4種馬尾藻附生菌群結構比較研究

郭戰勝 陳雯靜 常麗榮 梁振林 施坤濤

(1. 山東大學海洋學院, 威海 264200; 2. 威海長青海洋科技股份有限公司, 榮成 264300;3. 威海市環翠區海洋發展研究中心, 威海 264200)

馬尾藻屬(Sargassum)是隸屬于棕色藻門Ochrophyta、褐藻綱Phaeophyceae、墨角藻目Fucales、馬尾藻科Sargassaceae的一類大型底棲海藻, 廣泛分布于世界范圍內溫帶和熱帶海域。馬尾藻屬種類繁多, 據AlgaeBase網站記錄, 全球種類超過900種(包括亞種、變種和變型)。我國海域報道了131種馬尾藻, 主要分布于黃海、東海和南海, 其物種多樣性和地理分布呈現出“北少南多”的特點[1]。其中, 我國黃海海域潮間帶常見的馬尾藻主要有鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、海黍子(S.muticum)、海蒿子(S.pallidum)和銅藻(S.horneri)。

馬尾藻作為海藻場的重要支撐種, 構建了獨特的馬尾藻場生境系統, 不僅為魚類等海洋動物提供了理想的棲息地、庇護所和索餌場, 維持較高的海洋生物多樣性, 還具有營養鹽調控(如吸收氮、磷和碳等生源要素)的生態功能, 對海洋生態系統的平衡和穩定發揮著重要作用[2,3]。此外, 馬尾藻是一類具有極大開發價值的經濟藻類, 藻體本身或提取物是食品、醫藥、工業和飼料等行業的重要原料[4—6]。近年來, 在全球氣候變化、海洋酸化等自然和人為多重因素影響下, 馬尾藻資源面臨一定程度的威脅, 開展馬尾藻生態系統相關的基礎研究、構建馬尾藻資源修復技術及其生態工程應用是目前研究的熱點[2,7—10]。

但是, 目前對于馬尾藻的基礎生態研究主要從宏觀層面入手, 鮮有涉及微觀生態層面。大型海藻及其表面附著的微生物形成了緊密的互利共生或者拮抗作用, 海藻的健康生長、代謝功能和物質循環等離不開微生物的作用, 而藻體周圍形成的“藻際微環境”又為微生物提供了附著基質和營養供給[11,12]。如果缺乏考慮與藻際微生物的相互作用, 大型海藻在海洋生態系統中無法發揮最佳功能[13]。研究表明, 大型海藻的種類、海藻的不同部位、生活史的不同階段和健康狀態等均會影響附著微生物的組成與結構, 呈現出宿主特異性(Host-specific)[14—17]。

隨著國家對馬尾藻海藻場構建的重視, 以及微生物高通量測序技術的不斷進步, 馬尾藻附生菌群的相關研究也在逐步深入開展[18—24], 而目前大部分的研究主要集中在某一種馬尾藻或者大空間尺度不同種類馬尾藻附生菌群結構的比較, 鮮有對同一生態位不同馬尾藻之間附生菌群多樣性的比較研究?；谇捌谡n題組對靖子灣潮間帶海藻資源調查結果, 我們發現該區域生長有黃海海域分布的4種優勢馬尾藻, 包括銅藻、海蒿子、海黍子和鼠尾藻, 4種近緣藻類生態位重疊, 其附生菌群是否存在差異有待于研究。本研究利用高通量測序對4種馬尾藻的附生菌群多樣性、群落結構組成和生態功能展開分析, 旨在為深入了解馬尾藻的生態作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2023年 3月 3日, 在山東省靖子灣潮間帶(37°33′19″N, 122°7′10″E)采集海黍子(S.muticum, 縮寫為SM)、海蒿子(S.pallidum, SP)、鼠尾藻(S.thunbergii, ST)和銅藻(S.horneri, SH) 4種馬尾藻, 在采集過程中保持馬尾藻藻體結構的完整性, 包括固著器、主枝、葉和氣囊。藻體經無菌海水沖洗, 以去除表面游離微生物, 用無菌棉簽擦拭藻體表面獲取大型藻類附生菌群。同時, 采集海藻周圍海水(W)1000 mL用于實驗對照, 海水經直徑為0.22 μm的微孔濾膜抽濾, 獲得海水微生物樣本。本研究中藻類和海水樣本1式3份, 所有樣本經液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 DNA 提取、16S rRNA 基因擴增和高通量測序

使 用 CTAB 法(Cetyltrimethylammonium Bromide)提取4種馬尾藻和海水樣本的基因組DNA。使用細菌通用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′)擴增細菌16S rRNA基因V3—V4高變區域(Hypervariable Regions)。擴增體系為30 μL, 包括15 μL的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)、0.25 μL正向和反向引物(0.2 μmol/L)、10 μL的基因組DNA模板(1 ng/μL)和4.5 μL的ddH2O。PCR擴增條件為: 98℃預變性1min; 98℃變性10s, 50℃退火30s, 72℃延伸30s, 共30個循環; 最后72℃延伸 5min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后使用TianGen通用型DNA純化回收試劑盒回收產物。使用 NEB Next?UltraTMⅡ FS DNA Library Prep Kit建庫試劑盒(New England Biolabs)構建文庫, 經過Qubit和 Q-PCR定量和檢測合格后采用北京諾禾致源科技股份有限公司的NovaSeq6000測序平臺進行 PE250測序。

在測序結束后, 截去Barcode序列和引物序列后使用FLASH軟件(V. 1.2.11)進行雙端序列拼接[25]。經flasp軟件(V. 0.23.1)進行數據質控后[26], 序列與Sliva物種注釋數據庫對比檢測去除嵌合體序列, 獲得有效數據(Effective Tags)。使用QIIME2軟件(V.QIIME2-202006)中的DADA2模塊對有效數據序列進行降噪, 并過濾掉豐度小于5的序列, 獲得ASVs(Amplicon Sequence Variants, 擴增序列變異)及特征表[27]。使用QIIME2軟件中的classify-sklearn模塊將得到的ASVs與Sliva 138.1數據庫比對得到每個ASV的物種注釋信息, 并將確定為葉綠體(Chloroplasts)、線粒體(Mitochondria)和真核生物(Eukaryotes)的序列刪除。各樣本數據經均一化處理后用于后續分析。

1.3 測序數據處理

本研究利用QIIME2計算馬尾藻附生菌群的α多樣性指數(包括Shannon指數和Chao1指數)。利用R軟件(V. 2.15.3)進行β多樣性數據分析, 基于Bray-Curtis距離矩陣進行無度量多維標定法分析(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling, NMDS), 對4種馬尾藻附生菌群結構差異可視化, 并通過置換多元方差分析(Permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)分析組間群落結構差異性是否顯著。4種馬尾藻組間微生物顯著差異物種由LEfSe軟件完成, LDA Score閾值默認為4.0[28]; 并通過MetaStat方法進一步分析不同馬尾藻組間在科水平上的物種顯著性差異。利用Tax4Fun軟件對馬尾藻附生菌群進行功能預測。微生物群落Venn圖、相對豐度環狀圖和NMDS分析圖在微科盟-生科云在線平臺(https://www.bioincloud.tech/)繪制。

2 結果

2.1 四種馬尾藻附生菌群結構多樣性分析

利用16S rRNA高通量測序技術, 4種馬尾藻和對照組海水的15個樣本共獲得1925625條序列, 經過拼接、質控、過濾嵌合體序列之后獲得1672824條高質量序列, 每個樣本有效序列數目為111521.6±15935.17。各樣本的測序覆蓋度均超過99.50%, 說明測序深度能夠很大程度上反映各樣本微生物的真實情況。經過物種注釋, 15個樣本共獲得8793ASVs,其中對照組海水樣本ASVs總數目和特有ASVs均最多, 4種馬尾藻中ST樣本ASVs數目最多, SH樣本最少(圖1c)。微生物群落的多樣性和物種豐富度通過Shannon指數和Chao1指數來表征(圖1a—b)。海水樣本微生物群落多樣性和豐富度明顯高于4種馬尾藻, SH和SM樣本的Shannon指數均顯著小于ST (P＜0.05), SP和ST樣本的Chao1指數顯著大于SH(P＜0.05), 說明SH樣本的微生物群落多樣性和豐度均最低。

圖1 四種馬尾藻附生菌群α多樣性(a—b), 韋恩圖(c)及基于Bray-Curtis距離的NMDS分析(d)Fig. 1 Alpha diversity indices (a-b), Venn diagram (c) of epiphytic microbial community on four gulfweeds and NMDS analysis based on Bray-Curtis distances (d)

基于Bray-Curtis距離對馬尾藻樣本開展NMDS分析, 結果顯示除SH樣本分布比較離散外, 其他種類樣本明顯聚集, 同時馬尾藻樣本與海水樣本距離較遠, 說明馬尾藻附生菌群與海水游離菌群存在明顯差異(圖1d)。PERMANOVA分析進一步比較4種馬尾藻組間微生物群落結構差異性是否顯著, 結果顯示不同組間P值均大于0.05, 說明組間微生物群落不存在顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 四種馬尾藻群落結構組成

通過與Sliva數據庫對比和物種注釋, 馬尾藻和海水樣本共檢測出58個門、123個綱、311個目、513個科和1015個屬的微生物種類。在門水平上,4種馬尾藻和海水樣本微生物群落結構組成相似,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)為主要優勢菌門, 相對豐度為80.39%—94.54% (圖2a)。藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、彎曲桿菌門(Campilobacterota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)和泉古菌門(Crenarchaeota)在部分樣本中相對豐度＞1%。酸桿菌門、綠灣菌門(Chloroflexi)和泉古菌門在海水樣本中富集, 相對豐度分別為2.20%、0.80%和1.74%, 而SM和SP樣本沒有檢測出酸桿菌門和泉古菌門, SP和SH沒有檢測出綠灣菌門, 相對豐度均為0。

圖2 基于門(a)和屬(b)水平的微生物群落結構組成Fig. 2 The composition of the microbial community at the level of phylum (a) and genus (b)

在屬水平上, 4種馬尾藻和海水樣本微生物群落結構組成存在明顯差異, 呈現出宿主特異性(圖2b)。Yoonia-Loktanella(2.46%—12.10%)、Rikenellaceae_RC9_gut_group(2.54%—7.02%)和UCG-005(2.84%—7.96%)為4種馬尾藻樣本優勢菌屬。不同馬尾藻絕對優勢菌屬存在差異, 例如:Yoonia-Loktanella為SM和SH樣本絕對優勢菌屬, 相對豐度分別為12.10%和11.71%; SP和ST樣本的絕對優勢菌屬分別為UCG-005(7.96%)和Rikenellaceae_RC9_gut_group(6.63%)。此外, 某些菌屬呈現出宿主特異性,Acaryochloris_MBIC11017和氣微菌屬(Aeromicrobium)為SM和SP樣本特有菌屬,Clade_Ia(SAR11)為SH和W樣本特有菌屬, 相對豐度高達10.31%和13.42%; 寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)為ST樣本特有菌屬(2.65%)。

為了進一步探究不同種類馬尾藻附生菌群的結構組成, 選擇相對豐度前10的ASVs進行分析(表1)。4種馬尾藻樣本相對豐度前10ASVs在物種間缺乏普遍性, 呈現出一定的宿主特異性。除了ASV7在SM、SP和ST樣本中的相對豐度均為前10外, 其他ASVs基本為宿主特有?；诳扑浇M成上也存在明顯差異, 例如: SM樣本相對豐度前10ASVs主要隸屬于紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)等, 而紅桿菌科、Clade_Ⅰ、硫發菌科(Thiotrichaceae)等在SH樣本中富集。

2.3 組間差異性分析

為了進一步揭示4種馬尾藻樣本微生物群落結構組成差異, 利用LEfSe統計具有顯著性差異的生物標志物(Biomarkers; 圖3)。本研究共識別出18個Biomarkers, 其中W、SH、SM和ST樣本分別有9、4、3和2個Biomarkers。海水中游離菌群結構與馬尾藻附生菌群結構存在明顯差異, 導致海水樣本的Biomarkers數量最多。SH樣本中富含Peptostreptococcales-Tissierellales和疣微菌綱Verrucomicrobiae(疣微菌目Verrucomicrobiales和紅豆杉科Rubritaleaceae); SM樣本中的藍細菌綱Cyanobacteriia(藍細菌目Cyanobacteriales和異球藻科Xenococcaceae)相對豐度顯著高于其他樣本組; 而ST樣本富含顆粒狀球菌科(Granulosicoccaceae)?；诳扑降腗etaStat分析顯示4種馬尾藻樣本組間微生物群落差異物種主要集中在SM與其他3種馬尾藻樣本, SM-SH、SM-SP和SM-ST分別有15個、29個和28個科的物種相對豐度存在顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 LEfSe分析的進化分支圖Fig. 3 The cladogram of LEfSe analysis

2.4 功能預測

為了探究馬尾藻藻際微生物潛在的生態功能,本研究利用Tax4Fun軟件進行功能預測。在一級功能水平上, 4種馬尾藻樣本共涉及6類生物代謝通路,主要包括代謝(Metabolism, 相對豐度為45.47%—46.84%)、遺傳信息處理(Genetic information processing, 21.47%—23.86%)、環境信息處理(Environmental information processing, 11.82%—13.76%)和細胞過程(Cellular processes, 7.63%—8.28%)。代謝在所有樣本中為最主要功能, 其次為遺傳信息處理。此外, 4種馬尾藻樣本間在一級功能水平預測的基因豐度沒有顯著性差異(P＞0.05)。在二級功能水平上, 共注釋到44個二級代謝通路(圖4)。碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)在所有樣本組中相對豐度均為最高, 達到10.71%—11.13%。此外, 膜轉運(Membrane transport)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、復制和修復(Replication and repair)也為主要功能。在二級代謝通路中, SMSP、SM-SH和SM-ST分別有8個、4個和3個生物代謝通路存在顯著性差異(P＜0.05)。

圖4 第2水平上的Tax4Fun功能注釋聚類熱圖Fig. 4 Cluster heatmap of annotated function by Tax4Fun at the second level

3 討論

馬尾藻作為海藻場的重要支撐種, 在生境營造、資源修復、餌料場形成、碳匯功能等方面發揮著重要作用, 具有重大的經濟和生態價值。藻際微生物對于馬尾藻生態功能的發揮扮演著重要角色。本研究借助高通量測序技術對我國黃海海域典型的4種馬尾藻附生菌群結構進行比較, 解析不同種馬尾藻附生菌群多樣性和群落結構特征, 闡明其生態功能, 對深入了解馬尾藻的生態功能具有重要意義。

3.1 四種馬尾藻附生菌群多樣性

本研究通過16S rRNA高通量測序技術對黃海典型的4種馬尾藻(海蒿子、海黍子、銅藻和鼠尾藻)和對照組海水樣本進行了測序和數據分析, 發現所有樣本的微生物群落具有較高的豐富度、多樣性和宿主特異性。與馬尾藻樣本相比, 海水的游離微生物群落具有更高的多樣性和豐富度, 這與Lemay等[17]、James等[29]和Weigel等[30]報道相似。NMDS分析顯示馬尾藻樣本附生菌群結構與海水游離微生物存在明顯差別, 馬尾藻與海水樣本僅共有12ASVs, 占比僅為0.136%。藻際微生物與游離微生物群落結構差異可能是由于兩種環境介質之間的理化因子差異造成的, 海水的營養物質濃度相對比較低, 而藻類可以為附著微生物提供有機碳和營養物質, 海藻表面形態和分泌的化學物質又為微生物附著和定殖提供了微生境選擇性, 使海水中部分游離的稀有微生物定殖于藻體表面后成為豐富微生物[31]。

β多樣性分析結果表明同一生態位分布的4種馬尾藻附生菌群結構差異不顯著。研究表明, 海藻表面附生菌群結構容易受到地理格局、環境理化因子、宿主等因素的影響[16,32,33], 4種馬尾藻分布在同一生態位, 所處的海洋環境相同, 使其暴露在相同的微生物源群中。Lemay等[34]研究發現生活在同一海域的8種海帶附生菌群結構相似, 共享比例達到37%。Moeller等[35]發現共同區域棲居黑猩猩和大猩猩腸道菌群結構相似性比不同區域的高53%, 表明環境因素顯著改變了OTUs在最豐富微生物分支的分布。

4種馬尾藻微生物群落結構也存在差異, 可能是由于宿主形態和藻體含有的生物化學物質差異導致的。多項研究表明, 宿主的形態會影響其表面附生菌群的結構, 即使同一株海藻的不同生長部位微生物群落結構也會有差異, 藻體形態復雜性會增加微生物群落的豐富度[17,24,36]。通過形態結構比較發現, 鼠尾藻為細分枝, 葉絲狀、短小, 輪生; 海黍子和海蒿子初生分枝為粗分枝而次生分枝為細分枝; 銅藻的藻體呈樹狀, 為粗分枝[37]。鼠尾藻附生菌群多樣性和豐富度最高, 而銅藻最低, 與Lemay等[17]研究結果一致。此外, 馬尾藻含有的生物化學物質也可能影響其附生菌群結構[38]。4種馬尾藻富含褐藻膠、巖藻黃素、褐藻多酚等活性成分, 但是每種馬尾藻的營養組成存在較大差異, 所產生的多糖類物質具有多樣化和物種特異性[39—41], 而多糖類物質又是細胞壁的主要成分, 細胞壁多糖能夠吸引或排斥部分微生物定殖, 進一步影響微生物群落結構組成。

3.2 馬尾藻附生菌群潛在的生態功能

4種馬尾藻附生菌群結構組成在低分類階元(屬水平和ASV水平)呈現出明顯的宿主特異性, 相對豐度前10ASVs在不同馬尾藻樣本間的分布也進一步揭示了種群結構組成的差異性, 而這些優勢ASVs所隸屬的菌科(如紅桿菌科、黃桿菌科、硫發菌科、生絲單胞菌科、根瘤菌科、理研菌科、顆粒狀球菌科等)在海洋生態系統中發揮著重要作用。例如: 紅桿菌科普遍存在于大型海藻表面, 參與碳和硫的循環, 產生獨特的抗菌物質和次級代謝產物, 具有一定的解毒能力; 根瘤菌科某些種類不僅能夠參與氮循環, 而且還能降解海洋環境中某些難降解的化合物; 硫發菌科參與海洋硫元素循環;理研菌科參與碳水化合物代謝, 包括對纖維素、聚糖和寡糖的降解; 生絲單胞菌科能夠誘導和刺激海藻孢子形態變化和沉降, 還具有抗菌活性[42—45]。此外, 紅桿菌科和黃桿菌科的某些種類又是條件致病菌, 一旦環境惡化, 會導致海帶等經濟藻類病害發生[46]。

除了上述優勢菌科在海洋生態系統中發揮著重要作用外, 本研究還利用Tax4Fun功能預測軟件挖掘馬尾藻附生菌群潛在的生態功能, 結果表明4種馬尾藻附生菌群的功能趨于一致性。研究表明藻類相關的微生物菌株具有高度的生態等效性, 并且微生物群落結構組成可能是根據功能而不是根據藻類的系統發育關系驅動[38]。在一級功能水平上, 代謝為最主要的生物代謝通路, 其次是遺傳信息處理, 這與Ahmed等[32]報道一致。在二級功能水平上, 碳水化合物代謝在所有藻類樣本相對豐度最高, Li等[47]利用FAPROTAX軟件預測發現大型海藻附著基上微生物群落與碳代謝相關性最大, 我們前期研究結果也表明碳水化合物代謝為大型海藻附生菌群潛在的生態功能[45]。微生物通過碳代謝能夠維持環境中碳循環的穩定, 這也是藻類附著的基礎;隨著藻類的定殖和生長, 通過光合作用固碳, 成為初級碳生產者; 此外, 海藻表面形成的微生物膜通過吸收滲出的溶解碳和壞死組織的降解, 又將這些含碳化合物轉化為可被藻類重復利用的形式。

4 結論

本研究通過高通量測序技術比較了4種馬尾藻附生菌群的結構, 發現馬尾藻附生菌群結構與海水游離微生物群落差異明顯, 而4種馬尾藻樣本組間差異不顯著。馬尾藻附生菌群結構組成呈現出宿主特異性, 尤其是相對豐度較高的優勢類群。由于大型海藻附生菌群結構容易受到地理格局、海洋環境、海藻生活史不同階段和取樣部位等時間空間因素的影響, 本研究僅比較了同一生態位分布的4種馬尾藻附生菌群, 為了深入了解馬尾藻附生菌群結構特征, 在今后的研究中應綜合考慮上述因素。

大型海藻碳匯是目前研究的熱點, 通過挖掘海藻附生菌群的生態功能有助于深入了解海藻的生態習性, 為馬尾藻場修復提供理論依據, 助力藍碳事業研究工作。鑒于擴增子高通量測序功能預測的局限性, 宏基因組、宏轉錄組、蛋白質組學、代謝組學等多組學技術聯合運用, 以及分離鑒定培養碳循環相關微生物等方法相結合在今后可進一步應用于大型海藻附生菌群生態功能的研究。