細胞死亡的新方式
——鐵死亡與銅死亡

王 浩,肖金龍,沈 玨,趙金剛,王 帥,劉 根,趙 汝,肖 鵬*,高 洪*

(1.云南農業大學食品科學技術學院,昆明 650201;2.云南農業大學動物醫學院,昆明 650201;3.云南農業大學動物科學技術學院,昆明 650201)

細胞死亡是一個復雜的過程,可通過多種子程序執行。以往的研究已鑒定出多種細胞死亡形式,并將其分為細胞意外死亡和調節性細胞死亡(regulated cell death,RCD)[1]。相對于細胞意外死亡,調節性細胞死亡可由一系列分子機制和信號通路介導,包括凋亡[2]、焦亡[3]、壞死性凋亡[4]和自噬性死亡[5]等。鐵死亡[6]和Science最近報道的銅依賴性細胞死亡[7]是新發現的調節性細胞死亡形式。結合本課題組對大腸桿菌誘導不同形式RCD及相關信號通路調控機制的研究[8],本文總結了鐵死亡和銅死亡,并以鐵死亡為參考提出了銅死亡的研究空白,為進一步探索銅死亡提供了研究方向。

1 銅死亡與鐵死亡

Tsvetkov等[7]在Science上發表的研究提出了一種由銅離子誘導的新型細胞死亡形式,他們發現,用于治療腫瘤的銅離子載體-伊利司莫(Elesclomol,ES)包裹銅離子進入胞內后會殺死細胞,并具有Cu+劑量依賴性,而單獨的ES進入胞內并不會誘導細胞死亡,表明細胞死亡是由過載的銅離子引起的。細胞內過量的銅離子會與線粒體三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)有關的硫辛酸化二氫脂酰胺S-乙酰乙酰轉移酶(dihydrolipoamide S-acetyltransferase,DLAT)結合并發生寡聚化,導致蛋白質毒性應激,引發一種可稱為銅死亡(cuproptosis)的新型細胞死亡形式[7],這種類型的細胞死亡取決于線粒體呼吸受損和隨后的線粒體蛋白應激,與線粒體氧化應激無關。

同為金屬離子過載引起的鐵死亡(ferroptosis)是依賴于胞內鐵離子積累從而引起大量脂質過氧化的調節性細胞壞死[6]。鐵死亡主要由鐵依賴性磷脂過氧化驅動,并由多種代謝途徑調節,這些代謝途徑主要包括鐵處理、線粒體活性、氧化還原穩態、氨基酸和脂質代謝,以及與各種疾病相關的信號通路[9-10]。銅死亡的誘因是胞內金屬離子Cu+的大量積累,而鐵死亡是由胞內鐵的過載引起大量脂質過氧化造成的,二者主要由金屬離子誘導,在形成機制上具有一定相似性。

1.1 銅死亡的形態學特征

Tsvetkov等[7]對銅死亡的發生機制進行了研究,但遺憾的是該研究未對其形態特征做出具體的說明。研究表明,發生鐵死亡的細胞線粒體形態發生了改變(圖1),發生鐵死亡的細胞通常表現為質膜完整性喪失,細胞和細胞器腫脹以及染色質適度凝結;線粒體異常,如凝結或腫脹、膜密度增加、嵴減少或缺失及外膜破裂[11-12]。銅死亡的進程集中于線粒體,推測細胞線粒體發生了變化,其形態學變化可能類似于鐵死亡的線粒體形態異常,具體有待進一步研究。

單一白色箭頭指向線粒體萎縮;成對的白色箭頭指向染色質凝結;成對黑色箭頭指向細胞和線粒體腫大及質膜破裂;黑色箭頭指向形成雙膜囊泡Single white arrows point to mitochondrial atrophy; Paired white arrows point to chromatin condensation; Paired black arrows point to cytoplasmic and organelle swelling and plasma membrane rupture; Single black arrow point to forming a double membrane vesicle

研究表明,ATP7b堿基突變誘導的Wilson病發生了銅死亡[13],本文便以Wilson病的細胞病理變化來推測銅死亡的具體形態學特征。透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察Wilson病患者的肝細胞發現線粒體外膜正常,嵴間隙狹窄、扭曲;線粒體濃縮,內外膜分離,基質密度增加或者由大的空泡取代;線粒體內存有不同大小的線粒體包裹體,包含無定形、松散排列的顆粒狀物質;粗面內質網的囊體圍繞著一些線粒體[14],鐵死亡與銅死亡形態學比較見表1。

表1 鐵死亡與銅死亡比較

1.2 銅、鐵死亡與金屬離子代謝

1.2.1 銅、鐵離子的代謝 鐵、銅是哺乳動物細胞內的兩個重要微量元素,在許多重要的生理過程中起關鍵作用,如神經遞質的傳遞、細胞呼吸、鐵離子的攝取和抗氧化應激等,這些生理過程均依賴于銅、鐵離子的存在[15-16]。細胞內銅、鐵離子穩態失衡時,會觸發多種疾病,銅離子水平下降會導致Menkes病、阿爾茲海默病等神經退行性疾病[17];在肝中,銅的累積會引起肝炎、Wilson病等[18-19]。鐵代謝異常同樣會導致諸多疾病,如鐵過載癥[20]、缺鐵性貧血[21]等。

Cu+主要在腸道吸收,并通過銅轉運蛋白1(copper transporter1,CTR1)轉運進入胞內。銅轉運ATP酶α(copper-transporting ATPase alpha,ATP7A)和β(ATP7b)在外周組織和肝細胞的Cu+轉運中起不同作用,ATP7A將Cu+轉運到門靜脈,然后通過腸道吸收進入外周循環并到達肝[22];而在胞內,ATP7A將Cu+轉運到反式高爾基體網絡和囊泡中[15]。ATP7b則調節胞內銅離子的排泄,當胞內銅過載時,Cu+與抗氧化劑1銅伴侶蛋白(antioxidant 1 copper chaperone,ATOX1)結合,并通過ATP7b的N端金屬結合域轉移到膽管膜處,從而進入膽汁從體內排泄多余的銅[22]。細胞對鐵的攝取主要依賴轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)和二價金屬離子轉運體1(divalent metal transportor 1,DMT1)[23]。膜鐵轉運蛋白1(ferroportin 1,FPN1/SLC40A1)是細胞中唯一的鐵外流通道,當細胞內的Fe2+到達基底側,即可被FPN1轉運至細胞外,并被膜鐵轉運輔助蛋白(hephaestin,HEPH)或銅藍蛋白(ceruloplasmin,CP)氧化為Fe3+,隨后進入體液循環中以轉鐵蛋白(transferrin,TF)復合物的形式存在,供給各組織器官[24-26]。圖2展示了腸上皮細胞鐵和銅的吸收、轉運以及分布機制。

圖2 腸上皮細胞鐵和銅的吸收、轉運及分布機制[16]Fig.2 Mechanisms of absorption, transport, and distribution of iron and copper in intestinal epithelial cells[16]

1.2.2 鐵死亡的機制 Erastin、RSL3是經典的鐵死亡激活劑,通過增加胞內鐵離子的積累從而誘導細胞鐵死亡[11],而使用鐵離子螯合劑可有效抑制鐵死亡,這表明鐵離子的穩態在鐵死亡中扮演重要角色。鐵能夠通過芬頓反應直接產生過量的ROS,進而增加氧化損傷[11,27],鐵還能增加脂質過氧化和氧穩態酶的活性,如:脂氧合酶(lipoxygenase,ALOX)或EGLN脯氨酸羥化酶[28]。脂質過氧化是一種自由基驅動的反應,主要影響細胞膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)[29-30],PUFA在ROS的攻擊和脂氧合酶的作用下產生脂質過氧化物,最終導致細胞膜破裂進而死亡[31-32];而谷胱甘肽過氧化酶4(recombinant glutathione peroxidase 4,GPX4)可以通過其酶活性阻止脂質過氧化物的毒性,將脂質氫過氧化物還原為無毒脂質醇,維持膜脂質雙分子層的穩態[33-34]。此外,前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)和參與脂肪酸代謝的酶?；o酶a合成酶長鏈家族成員4(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)過表達被認為是鐵死亡的生物標志[33]。鐵死亡的分子機制和相關信號通路見圖3。

Erastin.埃拉斯汀-鐵死亡激活劑;Sulfasalazine.氮磺胺吡啶-鐵死亡激活劑;Glutamate.谷氨酸鹽;Sorafenib.索拉非尼-鐵死亡激活劑;Ebselen.依布硒-谷胱甘肽過氧化物酶模擬物;Glutathione.谷胱甘肽;AOA.氨基氧乙酸;Glutamine.谷氨酰胺;α-ketoglutarate.α-酮戊二酸;Glucose.葡萄糖;Citrate.檸檬酸鹽;GKT137831.NOX1/NOX4 雙重抑制劑;Zileuton.5-脂氧合酶抑制劑;U0126.選擇性的Src家族激酶抑制劑;U0126.選擇性的 MEK1和MEK2抑制劑;SB202190.選擇性p38 MAPK抑制劑;SP600125.廣譜JNK抑制劑。a. 鐵死亡的核心調節因子;b～d. 鐵代謝的作用:b. 鐵代謝;c. ROS代謝;d. MAPK通路Erastin.Ferroptosis activator; Sulfasalazine.Ferroptosis activator; Glutamate.Glutamate; Sorafenib.A ferroptosis activator; Ebselen. A glutathione peroxidase mimetic; Glutathione. Glutathione; AOA. Aminooxyacetic acid; Glutamine. Glutamine; α-ketoglutarate. α-ketoglutarate; Glucose. Glucose. Citrate. Citrate; GKT137831. NOX1/NOX4 dual inhibitor; Zileuton. 5-lipoxygenase inhibitor; U0126. Selective Src family kinase inhibitor; U0126. Selective inhibitor of MEK1 and MEK2; SB202190. A selective p38 MAPK inhibitor; SP600125. Broad-spectrum JNK inhibitor. a. Core regulators of ferroptosis;b-d. The role of iron metabolism:b. Iron metabolism; c. ROS metabolism; d. MAPK pathway

1.2.3 銅死亡的機制 研究發現,高度依賴線粒體呼吸的細胞對銅誘導的細胞死亡更為敏感,這反映了銅死亡與TCA循環的密切關聯。對ES-Cu+誘導的細胞進行全基因組CRISPR篩選,鑒定了參與銅死亡的幾個關鍵基因[7],包括鐵氧還蛋白1基因(ferredoxin 1,FDX1)和編碼硫辛酸途徑相關酶的其他6個基因,如脂肪酸轉移酶1基因(lipoyltran sferase-1,LIPT1),硫辛酸合酶基因(lipoic acid synthase,LIAS)、二氫硫辛酰胺脫氫酶基因(dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)和硫辛酸蛋白靶點,如丙酮酸脫氫酶(PDH)復合物,包括丙酮酸脫氫酶E1-α亞基基因(pyruvate dehydrogenase E1-alpha,PDHA1)、丙酮酸脫氫酶β亞基基因(PDHB)和二氫硫辛酰胺轉乙?；富?DLAT)。

FDX1是蛋白質硫辛酸化的上游調節因子,可促進DLAT和DLST發生蛋白質硫辛酸化,當胞內銅離子過量時,會使得這種蛋白質硫辛酸化修飾減少,同時過量的Cu+會與硫辛酸化的DLAT結合,發生寡聚化生成低聚物,這種低聚物是不溶性的且對細胞具有毒性[36]。由于組成丙酮酸脫氫酶的DLAT發生了寡聚化,使得丙酮酸脫氫酶活性丟失,這抑制了丙酮酸到乙酰CoA的轉化,并最終影響TCA循環。值得注意的是,在FDX1的調控下,細胞內過量的銅離子抑制了Fe-S簇蛋白的合成,導致Fe-S簇蛋白丟失[36]。目前,銅死亡可以分為生理狀態下銅離子載體遞送銅離子進入細胞誘導的銅死亡,及病理狀態下銅離子轉運蛋白表達失衡誘導的,如CTR1的過表達或ATP7b表達受抑制時,均會使得胞內銅離子過載,銅死亡分子機制見圖4。

圖4 銅死亡分子機制Fig.4 Molecular mechanism of cuproptosis

2 鐵死亡與感染性疾病

2.1 鐵死亡與細菌感染

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是一種人畜易感的病原體,研究發現E.coli感染小鼠巨噬細胞后,FPN的表達降低,使得胞內亞鐵含量升高,而三價鐵含量無明顯變化,脂質ROS含量增加,表明E.coli感染誘導了鐵死亡[37]。有研究發現,能夠引起人和多種動物結核病的結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染巨噬細胞后,會上升胞內Fe2+及脂質過氧化物水平并降低谷胱甘肽(glutathione,GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)活性,最為關鍵的是在感染后使用Fer-1及鐵螯合劑可以緩解細胞的死亡[38],此外,MTB分泌的蛋白酪氨酸磷酸酶A(protein tyrosine phosphatase A,PtpA)是MTB誘導鐵死亡的關鍵因子[39]。人畜共患病原菌——銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)分泌的脂氧合酶(lipoxygenase,pLoxA),可將宿主花生四烯酸-磷脂酰乙醇胺(arachidonic acid-phosphatidylethanolamines,AA-PE)氧化為15-氫過氧-AA-PE(15-hydroperoxy-AA-PE,15-HOO-AA-PE),并引發鐵死亡[40]。

2.2 鐵死亡與病毒感染

蛋白質組學分析感染豬流感病毒(swine influenza virus,SIV)后的A549細胞,發現鐵死亡通路最顯著富集,并且下調了TF的表達,此外,SIV感染使得胞內Fe2+含量升高,ROS過量生成,重要的是Fer-1緩解了SIV感染引起的GSH下調[41];此外,使用鐵死亡激活劑Erastin可以抑制豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在Vero細胞中的復制[42]。新城疫病毒(Newcastle-disease-virus,NDV)感染會升高人膠質瘤細胞胞內亞鐵水平,促進氧化應激,并通過p53-SLC7A11-GPX4途徑誘導細胞發生鐵死亡[43]。寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一種蚊媒病毒,對ZIKV感染的小鼠大腦進行RNA-seq分析,發現鐵死亡通路參與其中,并且ZIKV抑制了SLC40A1的表達,上調了TRF的表達,這使得胞內鐵累積,從而誘導鐵死亡[44]。單純皰疹病毒1(Herpes simplex virus 1,HSV1)在感染星形膠質細胞和小膠質細胞后,會使得線粒體發生鐵死亡的典型病變,同時使得Fe2+過載、ROS積累、GSH耗竭以及脂質過氧化的發生[45]。

3 銅死亡與疾病

3.1 Wilson病與銅死亡

Wilson病(Wilson′s disease,WD)是由銅轉運酶Atp7b編碼基因的突變引起的[46-47]。Atp7b功能缺陷會導致膽汁銅排泄障礙和肝細胞內銅超載,引發肝細胞損傷。Atp7b-/-小鼠是Wilson病常用的評估模型,具有人類臨床特征。新生的Atp7b-/-小鼠存在銅缺乏,5月齡時,肝、腎和腦中銅含量可高達正常水平的60倍[47]。研究表明,Atp7b-/-小鼠肝中出現了銅死亡現象,包括硫辛酸化相關蛋白和Fe-S簇蛋白的丟失以及Hsp70豐度的增加[7]。因此,Wilson病的治療可以從銅死亡入手,如用低毒性的銅螯合劑四硫鉬酸鹽(tetrathiomolybdate,TTM)來減少銅離子在肝細胞的積聚,或使用CTR1抑制劑來降低細胞銅輸入蛋白的活性,減少銅離子的輸入并提高細胞活性。

3.2 癌癥與銅死亡

研究表明,相較于健康組織,腫瘤細胞需要更高水平的銅,且癌細胞對銅的需求更為迫切[48]。報道指出,動物模型和多項癌癥患者的腫瘤組織或血清中銅含量都升高,包括乳腺癌[49]、肺癌[50]和前列腺癌[51]等。此外,銅離子可直接激活多種促血管生成因子,如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)[50],促進血管生成,進而輔助腫瘤的產生、生長及轉移。

針對癌細胞對銅離子依賴性的現象,目前開展了兩種治療方法:一種是使用銅離子螯合劑來耗盡癌細胞內的銅離子池,另一種是補充銅離子載體來平衡癌細胞內的銅含量。其中,銅螯合劑——TTM可用于聯合化療,提高激酶抑制劑藥物對BRAF驅動的MAPK等致癌信號通路的療效,銅離子載體如雙硫侖(disulfiram,DSF)或ES則可以靶向運輸銅離子進入癌細胞線粒體,使癌細胞內銅穩態失衡,從而誘導銅離子相關的細胞死亡,長期臨床試驗表明,TTM可用于耗盡原發性腫瘤中的銅,阻止銅依賴的腫瘤轉移,并不影響健康組織的功能[52]。

3.3 感染與銅死亡

銅是一種很好的抑、殺菌劑[53-54],其抗菌作用已被廣泛用于醫療保健和農業。當宿主受到病原體感染時,會調動大量銅離子到血液中,起到殺滅病原體的作用,這可能是機體的防御機制,通過銅離子的富集,對入侵的病原菌進行殺滅;另一方面,病原體可能為了逃逸銅離子的抑、殺作用,通過某種機制將富集的銅離子轉運進入胞內使得銅離子失衡,從而誘導銅死亡。

白色念珠菌(Candidaalbicans,Cal)感染小鼠后使得血清和肝中銅離子含量升高[55];耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌引起的尿道感染會誘導尿銅和血漿銅藍蛋白含量升高,且泌尿道中銅離子含量升高[56];感染新型隱球菌的小鼠肺泡免疫細胞內可見大量銅離子累積[57];此外,ZIKV感染星形膠質細胞后會使得銅釋放的轉運蛋白ATP7b表達下調,使用銅離子螯合劑可以緩解ZIKV感染引起的細胞活力下降[58]?；谶@些報道,表明在病原體感染機體后會使得血漿或感染部位的銅離子含量升高,并且在ZIKV感染的細胞中檢測到了ATP7b表達下調,這為胞內銅離子失衡提供了條件;雖然目前沒有有力的證據表明病原體感染會誘導胞內銅離子失衡,但這些研究提示了感染存在誘導胞內銅離子失衡的的可能性,也為進一步誘導銅死亡提供了先決條件。

3.4 銅死亡的調節

細胞發生銅死亡的關鍵因素是胞內銅離子的累積,這意味著可通過銅離子載體的靶向遞送誘導銅死亡,或者是以銅離子螯合劑清除胞內過載的銅離子來緩解銅死亡。

ES是一種高效的銅離子載體,可將銅離子高效、靶向地運輸到細胞線粒體內,減輕Menkes病的病理損傷和死亡率[59],并且ES的高效遞送可以誘導細胞發生銅死亡[7]。TMT是經典的銅離子螯合劑,顯示出高效的銅離子螯合作用和非常低的毒性,目前已被運用于WD的臨床治療[60],此外,TMT已被證明可以緩解銅死亡[7]。最近,研究人員開發了一種新的銅離子螯合劑透明質酸鹽-二氨基己烷/黑磷(HA-DAH/BP),用于捕獲肝中積累的銅離子以治療WD,復合物顯示出高肝細胞特異性靶向效率、選擇性銅捕獲能力,并對細胞具有低毒性[61],有望運用于銅死亡的抑制。

4 結論與展望

在獸醫研究中MTB[38]、P.aeruginosa[40]、SIV[41]、PEDV[42]、NDV[43]和ZIKV[44]是重要的病原體,均可引起人或動物的感染;前期的研究已表明這些病原體感染能夠改變胞內亞鐵離子的含量,促進氧化應激,并誘導鐵死亡的發生。哺乳動物體內銅、鐵離子的代謝具有一定的交集[16],病原體感染能夠破壞胞內鐵離子的穩態并誘導鐵死亡,這期間可能影響了銅離子的穩態,然而銅死亡是否參與病原體感染還需進一步研究。目前已有證據表明,在感染性疾病中,宿主血液和感染部位中的銅含量都顯著升高[57,62],這是誘導胞內銅離子失衡的先決條件,然而在感染性疾病中細胞是否發生了銅死亡尚不清楚;大量的證據顯示,病原體感染后能夠上調胞內亞鐵離子的水平,從而誘導鐵死亡,目前對鐵死亡的研究已經相對成熟,二者均由金屬離子累積誘導,未來銅死亡的研究可以參照鐵死亡的研究進行。

依賴胞內銅離子穩態的銅死亡,目前的研究僅限于生理狀態下使用ES轉運銅離子到線粒體、過表達CTR1導致銅累積以及病理狀態下Wilson病模型鼠中ATP7b的功能缺失導致胞內銅過載。而對于銅死亡的研究尚有許多方面是不清楚的,如:過量銅離子誘導Fe-S簇蛋白丟失的具體作用機制是什么,其對最終的銅死亡有何作用;此外,雖已基本明了銅死亡分子機制,但其形態學標志和與其他細胞死亡方式有何差異目前尚不清楚。