荷斯坦奶牛肝臟組織中與泌乳時期及繁殖力相關的基因共表達網絡構建

張志飛,唐雪穎,,閔 力,童 雄,陳衛東,巨向紅,李大剛*

(1.廣東省農業科學院動物科學研究所 廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室,廣州 510000;2.廣東海洋大學濱海農業學院,湛江 524000)

荷斯坦牛(Holstein,Bostaurus)是全球最重要的奶牛品種之一,據記載起源于至少2 000年前,原產于荷蘭北部的西弗里斯蘭省(Friesland)和北荷蘭省(North Holland),以及德國北部的荷斯坦(Holstein)地區[1]。中國在十九世紀中葉從美國引進荷斯坦牛,從20世紀50年代起有計劃開展品種培育工作,1992年經原農業部批準命名為“中國荷斯坦?！盵1]。荷斯坦奶牛具有產奶性能好、適應性強和易于飼養等特點,因而被廣泛應用于奶業生產[2]。荷斯坦奶牛來源的鮮奶、奶粉、酸奶等產品是人類飲食中優質蛋白的重要來源,為改善人們的健康狀況做出了重要貢獻[3]。營養不良、熱應激、乳房炎、圍產應激等生理應激或環境應激往往對奶牛的生產和繁殖性能造成不良影響,是目前阻礙奶牛產業健康發展的關鍵問題[4-6]。

肝臟參與奶牛生理代謝與調控相關的眾多關鍵過程,包括葡萄糖代謝、能量穩態、營養因子的轉運、免疫系統調節、生長發育刺激及有害毒素降解等[5]。因此,肝臟在調控不同生理時期奶牛生產及繁殖性能等方面起著關鍵作用[7]。在奶牛的圍產期,胎兒生長對營養物質需求激增,但干物質采食量受胃腸道系統影響顯著降低,極易發生能量負平衡(NEB)[8]。此時,肝臟中葡萄糖合成、膽固醇代謝及脂肪生產過程增強,同時對脂肪和氨基酸的動員增加,維持能量平衡的同時產生大量酮體,損傷免疫系統,誘發產褥熱、酮病、胎衣不下、流產等代謝性疾病[9]。在奶牛的產奶高峰期,奶牛由于大量合成乳汁與泌乳,同樣經歷著能量負平衡,當大量脂肪被消耗時,脂肪組織合成的瘦素水平降低,使體內促性腺激素釋放激素分娩減少,抑制卵泡發育,引起高產奶牛低繁殖力問題[10]。

加權基因共表達網絡分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是一種系統生物學方法,可用于對表達特性上高度相關的基因進行聚類(模塊),通過與樣本的性狀進行關聯分析,可用來篩選出影響或調控生理性狀的特征模塊及Hub基因,進而可結合其它生物學技術鑒定性狀標記基因或靶點基因[11-12]]。王子渲等[13]的研究利用RNA-seq和WGCNA分析,挖掘了肉雞脾臟中與熱應激相關性狀顯著關聯的Hub基因。李曉波等[14]的研究利用WGCNA和GSEA方法鑒定了與中衛山羊羊毛彎曲相關的Hub基因。王麗敏等[15]利用WGCNA和PPI網絡技術鑒定了山羊金黃色葡萄球菌型乳腺炎關鍵應答基因。由此可見,WGCNA技術在畜禽關鍵性狀調控或標記基因的挖掘方面具有廣闊的應用前景。

因此,本研究旨在利用WGCNA結合PPI分析技術構建荷斯坦奶牛肝臟中與泌乳時期和繁殖能力性狀相關的基因共表達網絡,并分析和鑒定調控網絡中的關鍵基因和調控因子。這將有助于我們深入了解荷斯坦奶牛生產和繁殖性能的調控機理,從而為改善荷斯坦奶牛的繁殖能力和產奶效率提供理論依據和基礎數據。

1 材料與方法

1.1 數據來源

本試驗的數據來源于GEO數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的數據集GSE62159。該數據集共包含48頭健康荷斯坦奶牛的肝臟轉錄組測序數據,按照泌乳時期劃分:妊娠末期(分娩前18 d)16頭,泌乳早期(分娩后1 d)16頭,泌乳中期(分娩后147 d)16頭;按照繁殖力(基于生產間隔及世代信息的育種值估計值)劃分:高繁殖力奶牛24頭,低繁殖力奶牛24頭[16]。數據集中的荷斯坦奶牛飼養于愛爾蘭(55°10′N 8°16′W),其系譜信息來自于愛爾蘭牛產業聯盟(the Irish Cattle Breeding Federation,ICBF)的國家奶牛數據庫,試驗用牛的系譜記錄開始于2007年,2008年獲得首個產奶性能、繁殖性狀(產犢間隔)的育種值(EBV),測序樣品采集于2011年,其中高繁殖力組奶牛屬于產犢間隔(85.6 d)育種值排名前20%的家系,低繁殖力組奶牛屬于產犢間隔(113.8 d)育種值排名后5%的家系[16-17]。

1.2 構建基因共表達網絡

使用R語言中的WGCNA包[18],根據hclust函數,對樣本數據進行分析將基因表達模式類似的樣本進行聚類,并且除去離群樣本;利用pick-SoftThreshold函數選擇出合適的軟閾值;利用adjacency函數構建拓撲重疊矩陣(TOM)并對基因進行聚類,得到共表達模塊;將共表達模塊與表型信息矩陣進行關聯分析,依據相關系數r值與P值(P<0.05 表示差異顯著)選擇與不同泌乳時期或繁殖力相關的模塊為目標模塊;選擇模塊內連接度排名前30的基因作為Hub基因,構建基因共表達網絡。

1.3 模塊的富集分析

對每個目標模塊的Hub基因使用KOBAS 3.0(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)進行KEGG富集分析;使用DAVID網站(https:∥david.ncifcrf.gov)進行GO富集分析,并使用R語言將富集結果可視化。

1.4 構建蛋白互作網絡和確認目標基因

對所有目標模塊中的基因使用String 11.0網站(http:∥string-db.org/)進行蛋白互作網絡(protein-protein interaction networks,PPI)的構建。使用Cytoscape軟件根據PPI網絡中節點的度值degree選出前30個基因作為核心基因。將模塊中的Hub基因與所得的核心基因取交集,即得到與不同泌乳時期或繁殖調控相關的關鍵基因。

2 結 果

2.1 基因共表達網絡的構建

對48個樣本進行聚類分析,發現3個離群樣本,對離群樣本進行剔除后選擇45個樣本進行分析,樣本樹狀與性狀熱圖如圖1A所示。根據數據自由度和連通度分析確定最佳軟閾值數值取12,進行無尺度網絡的構建。對模塊特征基因進行聚類,對紅線以下(高度<0.05)的模塊進行合并(圖1B),共得到14個模塊(圖1C)。對模塊特征值與表型信息值進行相關性分析,選擇與泌乳早期(EL)相關性最強tan模塊(r=0.54,P=1×10-4),與泌乳中期(ML)相關性最強greenyellow模塊(r=0.58,P=3×10-5),和與繁殖力相關性最強black模塊(r=-0.57,P=4×10-5)為目標模塊(圖1D)。

A. 樣本聚類樹圖;B.模板特征基因聚類樹;C.模塊聚類樹;D.模板-性狀相關性圖A. Sample dendrogram and trait heatmap; B. Template feature gene clustering tree; C. Gene dynamic splicing clustering tree; D. Template and phenotype association analysis

2.2 泌乳早期肝臟中相關基因的共表達網絡及關鍵基因分析

對tan模塊進行GS-MM相關性驗證,結果表明tan模塊中基因與泌乳早期相關性顯著(P=1.5×10-9,圖2A),模塊內連接度排名前30的Hub基因見表1。

表1 各模塊中的hub基因

A.GS-MM分析散點圖;B. tan模塊KEGG富集分析;C. tan模塊GO富集分析;D. PPI網絡核心基因互作圖A. Scatter plots of GS-MM analysis; B. Tan module KEGG enrichment analysis; C. Tan module GO enrichment analysis; D. PPI network core genes interaction diagram

KEGG分析結果顯示,與tan模塊關聯的主要功能信號通路包括:內質網蛋白質加工、代謝信號通路、N-聚糖生物合成、蛋白質分泌、不同亞型N-聚糖生物合成、核苷酸糖生物合成、補體和凝血級聯、丙酸代謝、丙酮酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等(圖2B)。GO分析結果表明,與tan模塊關聯的主要生物學過程有:信號肽加工、內質網應激的響應、蛋白質聚合、蛋白N連接糖基化、血小板激活、內源性肽酶活性的負調控、纖維蛋白溶解、介導囊泡由內質網到高爾基體的轉運、羧酸代謝過程和急性期反應;與tan模塊關聯的主要細胞組分包括:信號肽酶復合物、低聚糖轉移酶復合物、高密度脂蛋白顆粒、纖維蛋白原復合物、細胞外隙、內質網膜、內質網腔等;與tan模塊關聯的主要分子功能包括:結構分子活性、絲氨酸型內肽酶抑制劑活性、受體結合、蛋白質二硫氧化還原酶活性、蛋白質二硫異構酶活性、L-乳酸脫氫酶活性、整合素結合、同蛋白結合、酶激活劑活性和核糖核酸內酶活性等(圖2C)。

Tan模塊中Hub基因與PPI網絡分析核心基因取交集得到的關鍵基因有12個,分別為:RPN1、SEC61A1、SEC61B、SEC61G、SSR1、SSR3、STT3A、DAD1、DDOST、ERLEC1、HM13和OSTC(圖2D)。

2.3 泌乳中期與妊娠后期肝臟中相關基因的共表達網絡及關鍵基因分析

對greenyellow模塊進行GS-MM相關性驗證,結果表明greenyellow模塊中基因與泌乳中期相關性顯著(P=0.002 5,圖3A)。模塊內連接度排名前30的Hub基因見表1。

A. GS-MM分析散點圖;B. Greenyellow模塊KEGG富集分析;C. Greenyellow模塊GO富集分析;D. PPI網絡核心基因互作圖A. Scatter plots of GS-MM analysis; B. Greenyellow module KEGG enrichment analysis; C. Greenyellow module GO enrichment analysis; D. PPI network core genes interaction diagram

KEGG分析結果顯示,與greenyellow模塊關聯的主要功能信號通路包括:病毒性心肌炎、Ⅰ型糖尿病、肺結核、弓形體病、金黃色葡萄球菌感染、類風濕性關節炎、吞噬小體、百日咳、溶酶體、白細胞跨內皮細胞遷移、利什曼病、炎癥性腸病、人類T細胞白血病病毒Ⅰ型感染、造血細胞譜系、移植物抗宿主病、EB病毒感染、補體和凝血級聯、細胞黏附分子、抗原處理和呈遞以及同種異體移植排斥等(圖3B)。GO分析結果表明,與greenyellow模塊關聯的主要生物學過程有:細胞形狀調控、磷脂酰肌醇3-激酶信號的正向調控、血管生成的正向調控、炎癥反應、免疫反應、細胞遷移、通過MHC II類抗原和外源性肽抗原的呈遞、抗原加工呈遞和血管生成等;與greenyellow模塊關聯的主要細胞組分包括:受體復合體、MHCⅡ類蛋白復合體、膜筏、溶酶體、免疫突觸、粘著斑、細胞外間隙、質膜外側、細胞表面和基底外側質膜等;與greenyellow模塊關聯的主要分子功能包括:結構跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、受體結合、蛋白質同二聚體活性、蛋白結合、整合素結合、肝素結合、鈣依賴蛋白結合、鈣粘蛋白結合、淀粉樣蛋白結合和肌動蛋白絲結合等(圖3C)。

Greenyellow模塊中Hub基因與PPI網絡分析核心基因取交集得到的關鍵基因有6個,分別為ITGAL、ITGB2、LAPTM5、PTPRC、C3AR1和CTSS(圖3D)。

2.4 繁殖力相關基因在肝臟中的共表達網絡及目標基因分析

對black模塊進行GS-MM相關性驗證,結果表明black模塊中基因與低繁殖力相關性顯著(P=3.8×10-21,圖4A)。模塊內連接度排名前30的Hub基因見表1。

A. GS-MM分析散點圖;B. black模塊KEGG富集分析;C. black模塊GO富集分析;D.PPI網絡核心基因互作圖A. Scatter plots of GS-MM analysis; B. Black module KEGG enrichment analysis; C. Black module GO enrichment analysis; D. PPI network core genes interaction diagram

KEGG分析結果顯示,與black模塊關聯的主要功能信號通路包括:淀粉和蔗糖代謝、胰島素抵抗、粘著斑、肌動蛋白細胞骨架的調節、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、胰島素信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的中樞碳代謝、Ⅱ型糖尿病、甲狀腺激素信號通路、黏附連接、胃癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、mTOR信號通路、FoxO信號通路、胰高血糖素信號通路、C型凝集素受體信號通路、癌癥通路以及子宮內膜癌等(圖4B)。GO分析結果顯示,與black模塊關聯的主要生物學過程有:蛋白質磷酸化、蛋白去磷酸化、葡萄糖輸入的正向調節、肽基-蘇氨酸磷酸化、應力纖維組裝負調控、Rho蛋白信號轉導負調控、細胞遷移的負調節、眼睛的胚胎視網膜形態發生、胚胎眼形態發生以及細胞對紫外線的反應;與black模塊關聯的主要細胞組分包括:受體復合體、核漿、核斑點、高爾基體、初級內體、胞漿、細胞質、細胞表面、細胞-細胞連接和陷窩;與black模塊關聯的主要分子功能包括:鋅離子結合、小GTPase結合、核糖核酸結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、核小體依賴性ATP酶活性、甘露糖寡糖1,2-α-甘露糖苷酶活性、胰島素受體結合、胰島素結合、水解酶活性,水解O-糖基化合物以及ATP結合(圖4C)。

Black模塊中Hub基因與PPI網絡分析核心基因取交集得到的關鍵基因有4個,分別為PDS5A、ROCK1、AQR、和LTN1(圖4D)。

2.5 各模塊篩選到的關鍵基因mRNA表達水平分析

對tan、greenyellow及balck模塊中篩選到的肝臟組織中與泌乳時期或繁殖力相關的關鍵基因進行表達水平分析,并繪制基因在各樣本中的表達水平熱圖(圖5),結果顯示:tan模塊中的關鍵基因在妊娠后期表達水平最高、在泌乳中期表達水平最低;Greenyellow模塊中的關鍵基因在泌乳早期表達水平較高、在泌乳中期表達水平較低;balck模塊中的基因在高繁殖力組中的表達水平高于低繁殖力組。

3 討 論

本研究通過構建荷斯坦奶牛肝臟組織中與泌乳時期以及繁殖力相關的基因共表達網絡,得到了肝臟中與不同泌乳時期相關的tan模塊、greenyellow模塊以及與繁殖力正相關的black模塊。且分別篩選出12、6及4個與目標性狀相關的關鍵基因。

在泌乳早期,荷斯坦奶牛的肝臟需要加強對葡萄糖、脂肪酸和氨基酸等物質的代謝和利用,以保證能量和營養物質的供應[19]。此外,肝臟在泌乳早期還需要清除乳酸、亞硝酸和其它代謝廢物,維持內環境的穩定性[20]。蛋白質糖基化是一種常見的蛋白質翻譯后修飾類型,糖類物質在糖基轉移酶催化下與蛋白質上特定氨基酸殘基相連形成糖苷鍵[21]。與糖基分子互作的蛋白稱為糖結合蛋白(glycan-binding protein,GBP),參與調控細胞信號識別與傳遞、細胞內吞、細胞生長、分化、凋亡等生物學過程[22]。肝臟組織發生病變時,GBP的結構及其次級產物與正常肝臟組織存在顯著差異,因此能夠作為判斷特異性肝臟疾病的標志物[23]。本研究篩選出的與泌乳初期荷斯坦奶牛肝臟代謝關鍵基因中:RNP1編碼一種核糖體結合蛋白,在肝細胞中參與蛋白質高效轉運,與細胞凋亡和應激響應有關[24];SEC61A1、SEC61B、SEC61 G共同編碼轉錄因子Sec61,在蛋白質合成與轉運過程發揮重要作用[25];SSR1、SSR3編碼兩種糖蛋白,能夠與Sec61發生蛋白互作,增強內質網活性、促進蛋白質運輸[26];SST3A、DDOST均是蛋白質N-糖基化的催化酶基因[27];ERLC1、OSTC編碼的蛋白均是內質網糖蛋白組分,參與糖蛋白修飾、內質網質量控制等過程[28-29];HM13參與糖酵解過程,是能量代謝穩態和氧化應激響應的重要標志物之一[30]。綜合發現認為,在泌乳初期荷斯坦奶牛肝臟中,蛋白質合成與轉運相關代謝過程旺盛,蛋白質糖基化這一蛋白質翻譯后修飾類型可能是參與調控這一時期肝臟蛋白合成、能量代謝與應激響應等作用的關鍵生物學過程。泌乳初期肝臟糖基化相關酶及基因編碼蛋白的表達及功能研究,是潛在的泌乳初期荷斯坦奶牛代謝穩態失衡的有效監測標準或重要調控途徑之一。

泌乳中期與妊娠末期都是荷斯坦奶牛重要的生理時期,它們的肝臟代謝也存在許多異同點。在這兩個階段,肝臟組織均扮演著能量代謝、脂肪代謝及葡萄糖代謝的穩態調節者,同時也是機體免疫功能的重要參與者[31];不同點在于,奶牛在泌乳中期需要更多能量維持泌乳、同時需要調節血糖、血脂水平穩定以支持乳汁合成,而妊娠末期則需要更多營養以支持胎兒生長發育、能量供應不足時需要分解儲存的糖原供能[32]。本研究發現,荷斯坦奶牛泌乳中期及妊娠末期與greenyellow模塊均存在顯著相關,而greenyellow模塊中基因的功能主要富集在疾病相關通路,如金黃色葡萄球菌感染、機體的炎癥反應、免疫反應以及急性期等。本模塊中篩選到的6個關鍵基因中:ITGAL和ITGB2基因編碼整合素,能夠保護肝臟免受異常代謝或病變的損傷[33];LAPTM5編碼一種在免疫細胞中優先表達的蛋白質,它與泛素連接酶的Nedd4家族相互作用,被鑒定為炎癥信號通路的正調節劑以及預測高血壓患者LVH的潛在生物標志物[34];PTPRC基因編碼CD45蛋白,是免疫細胞的標記基因之一[35];C3AR1和CTSS基因均與炎癥反應和免疫系統功能相關[36-37]。由此推測,無論處于泌乳中期或妊娠末期,奶牛機體均處于疾病易感狀態;外界環境或內在因素誘導的炎癥反應、免疫系統功能損傷或營養代謝性疾病作為威脅奶牛健康的主要原因,對奶牛肝臟功能調控造成巨大挑戰。

目前認為,對產奶性狀的高強度選擇導致了奶牛繁殖性能衰退,但營養因素、疾病和健康狀況、生殖管理等因素同樣對奶牛繁殖性能具有重要影響[38]。本研究所使用的數據集中,評判奶牛個體繁殖力高低的主要依據是經過長期選擇、不同家系的荷斯坦奶牛產犢間隔性狀的估計育種值?？梢钥吹?肝臟組織中與繁殖力相關的black模塊中基因所富集到的多數信號通路包括淀粉和蔗糖代謝、胰島素抵抗、GFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、胰島素信號通路、Ⅱ型糖尿病、甲狀腺激素信號通路、黏附連接、mTOR信號通路、FoxO信號通路、胰高血糖素信號通路等,與肝臟自身發揮的主要代謝功能高度符合,表明肝臟代謝能力與荷斯坦奶牛的繁殖能力高度相關,這也部分解釋了肝臟代謝旺盛會促使奶牛體內與發情、排卵相關激素分解,進而減弱了奶牛繁殖能力的說法[39-40]。本研究通過分析篩選到的與繁殖力相關的4個關鍵基因PDS5A、ROCK1、AQR和LTN1,它們在肝臟代謝及奶牛繁殖性能的協同調控方面的功能仍待深入驗證。

4 結 論

本研究使用WGCNA、PPI、基因功能富集等生物信息學方法,鑒定得到了不同泌乳時期荷斯坦奶牛肝臟代謝的關鍵基因,其中泌乳早期12個(RPN1、SEC61A1、SEC61B、SEC61G、SSR1、SSR3、STT3A、DAD1、DDOST、ERLEC1、HM13和OSTC)、泌乳中期及妊娠后期6個(ITGAL、ITGB2、LAPTM5、PTPRC、C3AR1和CTSS),鑒定得到繁殖力相關的荷斯坦奶牛肝臟代謝關鍵基因4個(PDS5A、ROCK1、AQR和LTN1),為高繁殖力及高產奶牛培育方向的科研工作積累了理論資料。