可為7 個胚胎培養腔室獨立輸送并連續給藥的芯片裝置[109].胚胎被手動轉移到培養室中，每個培養室可容納幾個胚胎，將芯片傾斜20°放置可以清除廢物和排出廢液.這種微灌流暴露方式可以克服化學品揮發和被吸附導致的暴露濃度下降的問題.除了水溶液的給藥方式，自動顯微注射技術可以為易揮發和難溶化學品提供更直接高效的遞送[111].

4.4 斑馬魚成像及數據分析自動化

通過自動化成像及分析技術高效地獲取發育毒性、行為學改變、特定組織器官變化和心率等生理指標變化的數據是整個斑馬魚高通量篩查中最重要的環節.針對不同檢測終點的高通量成像策略各不相同.利用簡單的成像設備如數碼相機和細胞成像儀等可以快速進行發育毒性分析.Donald Wlodkowic 實驗室設計的微流控芯片采用透明的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂制造，為固定胚胎的成像提供了便利[105,112].芯片外形大小特地設計成96 孔板的尺寸，方便利用高分辨相機或細胞成像儀采集圖像.這種微流控芯片技術圖像采集方便，同時集成了自動化捕獲、固定、暴露胚胎等功能，為發育毒性和致畸性評價提供了一個廉價的高通量、自動化的解決策略.

雖然成年斑馬魚具有更豐富的行為學特征和檢測方法[41]，但是成魚的分析通量要低于幼魚.針對幼魚行為的高通量檢測方法主要是測定及量化幼魚自發或刺激誘發運動行為中的各類特征，包括位置偏好、位移、速度、運動啟動頻率、休息期時長、軀干彎曲程度和方向變化等[113?115].斑馬魚幼魚的行為學實驗一般在燈箱或光板上的培養皿或多孔板中進行，照相機從頂上方拍攝，圖像采集軟件可同時自動追蹤及拍攝多條幼魚的運動視頻.無論采用高幀率或低幀率的相機都可開發出匹配算法和軟件[55,116]，量化幼魚運動中各種可測量的特征，以確定藥物或化學品誘導的行為學表型.商業化的分析軟件如Zebralab（Viewpoint Life Sciences）和Ethovision（Noldus Information Technology）提供一些量化行為學特征的標準分析流程，并且在實驗視頻記錄同時進行實時分析，大大提高分析速度；一些開源的軟件包則提供可靠和靈活數據處理方法.

胚胎或幼魚中特定細胞或組織器官的清晰且高通量的成像需要更加復雜光學成像設備和輔助硬件的支撐.這類成像面臨的首要挑戰是如何使胚胎或幼魚固定并將其旋轉至能清晰檢測到感興趣細胞和組織的成像面.脊椎動物自動篩查技術Vertebrate Automated Screening Technology（VAST）系統是目前針對斑馬魚胚胎及幼魚最成熟的自動化成像系統.該系統通過微流控液流將胚胎或幼魚從多孔板送入一個超薄硅硼酸鹽玻璃毛細管中，通過步進馬達精確控制毛細管繞中心軸旋轉（360 度），使斑馬魚胚胎可以根據用戶定義自動定向[117].毛細玻璃管組件安裝在一個三軸定位臺上，可支持寬場和共聚焦熒光顯微鏡成像，成像速度可達每條魚20 s，可在35 min 內掃描完成一個96 孔板.經優化后，整個系統的操作流程可自動地多線程運行，檢測速度大大提高[118].該系統已被Union Biometrica 公司以VAST BioImager 商標商業化[119].研究人員將VAST 與定制的轉盤共聚焦結合，實現了少突膠質細胞髓鞘的高分辨自動成像[120].最近，一種利用聲波來操縱液體和液體中顆粒的聲學流體技術被應用于斑馬魚的非接觸式固定[121].研究人員研制出的聲流體旋轉鑷子通過聲波激發的偏振單流渦旋對流體通道內的幼魚旋轉，采集幼魚旋轉過程中的二維圖像序列，最后利用基于計算機視覺的算法將二維圖像重建成三維模型.這種精細的聲學流體控制技術可降低旋轉不均勻導致的三維模型失真.這種聲流體旋轉鑷子可靈活地與多種光學顯微鏡兼容.這些裝載、固定和卸載胚胎及幼魚的樣品制備自動化技術極大地推動了光片顯微成像[122?123]和光學投影斷層掃描[124?125]等高速三維成像技術在斑馬魚表型評估中應用.

隨著高通量自動顯微成像技術的進步，利用有效的計算機策略對大規模圖像數據進行分析的需求增加.基于體外細胞圖像的高內涵分析方法在化學篩選中已經非常成熟[126]，這些針對細胞的圖像解決策略在基于圖像的斑馬魚表型分析中具有巨大的應用潛力.目前，已有許多針對斑馬魚特定分析需求的自動化圖像分析方法[127?128].例如，可用于發育毒性和致畸性評價中胚胎形態識別和分類的圖像處理方法.其中，FishInspector 能夠自動識別圖像中幼魚的輪廓、眼睛、下顎尖、卵黃囊、魚鰾、耳石、脊索和色素等；根據幼魚3D 重建模型，研究人員計算幼魚的表面向量與X軸之間角度，通過角度分布的直方圖精細地量化幼魚身體的形態特征，包括水腫和體軸彎曲程度等[121].斑馬魚中圖像自動處理的應用還包括熒光標記細胞數目的定量[98,120,129]，組織和器官大小測量[121,130?131]，行為特征的無監督聚類分析[52?53]和基因表達的三維解剖學結構注釋[124,132]等.相比于過去遺傳和藥物篩選中依靠人工視覺的表型判斷，計算機技術提供的自動和無偏向分析方法不僅提供可靠的定量數據，而且使得分析流程具有可追塑性和可重復性.隨著高通量成像技術的不斷發展，斑馬魚中高通量圖像分析未來面臨的挑戰是如何根據各類成像技術的特點創建匯聚各項分析功能的精簡平臺，以便科研人員容易掌握及廣泛使用.

5 總結與展望（Conclusion and prospect）

斑馬魚已成為強有力推動人類臨床前研究的脊椎動物模型，在高通量的藥物篩選和化學品毒性評價中發揮重要作用.本文系統地總結了當前斑馬魚高通量毒性測試及高通量分析技術的研究進展和所面臨的問題挑戰.為進一步促進斑馬魚高通量分析技術在化學品毒性預測和生態風險評估中應用，助力新污染物治理中化學物質風險評估技術標準體系的建設，未來在以下幾個方面有待開展更多的研究：（1）需要有效整合高通量分析流程中各個功能模塊，建立經濟、集約化的斑馬魚高通量分析平臺；（2）需要一個斑馬魚高通量毒性測試的實施指南，為可靠的毒性預測提供統一的實施建議；（3）需要建立大量化學品的斑馬魚高通量毒性評價的數據庫，方便系統比較不同研究平臺的測試結論，以優化測試指標和方法，并提供斑馬魚毒性預測能力的大數據支持；（4）需要將斑馬魚體內模型與其它高通量分析模型如3D 培養細胞或類胚體等組合，努力提高毒性預測的準確性.