基因工程菌在石油污染修復中的研究進展與前景＊

宮兆波 郭瑛瑛 張燕萍 楊永霞 趙增義 劉艷偉 史 斌 畢 磊 陰永光 宋茂勇

（1.中國石油新疆油田分公司實驗檢測研究院，克拉瑪依，834000；2.新疆維吾爾自治區油氣田環保節能工程研究中心，克拉瑪依，834000；3.中國科學院生態環境研究中心環境納米技術與健康效應實驗室，北京，100085；4.中國石油新疆油田分公司質量安全環保處，克拉瑪依，834000）

在石油開采、加工、運輸和使用等環節，石油污染物會發生泄露和排放，造成環境污染問題.石油污染物種類復雜，烷烴、環烷烴和芳香烴是含量最高的組分[1].芳香烴主要包括苯系物（benzene，ethylbenzene，toluene and xylene，BTEX）和多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs），具有高毒性和環境持久性，危害人類健康和生態系統[2?3].

相較于物理和化學修復，生物修復更為環境友好，經濟成本較低，而微生物可降解大多數脂肪族和芳香化合物，是最有效的生物修復方法[3?4].不同石油組分的生物可降解程度依次為：正構烷烴＞支鏈烷烴＞支鏈烯烴＞低分子量正烷基芳烴＞單環芳烴＞環烷烴＞多環芳烴＞瀝青質[5].目前，關于烷烴和芳香化合物微生物降解過程的研究最多.但是，石油污染的微生物修復仍存在諸多問題和挑戰.首先，微生物生存能力受環境影響較大，實驗室條件下降解效果良好的菌株在實際環境中的活性可能下降，或者環境中污染物的濃度不能誘導代謝基因的表達[6?7]；其次，石油污染物組成復雜，多數微生物只能降解特定組分，很難實現多種石油烴組分的完全降解[7?8]；另外，石油污染物的親脂性使其生物可利用性低，制約微生物的吸收和利用；最后，外源菌的引入可能影響土壤微生態平衡，且可能發生基因的水平遷移，存在生態風險.

通過分子生物學手段改造微生物代謝通路是修復石油污染的重要發展方向，構建基因工程菌（genetically engineered microorganisms，GEMs）為提高微生物的存活率、增強降解能力以及減少微生物修復的環境影響提供了解決方法.理論上，通過代謝調控可以設計出降解效率更高和環境適應能力更強的工程菌.本文概述了微生物降解石油污染物的代謝通路和遺傳調控機制，綜述了石油污染物降解基因工程菌的主要改造策略和應用，并展望了基因工程菌在石油污染修復的研究和發展趨勢.

1 石油污染物的微生物代謝途徑（Microbial metabolic pathways of petroleum hydrocarbon pollutants）

1.1 微生物降解石油污染物的主要途徑

石油污染物的降解途徑包括有氧和缺氧降解途徑.有氧條件下，氧氣作為最終電子受體和底物參與脂肪族化合物的碳鏈和芳香族化合物的芳環活化；在缺氧條件下，硝酸鹽、硫酸鹽、Mn（Ⅳ）、Fe（Ⅲ）和CO2等作為最終電子受體，參與PAHs 的生物降解[9?10].好氧降解微生物種類繁多，降解速率較快，不產生有毒副產物，因此石油污染物的微生物降解研究多集中在有氧降解[11].PAHs 分為低分子量多環芳烴（low molecular weight PAHs，LMW-PAHs）和高分子量多環芳烴（high molecular weight PAHs，HMW-PAHs）.一些脂肪族化合物和LMW-PAHs 可作為微生物的唯一碳源和能源，直接被微生物利用；但是苯并[α]芘等較難降解污染物需要與其他有機物共代謝進行降解，LMW-PAHs 也可為HMWPAHs 的共代謝提供碳源和能量[12?13].一些微生物可以同時降解脂肪族化合物和芳香化合物，也有一些只能降解脂肪族化合物；某些細菌對某個化合物可能只有一種代謝通路，也可能有多種代謝通路[14].

微生物對石油污染物的主要降解途徑如圖1 所示.對于烷烴，微生物在單加氧酶作用下將氧原子加入烷烴末端或亞末端生成醇類化合物，其中1-烷醇在脫氫酶作用下逐步生成醛和酸，再經β-氧化進入三羧酸循環[1,15?16].另外，烷烴也可在雙加氧酶作用下生成過氧化物，再逐步反應進入三羧酸循環，即Finnerty 途徑[1,16].其中，烷烴羥化酶可分為降解C1—C4的甲烷單加氧酶類、降解C5—C16的非血紅素鐵膜整合蛋白和細胞色素P450 酶（cytochrome P450 enzyme system,CYP450）、以及降解C17及更長碳鏈烷烴的酶系統[17].BTEX 和PAHs 的細菌降解過程非常復雜，涉及非常多的代謝產物和酶.比如，分枝桿菌屬的MyobacteriumvanbaaleniiPYR-1 是第一株分離的可降解HMW-PAHs 的菌株，蛋白質組學研究發現160 種蛋白可能參與PAHs 的降解，降解過程涉及183 個代謝產物和224 個化學反應[18].其中，環羥基化雙加氧酶在芳香烴降解中發揮關鍵作用[2,5,17]，該類酶催化兩個氧原子加入PAHs 的芳環中，再發生羥基化和芳環斷裂生成順式-二氫二醇，該中間產物在脫氫酶和加氧酶等作用下繼續發生芳環斷裂，生成鄰苯二酚、苯醌和龍膽酸鹽等中間產物[19].甲苯和二甲苯則在加氧酶作用下經苯甲酸等中間產物生成鄰苯二酚[15].作為常見的中間產物，鄰苯二酚在鄰苯二酚雙加氧酶作用下發生芳環的徹底斷裂，其產物通過進一步代謝進入三羧酸循環[9,19].此外，單加氧酶也可以介導單環芳烴和多環芳烴的微生物降解.

圖1 石油污染物的主要微生物降解途徑Fig.1 The major microbial degradation pathways for petroleum pollutants

真菌可通過細胞色素P450 酶的胞內降解途徑和木質素降解酶的胞外降解途徑參與石油污染物降解[20].細胞色素P450 酶是一種單加氧酶，參與芳環的斷裂；木質素降解酶可將PAHs 轉化為醌類化合物，然后發生加氫、脫水等反應[12,20].木質素降解酶包括木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、依靠錳的過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）和漆酶，這些酶在真菌體內合成后，分泌至胞外降解污染物.其中，LiP 和MnP 對污染物的降解需要H2O2的參與，漆酶對PAHs 的降解無需H2O2和其他輔因子的參與.

1.2 石油污染物降解相關基因

石油污染物降解的基因表達包括誘導型和組成型，以操作子單元或者獨立的基因位于質?；蛘呷旧w上，并涉及石油污染物轉運、降解和調控等過程[15].位于質粒上的PAH 降解基因包括nah、ndo、dox、nag和phn，位于染色體上的PAH 降解基因包括pah、nah、phd和nid等[21].

目前發現的石油污染物降解質粒主要包括含烷烴降解基因的質粒（如OCT 質粒）、含萘和水楊酸降解基因的質粒（如NAH 質粒）以及甲苯和二甲苯降解相關的質粒（如TOL 質粒）[15].OCT 質粒的alkBFGHJKL基因簇編碼烷烴降解的烷烴羥化酶、單加氧酶、外膜蛋白、醇脫氫酶和醛脫氫酶等；TOL 質粒的xylCAB基因介導甲苯生成苯甲酸的過程，而生成鄰苯二酚的相關基因在質粒和染色體上均有發現；NAH 質粒是一類含有兩個操縱子的高度保守質粒，其中操縱子（nahAaAbAcAdBFCED）與芳香烴（如萘、蒽和菲）轉化為水楊酸的反應有關，下游操縱子（nahGTHINLOMKJ）則介導水楊酸生成乙醛和丙酮酸的過程[15].石油污染物降解菌的代謝酶和操縱子可以被特定底物或中間產物誘導，AraC/XylS、LysR、IclR 和XylR 等蛋白家族可以調控芳香化合物降解相關的基因或者操縱子的轉錄[19].

2 石油污染物降解微生物的基因改造策略（Construction strategies of GEMs used for degradation of petroleum pollutants）

隨著對微生物降解路徑和調控系統的挖掘，目前已經構建了多種可降解石油污染物的基因工程菌，主要基因改造策略包括增強宿主菌的環境適應能力、增加微生物可利用底物范圍、提高微生物降解效率以及實現高選擇性的底物轉化途徑，一些基因改造策略如圖2 所示.

圖2 石油污染物降解微生物的主要改造策略Fig.2 Major genetic modification strategies of petroleum pollutant degradation in microorganisms

2.1 宿主菌的選擇與改造

污染物降解的基因工程菌多采用基因序列已知和代謝網絡研究較為透徹的模式生物，如大腸桿菌和假單胞菌[22].大腸桿菌具有廣泛的遺傳操作工具，是合成生物學中應用最廣泛的底盤生物.惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）的環境耐受能力強，新陳代謝多樣，營養需求較低，是環境修復的模式菌株.目前已發展了該菌的合成基因回路用于啟動子基因設計和降解基因表達[23?24].其中，高效降解PAHs 的PseudomonasputidaB6-2 的全基因組測序數據已發表[25]，該菌株存在苯甲酸鹽、兒茶酚、4-羥基苯甲酸鹽和水楊酸鹽降解相關的多個基因簇，而bphABC是多環芳烴降解上游通路中的唯一基因簇[26].

為實現復雜石油污染物的降解，底物類型多樣的微生物和環境適應能力強的土著菌也是石油污染修復的重要宿主菌.降解PAHs 等污染物的睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonastestosteroni）在環境中廣泛存在，環境適應性強，對碳源的競爭小，但該菌缺少功能基因表達的工具[27].Tang 等在該菌中構建了穿梭系統，可用于大腸桿菌中基因回路的高效構建以及睪丸酮叢毛單胞菌的表型測試，構建雜合啟動子提高基因表達強度和動態范圍，植入來源于噬菌體的T7 RNA 聚合酶-PT7 啟動子表達系統，并構建了T7 啟動子的隨機突變數據庫以提供強度范圍廣泛的表達系統，為該菌株的基因改造提供了有效的分子工具[27].此外，研究人員構建了可在特定環境條件下進行石油污染物修復的基因工程菌，可滿足不同環境場景下的石油污染修復需求.例如，在嗜冷菌PseudomonasputidaQ5 和Pseudoalteromonas haloplanktisTAC125 中引入石油污染物降解相關的質粒（如TOL 質粒）或基因（如tou），可在低至0 ℃環境中降解甲苯等芳香烴[28?30].另外，石油污染、重金屬污染和放射性污染在環境中可能同時發生，復合污染問題突出[4,31].耐輻射球菌（Deinococcusradiodurans）可還原六價鉻生成低毒的三價鉻，在該菌中異源表達甲苯降解相關的tod和xyl基因，重組菌能在高輻射環境下降解苯、甲苯和氯苯，可用于處理核生產廢物中鉻和有機污染物[31?32].

2.2 降解通路關鍵酶的表達與改造

對降解通路關鍵酶的調控表達和改造是提高微生物降解能力的主要策略，可以提高宿主菌的污染物降解能力以及對污染環境的耐受能力[33].在無降解能力或降解能力弱的菌株中引入相關基因，可實現對石油污染物的降解；已有降解功能的菌株添加其他污染物降解通路，增加底物類型，實現多種污染物的同時降解.通過對石油污染物降解通路關鍵酶基因改造而構建的基因工程菌見表1.

表1 構建的用于降解石油污染物的基因工程菌Table 1 Genetically engineered microorganisms（GEMs）designed for the degradation of petroleum pollutants

2.2.1 胞內降解通路關鍵酶

單加氧酶和雙加氧酶是微生物降解石油污染物的關鍵酶，主要參與脂肪鏈斷鏈和芳環斷裂.在不能降解烷烴的天藍色鏈霉菌M145 菌株，過表達編碼烷烴單加氧酶的基因alkB可以實現正十六烷的快速降解[34].在煙草分枝桿菌異源表達來自楚布分枝桿菌的丙烯單加氧酶和乙烯單加氧酶的編碼基因，可以降解烯烴[46].將含有編碼菲雙加氧酶的phdABCD基因的外源質粒導入到大腸桿菌中可有效降解菲[35].分枝桿菌PYR-1 可礦化蒽、熒蒽、芘、1-硝基芘、菲和苯并[a]芘，通過分析其蛋白質表達和組成，確定其染色體上的nidA、nidB和nidD基因編碼了雙加氧酶和二氫二醇脫氫酶，將編碼雙加氧酶的基因克隆至pBAD/ThioFusion 質粒，并在大腸桿菌中過量表達可以降解HMW PAHs[21].

石油污染物的降解過程產生許多中間代謝產物，代謝產物的生成和進一步轉化反應也需酶的參與.如在水楊酸代謝通路，水楊酸加氧酶催化水楊酸生成鄰苯二酚.在鞘氨醇單胞菌屬的Sphingomonas yanoikuyaeB1 菌株，水楊酸加氧酶包括bphA2cA1c編碼的加氧酶、bphA3編碼的鐵氧還蛋白和bphA4編碼的鐵氧還蛋白還原酶，將bphA2cA1c基因轉入大腸桿菌，可使重組菌具有水楊酸加氧酶活性[37].此外，芳香烴降解進入TCA 循環的關鍵步驟為鄰苯二酚的降解，鄰苯二酚2,3-雙加氧酶（catechol 2,3-dioxygenase，C23O）是催化鄰苯二酚徹底開環裂解的關鍵酶.將編碼C23O 的基因異源表達，可增加細菌的底物利用范圍，提高芳香化合物的降解效率.不動桿菌屬BS3 菌株可降解烷烴，但無法降解芳香烴.將惡臭假單胞菌BNF1 中編碼C23O 的基因xylE在Acinetobactersp.BS3 異源表達，可實現該菌對烷烴和芳香烴（如氯酚、萘和菲）的同時降解[41].另外，將含有C23O 基因的泛宿主性質粒（pRK415）引入假單胞菌CGMCC2953，重組菌株CGMCC2953-pK 完全降解菲（0.1%）的時間縮短一半[47]；將NAH7 質粒中編碼C23O 的基因nahH，通過pUC18 質粒轉入惡臭假單胞菌和大腸桿菌可有效降解菲和芘，且惡臭假單胞菌重組菌株的降解能力較天然降解菌株有顯著提高[39?40].

2.2.2 木質素降解酶

真菌分泌到胞外的木質素降解酶可降解多種污染物[20].將編碼木質素降解酶的基因異源表達，可以提高其他菌株對石油污染物的降解能力.例如，將肉色隔孢伏革菌KUC8836 編碼MnP 的基因pimp1在無法降解蒽的釀酒酵母BY4741 中異源表達，可以實現蒽的降解（降解量6.5%）[42]；將黃孢原毛平革菌中編碼MnP 的基因mnp1表達在黑曲霉中，可提高該菌對PAHs 的降解能力，在17 d 后可降解土壤中95%的菲（初始濃度：400 mg·kg?1）[43]；將朱紅栓菌的漆酶基因異源表達在深綠木霉，也可有效去除工業廢水中的酚類物質，并降解菲和苯并[a]芘[44].

采用過表達、基因編輯和定向進化等手段，構建穩定生產高活性木質素降解酶的基因工程菌，再從微生物體內提純酶應用于石油污染修復是一種經濟可行的修復策略.相較于LiP 和MnP，漆酶降解過程無需H2O2參與，在石油污染的酶修復中有更大優勢[48].已有研究通過定向進化獲得了可用于蒽降解的漆酶，如將嗜熱菌絲體的漆酶基因轉入到釀酒酵母，其漆酶表達提高了8 倍，酶活提高170 倍[49?50].

2.2.3 降解通路的理性設計與關鍵酶的整合

微生物代謝途徑的進化較慢，現有的代謝途徑可能無法滿足實際修復需求，可通過理性設計降解通路和整合關鍵酶改變微生物的代謝途徑.間位和鄰位裂解途徑分別是甲基芳烴（如甲苯、二甲苯和甲酚）和氯代芳烴（如氯苯和氯酚）的主要降解途徑，但這兩類污染物降解也可通過另一種途徑發生一些反應[51].因此，當這兩類污染物同時存在時，這兩種降解途徑都被激活，影響降解效率和細菌生長[51].研究將來自3 種細菌的編碼降解關鍵酶的基因進行整合，包括TOL 質粒上編碼甲苯酸酯雙加氧酶和環己基甲酸二羥基酯脫氫酶的基因、NAH 質粒上編碼水楊酸羥化酶以及真養產堿桿菌編碼4-甲基-2-烯內酯異構酶的基因，從而在假單胞菌B13 菌株中構建了新的鄰位裂解途徑，實現了甲基芳烴和氯化芳烴在不發生間位降解途徑下的鄰位裂解[51].該重組菌株可在復雜的底泥環境中存活，并顯著降解3-氯苯甲酸鹽和4-甲苯甲酸鹽[52].

2.3 通過引入血紅蛋白合成途徑提高好氧菌活性與降解能力

氧氣含量和可利用性是土壤和水體等環境中制約微生物生存和修復效率的關鍵問題.通過將透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscillahemoglobin，VHb）編碼基因vgb異源表達到降解菌中，生成的VHb 蛋白可傳遞氧氣分子給氧化酶和加氧酶，可有效解決修復過程中氧氣含量不足和利用效率低的問題[53].已有研究將vgb基因在銅綠色假單胞菌中表達，重組菌在氧含量正?；蚱颓闆r下降解苯甲酸的速率均顯著高于野生型[54?55].苯、甲苯和二甲苯為碳源時，重組菌的生長速率更快；以甲苯為唯一碳源時，重組菌中代謝產物3-甲基鄰苯二酚的累積更明顯，表明氧化酶對苯環裂解更快速[56].

2.4 全細胞的代謝網絡改造與優化

石油污染物降解的代謝通路復雜，對單一關鍵酶或者通路的改造可能影響其他代謝過程，因此，需要對石油污染物降解相關的代謝通路進行深入研究，并開展全細胞的代謝網絡改造與優化.例如，谷氨酸棒狀桿菌具有芳香烴降解相關的轉運、代謝通路和調控通路等，能以苯甲酸、苯酚、苯甲醇和萘等芳香烴為碳源[57].在有氧條件下，芳香烴通過不同的周邊通路代謝生成鄰苯二酚和庚二酸鹽等中間產物，進而發生芳環裂解，進入中心碳代謝途徑.所以，中心碳代謝通路的調控影響芳香烴的降解，比如，敲除果糖-1,6-雙磷酸鹽酶的fbp基因導致菌株無法在芳香烴上生存[57].同時，谷氨酸棒狀桿菌是生產多種氨基酸和維生素的重要工程菌，三羧酸循環與氨基酸（如谷氨酸和天門冬氨酸）的合成有關，而芳香烴降解的中間產物可進入三羧酸循環，并增加這些氨基酸的生成量[58].目前，針對石油污染物降解微生物的全細胞代謝工程改造研究很少.3,4-二羥基苯甲酸是PAHs 降解的中間產物[59].有研究對PseudomonasputidaKT2440 進行多方面的代謝工程改造，使其在以葡萄糖為碳源的條件下，產生大量3,4-二羥基苯甲酸[60].該工作首先開發了具有不同表達強度的組成型啟動子，用于微調基因的表達；其次，采用過表達限速酶、去除負向調節因子、加強前體供應以及減少途徑競爭等策略促進3,4-二羥基苯甲酸的生產；然后，進一步篩選出高產的基因工程菌株[60].該工作為以PAHs 為碳源的微生物的代謝工程改造提供了研究思路.

另外，群體感應系統被認為是石油污染物降解的重要調控通路.在敲除銅綠色假單胞菌CGMCC1 菌株的群體感應rhl基因后，C23O 酶活性和細菌降解芳香烴的能力顯著下降，編碼C23O 酶的基因nahH和轉錄活化子nahR的轉錄水平也受影響，而該抑制作用在添加N-丁酰同源內酯（rhlQS 系統的信號分子）后有所緩解[61].赤桿菌科的CroceicoccusnaphthovoransPQ-2 中群體感應系統與PAHs 降解基因（ahdA1e,xylE和xylG）和調控基因ardR成正相關[62].對NCBI 基因數據庫進行搜索，發現超過11%的微生物（78 種）同時具有環羥基化雙加氧酶和群體感應系統AHL/AI 信號分子合成酶的基因，并從多種環境介質中篩選出6 種鞘氨醇菌和4 種根瘤菌，為石油污染物降解微生物的代謝改造提供了支持[63].

3 基因工程菌用于微生物菌群和植物強化修復石油污染（Application of GEMs for microbial consortium and plant-microbe remediation of petroleum hydrocarbon pollution）

石油污染物降解基因工程菌的構建多采用單個降解菌株，但是單一菌株在實際環境中難以達到良好修復效果[4,62].另外，在單一菌株上過量表達質粒上的基因會增加細胞代謝負擔，質粒的兼容性和穩定性也是影響降解效果的重要因素[22,36].相較于單一菌株修復，微生物菌群修復和植物-微生物聯合修復可以豐富污染物的代謝途徑，增加可利用底物類型，并提高微生物對環境脅迫的耐受能力，通過優化微生物菌群結構以及植物和微生物的搭配，可以獲得良好代謝互補性，以及增強微生物環境適應能力和污染物降解能力[64?66].因此，將基因工程菌結合微生物菌群、微生物-植物聯合修復技術是石油污染修復的重要發展方向.

3.1 微生物菌群強化修復石油污染

微生物菌群對環境的適應能力更強，在復雜石油污染物的生物降解中更具潛力.有研究將黃孢原毛平革菌編碼LiP 和MnP 的基因分別在黑曲霉中表達并構建了兩種基因工程菌，將其與從原油污染土壤中分離出的4 種真菌和5 種細菌一起用于土壤修復，該菌群可產生LiP、MnP、漆酶、過氧化物酶和雙加氧酶[67].在接種兩周后，土壤中菲、芘和苯并[α]芘（初始濃度均為333 mg·kg?1）的降解率為92%、64%和65%，降解效率高于未加GEMs 的菌群和已報道的其他微生物菌群[67].將Mycobacterium vanbaaleniiPYR-1 編碼菲雙加氧酶的基因（nidA和nidB）和AlcanivoraxborkumensisSK2 電子傳遞鏈相關的基因（fdr和fdx）在大腸桿菌中表達，得到重組菌株HY1；將PseudomonasaeruginosaPH1 編碼鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的基因加強表達得到重組菌株PH2.這兩種菌的聯合降解能力顯著優于野生降解菌株PH1[64].也有研究將芳環裂解、水楊酸合成和鄰苯二酚代謝途徑分別引入到大腸桿菌BL21 菌株，得到重組菌株M1、M2 和M3，該菌群可協同參與菲的降解，21 d 降解效率達到90.66%（初始濃度：100 mg·L?1）[68].

鼠李糖脂等生物表面活性劑可提高疏水性石油污染物的生物利用性[69?71].采用微生物原位持續產生表面活性劑是提高污染物生物可利用性和降解菌降解效率的一個有效措施.Pseudomonas aeruginosa可產生鼠李糖脂，但該菌具有一定的致病性，將編碼鼠李糖脂合成的rhlABRI基因轉入沒有致病性的PseudomonasputidaKT2440 的染色體中可得到重組菌KT2440-rhlABRI，該菌雖然不能降解芘，但是可在天然土壤中存活，30 d 后重組菌和野生菌添加組芘的降解效率分別為79%和43%，即重組菌穩定產生的鼠李糖脂提高了芘的溶解，進而促進其他微生物對芘的降解活性[38].另外，將產鼠李糖脂的Pseudomonasputida和上述大腸桿菌重組菌株（M1、M2 和M3）組成降解菌群，菲（初始濃度：100 mg·L?1）的7 d 降解率從61.15%提高到73.86%[68,72].

3.2 細菌與植物聯合修復用于石油污染物的降解

促進植物生長的細菌可以促進植物的生長、增強植物耐受脅迫的能力并提高污染物的生物可利用性，基因改造的根際菌和植物內生菌已用于石油污染修復研究[66].將洋蔥伯克氏菌G4 的甲苯降解質粒pTOM 引入到羽扇豆內生菌L.S.2.4 得到重組菌株VM1330，在根際添加該重組菌可以更好地保護植物，提高甲苯的降解量，并降低甲苯的蒸騰量進而減輕甲苯的植物毒害作用[73].另外，將越南伯克氏菌BU61 中甲苯降解相關的pTOM-TCE 質粒轉入到柳樹的根際菌Burkholderiasp.HU001 和根內生菌Pseudomonassp.HU002，可以促進植株地上部分的生物量，顯著降低甲苯向大氣的揮發，并且不影響柳樹對Cd 的吸收[66].將PseudomonasputidaG7 的pNAH 質粒轉入植物根系組織和根際的共生菌PseudomonasputidaVM1441 中，接種該重組菌后，植物和重組菌對萘的降解效率比單獨植物修復提高40%，并可提高種子發芽率和植物蒸騰作用，減少萘對植物的毒害作用[74].

4 微生物全細胞傳感器用于監測石油污染物（Application of microbial whole-cell sensors for monitoring petroleum hydrocarbon pollution）

微生物全細胞傳感器是一種簡單和經濟的檢測手段，可評估污染物的生物可利用性，并反映細菌活性和環境污染物毒性.一種微生物全細胞傳感器是將含啟動子、調控基因和報告基因的質粒轉入到宿主菌，另一種是將報告基因融入到宿主菌的基因組中，在代謝基因的上游表達或者替代這些代謝基因[75].在特定污染物存在下，特異調控蛋白被激活并調控下游的報告基因發出信號，該信號強度與污染物的濃度存在相關關系，可用于污染物的檢測和定量分析[76].報告基因主要是細菌熒光素酶基因（lux）、綠色熒光蛋白基因（gfp）和螢火蟲熒光素酶基因（luc）.

1990年，第一個用于檢測萘的微生物全細胞傳感器被成功構建[77].熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）5R 是從人工制氣廠環境中分離出的菌株，其中降解萘的基因位于pKAl 質粒，其與NAH7 質粒有同源性.將含有費氏弧菌（vibriofischeri）的lux基因的質粒轉入到P.fluorescens5R，通過轉座子的轉座作用，得到含有lux基因的萘代謝質粒pUTK21.然后，在含有萘或水楊酸環境中篩選含有該質粒的5RL 菌株，該菌株可累積水楊酸但不能完全礦化萘，表明lux插在了編碼水楊酸羥化酶nahG基因的位置；進而，將pUTK21 通過結合方式轉移到PseudomonasfluorescensHK9 獲得HK44 重組菌株，此菌株不能降解萘但是可以降解水楊酸.該菌可以快速響應（15 min）萘暴露，并反映萘濃度的動態變化，可用于實時監測萘的降解活性[77].該菌株是首次應用在美國場地修復的基因工程菌[78].目前，已開發10 余種基于模式菌（如大腸桿菌）和烷烴降解菌（如假單胞菌和不動桿菌）的微生物全細胞傳感器用于烷烴檢測[75,79].例如，將調控烷烴降解酶基因表達的調控基因alkS、啟動子PalkB和哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）的luxAB基因的融合表達質粒轉入大腸桿菌DH5α，該傳感器可以用于烷烴檢測，但不響應環烷烴和芳烴，其中辛烷的最低檢出濃度為24.5 nmol·L?1[79].目前，石油污染物的全細胞傳感器多采用基于質粒的報告系統，存在基因水平轉移的風險.也有研究在不動桿菌屬的ADP1 菌株的染色體上引入可被水楊酸特異性誘導的報告基因luxCDABE，獲得的重組菌株AcinetobacterADPWH_lux可以響應低至0.5–1 μmol·L?1水楊酸[80].由于水楊酸是萘的重要代謝產物，將萘降解的基因nahAD引入該重組菌，可以使該菌有效降解萘，并用于快速檢測天然水體和土壤中的萘[81].

面對復合污染問題，目前已經開發了多種微生物全細胞傳感器用于不同污染物的同時響應.如在Pseudomonasputida引入phnS-luxCDABE和merR-egfp，可同時響應菲（0—60 mg·kg?1）和汞（0—0.24 mg·kg?1）[82].基于PseudomonasputidaN1 的菲生物傳感器BMB-PL（含nah-luxCDABE的pCMPL 質粒）和基于Escherichiacoli的汞生物傳感器BMB-ME1（含merR-pmerT-egfp的pGEX-ME 質粒），可用于同時測定土壤中生物可利用的菲和汞含量[83].另外，構建的大腸桿菌DH5α 2296-gfp（含pPROBE-Tbut-RBS-gfp-npt質粒）和DH5α 2301-cfp（含pPROBE-phn-RBS-cfp-npt質粒）可以分別響應BTEX 和PAHs，可用于定量1—100 μmol·L?1濃度范圍的苯系物和多環芳烴，誘導時間為30 min[84].另外，基于AcinetobacterbaylyiADP1 菌株開發的生物傳感器能同時檢測烷烴和烷烴的中間產物，可用于監測天然烷烴的降解和外源烷烴的生物合成過程[85].

5 構建自毀程序減少降解工程菌的生態風險（Construction of conditional-suicide containment systems to reduce ecological risks from engineered microorganisms）

作為外來菌種，降解菌可能與土著菌群競爭，進而影響生態系統平衡；降解菌的基因也可能發生水平轉移，造成基因污染.因此，微生物用于環境修復受到嚴格控制，一些地區禁止基因工程菌或者非土著菌用于生物強化修復.目前，用于降低工程菌環境風險的措施包括物理性遏制、自毀遏制、營養性遏制和語義性遏制[86].物理性遏制是將基因工程菌封閉或固定在生物反應器，但該措施仍存在一定風險；自毀遏制通常是將自殺基因及其調控通路引入到工程菌中，在特定化學或物理條件下誘導自殺基因的表達；營養性遏制是指通過敲除基因構建營養缺陷型菌株，使菌株無法在缺乏某營養物質下存活；語義性遏制是通過設計新的核苷酸、密碼子或聚合酶等來阻止工程菌和天然菌株間的遺傳信息共享[86].

目前，構建具有自殺控制功能的基因工程菌是降低降解菌環境風險的常用方法[87].多篇研究構建了針對石油烴的主動生物防御系統，使細菌在芳香烴污染物濃度低時啟動細胞自殺程序，以減少外源菌的環境風險[88?91].在該系統中，將xylS、lacI和Pm啟動子融合表達，芳香烴及其衍生物降解產生的苯甲酸等中間產物可作為XylS 蛋白的效應子來誘導Pm啟動子和下游lacI基因的表達，進而生成LacI 蛋白質，而LacI 蛋白遏制自殺基因的表達；當這些污染物濃度不足以誘導Pm和下游LacI 表達時，自殺基因的表達不受抑制，因而導致細胞死亡[88].目前，該系統采用的自殺基因包括大腸桿菌編碼毒性多肽的基因gef[88,89]、φX174 噬菌體編碼裂解蛋白E 的基因[90]和親和素鏈霉菌編碼鏈霉親和素的基因stv[91].另外，將XylS 替換為XylSthr45 可以改變效應子的特異性和親和性，從而可用于更多污染物降解過程的控制[88].但是，這些基因工程菌在土壤中死亡速率仍較慢，且基因突變會導致一些菌株存活.在工程菌中引入多個自殺系統，即通過多種靶點和調控通路進一步降低工程菌的環境風險[86].例如，研究者將gef自殺系統引入天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因asd缺失的突變菌株中，并在染色體上融合表達Pm啟動子和asd基因，采用雙重自殺防御系統加快細菌死亡速率并減少突變體逃逸[89].

6 結論與展望（Conclusion and prospect）

微生物修復是一種經濟可行的石油污染修復手段，但實驗室分離和篩選的高效降解菌株在外界環境中的存活率和降解效果常不盡如人意.而且，面對越來越復雜的環境污染問題，微生物通過自然選擇進化出的降解途徑難以滿足環境修復需求.因此，通過多種基因工程策略來改造微生物，可提高微生物的污染物降解能力和環境適應能力，并為環境修復提供有效解決思路.目前，基因工程菌在環境中的應用非常有限，以下幾方面工作的開展將推動基因工程菌在環境修復中的應用.

（1）提高降解菌的降解能力和環境適應能力是微生物修復的關鍵，目前研究主要圍繞污染物降解通路和關鍵酶進行改造，欠缺全細胞的代謝網絡改造與優化.未來發展需結合基因組學、蛋白組學、轉錄組學和代謝組學等組學技術，繼續發現功能基因、降解關鍵酶、調控蛋白和降解途徑，尋找和開發更好的遺傳操作工具，采用系統生物學和合成生物學思路從底盤選擇、路徑設計和代謝優化等方面對降解微生物進行代謝改造.

（2）在基因工程菌的實際應用中，基因工程菌的環境安全性是最受人們關注的問題.目前，通過在降解微生物中引入識別元件和報告元件可監測基因工程菌的存活狀況和污染物的降解效果，而構建自毀程序可避免工程菌的過度繁殖和減少基因的水平轉移.未來，需結合更多物理性遏制、自毀遏制、營養性遏制和語義性遏制等手段降低基因工程菌的潛在環境風險.

（3）構建基因工程菌用于降解酶和生物表面活性劑的規模生產，也是環境修復的重要發展方向.石油污染物的生物降解受限于污染物的生物可利用性、微生物活性和代謝酶活性等因素.生物表面活性劑可提高石油污染物的生物可利用性，酶修復則在更寬的pH 和溫度范圍下保證酶的活性和降解效果，二者的環境遷移性強且環境友好.構建穩定生產高活性降解酶和生物表面活性劑的基因工程菌將為石油污染的環境修復提供有效策略.

近些年，基因工程菌的構建已經從單個基因編輯發展為對整個微生物基因組和全細胞代謝網絡的改造.但是，合成生物學在環境修復中的應用處于初始階段，隨著合成生物學和系統生物學在微生物環境修復中更廣泛的應用，以及更多環境管理與風險評估工作的開展，基因工程菌在環境修復中展現良好的應用潛力.