芽孢表面展示系統及其在水產疫苗研發中的應用

昝子葉 柯 飛 趙威山 鄒 紅 王桂堂 吳山功

(1. 中國科學院水生生物研究所, 農業農村部淡水養殖病害防控重點實驗室, 水產品種創制與高效養殖重點實驗室(中國科學院), 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

近年來, 隨著養殖密度不斷提高, 加之種質退化、水環境污染加劇、病原微生物大量滋生, 養殖水產動物疾病頻繁發生, 給水產養殖業造成了巨大的經濟損失, 因此疾病防治受到越來越多的重視[1]?？股氐然瘜W藥物是疾病防治的常用藥物, 然而這些化學藥物的使用會產生耐藥性及藥物殘留問題[2]。疫苗可以預防傳染病暴發, 又不會導致細菌的耐藥性及藥物殘留, 因而成了未來魚病防治的重要發展方向[3]。但傳統注射和浸泡疫苗有諸多不便, 口服的方式更加方便快捷。不過, 動物的胃腸道環境制約了口服疫苗的研發及使用, 因此亟須尋找高效的抗原呈遞平臺。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是水產養殖中常用的益生菌, 不僅能改善養殖環境、減少疾病發生, 還能促進水產動物的生長發育[4,5]。芽孢桿菌也是異源蛋白表達的安全宿主(Generally Recognized As Safe), 已被開發為成熟的蛋白表達系統[6]。芽孢桿菌的芽孢對高溫、酸堿環境、裂解酶和多種化學物質等具有很強的抗逆性, 因此可利用芽孢的衣殼蛋白(如CotC、CotB和CotG等), 在芽孢的內生過程中, 將異源抗原穩定地展示在芽孢表面, 構建芽孢表面展示系統, 使其成為口服疫苗抗原遞送的理想平臺[7]?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是迄今為止研究最為清楚的芽孢桿菌, 目前枯草芽孢桿菌芽孢表面展示(Bacillus subtilisSpore Surface Display)已成功地用于藥物或抗原的呈遞[8]、工業酶類的展示[9]、環境污染物的監測與降解[10]、化學物質和重金屬物質的生物吸附[11,12]及生物傳感器的構建[13]等多個領域。

芽孢表面展示基因工程口服疫苗能夠克服傳統疫苗在胃腸道中易受到胃酸和消化酶作用而降解的弊端, 將抗原穩定呈遞到腸道, 發揮更加高效的免疫性能[14]。因而, 芽孢桿菌芽孢表面展示系統引起了科研人員的廣泛興趣。目前芽孢桿菌芽孢表面展示系統已被用于畜禽[15—17]及水產動物[18—20]疫苗開發, 本文介紹了水產動物疫苗研發中芽孢桿菌芽孢和感受態, 以及芽孢表面展示系統, 并特別介紹了芽孢作為口服疫苗載體在預防水產動物細菌病、病毒病和寄生蟲病方面的研究與應用現狀,以期為水產動物高效穩定口服疫苗的開發提供參考。

1 芽孢桿菌特殊形態結構

芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧、能產生抗逆性內生芽孢的革蘭氏陽性菌, 菌體呈桿狀, 有鞭毛。芽孢桿菌的形態結構對其生長繁殖以及適應特殊環境具有非常重要的作用。芽孢和感受態這兩種特殊形態結構是芽孢桿菌在長期的自然進化過程中形成的生存適應能力, 也是細胞高度有序的遺傳調控的結果[21]。在枯草芽孢桿菌生長發育后期, 當環境中出現密度增加、營養物質匱乏等生存壓力時, 芽孢桿菌會通過激活鞭毛運動、分泌抗生素和大量水解酶等方式減輕環境壓力, 但若未產生太大效果, 其中50%—70%的細胞將進入芽孢形成途徑, 而進入芽孢形成途徑中的少數細胞(≤20%)會進入感受態形成途徑[22—24]。

芽孢對極端溫度、壓力、酸堿環境、紫外線、輻射和多種化學物質等有很強的抗逆性[25—27],強抗逆性主要基于成熟芽孢的“新結構”, 這些結構被兩層膜分隔為3個同心小室, 呈現出同心殼層形式的多層結構; 由外向內包括芽孢外壁(Exosporium)、芽 孢 衣 殼(Spore coat)、外 膜(Outer membrane)、皮層(Cortex)、生殖細胞壁(Germ cell wall)、內膜(Inner membrane)及芽孢核心(Spore core), 其中核心中貯存遺傳物質DNA, 芽孢衣殼作為芽孢桿菌芽孢表面展示的重要結構, 主要由內層衣殼(Inner spore coat)和外層衣殼(Outer spore coat)構成[28—31](圖1)。

感受態是細胞的一種瞬時生理狀態, 此時, 細胞能從環境中攝取外源DNA分子[32]。通常在對數生長期后期, 枯草芽孢桿菌能形成自然感受態細胞[33],但群體中僅有10%的細胞可以分化形成感受態, 因此轉化效率一般比較低。芽孢桿菌感受態的形成首先受到群感效應(Quorum sensing)和情景選擇(Episodic Selection)的限制, 然后受到一種二元信號轉導系統的精密調控, 復雜的信號轉導系統保證了機體特異感受態信息素(ComX和CSF)被適當激活,進而刺激感受態形成[34—36]。

2 芽孢表面展示系統

首個芽孢表面展示系統由Isticato等[37]于2001年構建, 通過將破傷風毒素C片段(Tetanus Toxin Fragment C, TTFC)中459個氨基酸片段與枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotB融合, 轉化后在淀粉酶基因amyE處發生同源重組, 最終將TTFC抗原展示在芽孢表面, 開發了一種新型高效的抗原呈遞模式。芽孢表面展示系統具有很多獨特的優勢: (1)可展示分子量較大外源蛋白和多聚體外源蛋白[38]; (2)外源蛋白隨芽孢的內生而展示, 不需要跨越細胞膜[39,40];(3)有一套完整消耗ATP的分子伴侶體系, 幫助外源蛋白快速正確折疊, 使其保持原有空間構象和生物活性[28,41]; (4)芽孢抗逆性擴大了外源蛋白的應用范圍, 可抵抗高溫、強酸堿和輻射等不良環境長時間存活[42,43]。因此基因工程技術與芽孢表面展示系統相結合, 構建重組型芽孢表面展示系統的研究受到了科研人員越來越多的關注。

一個完整的芽孢表面展示系統主要由宿主菌、錨定蛋白和表達載體三個部分組成。此外, 連接肽能夠提高表面展示效率, 也常常被用于芽孢表面展示系統中。

2.1 宿主菌

目前芽孢表面展示常用宿主菌有蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)[44]、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)[45]和枯草芽孢桿菌[37]三種?？莶菅挎邨U菌是目前研究最多的代表菌種, 已在農業、工業等領域被廣泛使用[46—49]。蘇云金芽孢桿菌是農業上重要的生物防治菌株[50]。與另外兩種宿主菌相比, 枯草芽孢桿菌具有很多優勢: (1)研究最早且最深入, 基因組注釋信息清楚, 已建立完善遺傳操作體系; (2)芽孢結構研究較深入, 解析最全面[51,52];(3)不含毒素, 是公認安全且可直接食用的微生物,目前已作為益生菌在人類和其他動物中廣泛使用[53]。

枯草芽孢桿菌168菌株是最早被發現可在自然狀態下形成感受態, 并實現外源DNA轉化的芽孢桿菌菌株[54]?；谶@一發現, Anagnostopoulos與Spizizen[55]于1960年建立了168菌株感受態細胞的化學制備體系, 為枯草芽孢桿菌的分子遺傳操作奠定了基礎。1997年日本和歐洲的幾個實驗室聯合完成了Bacillus subtilis168菌株基因組的全基因組測序[56]。近年來, 研究人員對枯草芽孢桿菌遺傳轉化和表達系統進行了更加深入的研究, 越來越多枯草芽孢桿菌工程菌株, 如WB600、WB700和WB800等的出現, 為芽孢表面展示系統的研究與應用提供了更多的可能性。但目前芽孢表面展示系統宿主菌的選擇還是比較有限, 還應該挖掘更多適應不同環境的菌種(株), 如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是水產養殖中常用的益生菌, 以地衣芽孢桿菌作為宿主菌, 可能實現在展示特定外源蛋白的同時, 還能夠作為益生菌發揮益生功能。

2.2 錨定蛋白

芽孢表面展示所使用的錨定蛋白一般是芽孢衣殼蛋白, 在選擇衣殼蛋白時需要考慮其位置和豐度, 以實現較好的表面展示效率。已報道的可用作錨定蛋白的芽孢衣殼蛋白包括CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ和OxdD等, 其中CotB、CotC和CotG三種衣殼蛋白是目前研究最多且深入的, 它們位于芽孢外衣殼層, 其位置和豐度都保證了展示的外源蛋白與外界環境有高水平的接觸[57]。

CotB是首個應用于芽孢表面展示系統以展示外源蛋白的衣殼蛋白, 其與外源蛋白通過C端、N端和中間融合三種方式融合, 以不同的長度(包括全部氨基酸序列或N端部分氨基酸序列), 均可將有活性的外源蛋白成功展示在芽孢表面[37,58]。目前CotB已成功用于多種抗原和酶類的表面展示, 如炭疽芽孢桿菌的保護性抗原PA[59]、艱難梭菌(Clostridium difficile)的鞭毛帽蛋白FliD[60]和酯酶[61]等?；贑otC的芽孢表面展示均使用其全長氨基酸序列,C端和N端融合方式均可實現表面展示[62—64]。目前CotC已成功用于多種酶類的表面展示, 如尿素酶A亞基UreA[65]、乙醇脫氫酶[42]和β-半乳糖苷酶[66]等, 可顯著提升酶對惡劣環境的耐受能力?；贑otG的表面展示均以CotG的完整氨基酸序列作為錨定蛋白, 大部分以C端融合的方式進行。Kim等[38]通過CotG將四聚體外源蛋白鏈霉親和素成功展示到芽孢表面。目前CotG已涉及單體、二聚體和四聚體等外源蛋白表面展示, 如N-乙基神經氨酸醛縮酶[67]、ω-轉氨酶[68]、腈水解酶[69]等。

此外, 其他錨定蛋白如CotX、CotY、CotZ和OxdD, 已成為后起之秀。以綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)作為報告基因, CotX作為錨定蛋白, 李倩等[70]觀察到重組芽孢表面發出綠色熒光,證明CotX可作為錨定蛋白進行表面展示。類似地,將增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green fluorescent protein, EGFP)與錨定蛋白CotY通過C端融合的方式, 可以成功將其展示在芽孢表面[71]。而CotZ是位于更接近芽孢表面的外衣殼蛋白, 利于外源蛋白充分展示在芽孢表面, Negri等[61]以CotZ為錨定蛋白, 成功在芽孢表面展示鞭毛蛋白FliD。值得關注的是, OxdD是目前報道的唯一可作為錨定蛋白的芽孢內衣殼蛋白, 植酸酶與OxdD通過C端融合的方式, 成功地將植酸酶展示在芽孢表面并具有相應的酶活性[72]。

越來越多的可用于芽孢表面展示的衣殼蛋白的發現, 為提高表面展示效率提供了新的思路, 利用多種衣殼蛋白同時展示同一種外源蛋白或不同種外源蛋白, 增加表面展示的外源蛋白數量和種類,是值得進一步探索的方向, 將為芽孢表面展示系統研究與應用提供更多的可能性。

2.3 表達載體

芽孢表面展示系統的構建可以通過基因重組(圖2)和非基因重組兩種方法進行[73]。

圖2 基因重組法構建芽孢表面展示系統示意圖Fig. 2 Schematic representation of spore surface display system constructed by genetic recombination strategy

通過基因重組方法構建時使用的質粒有兩種,整合型和游離型[74]。整合型質粒轉化進入感受態細胞后, 與枯草芽孢桿菌基因組發生重組, 目的基因整合到基因組中, 后在特定啟動子作用下開始表達[75]。整合策略有單交換和雙交換兩種, 其中雙交換是目前研究中使用最多的。構建雙交換整合型載體時, 選擇的同源臂多為破壞后不影響芽孢桿菌正常生長的基因, 如lacA、scaA、gltA、trpC、amyE和pyrD等[8,76,77,78]; 同源臂的長度至少為400—500 bp,才能發生有效重組[79]。淀粉酶基因amyE是使用最多的同源臂基因, 整合后因外源基因的插入使amyE被破壞, 宿主菌失去分解淀粉的能力。游離型質粒攜帶目的基因轉化進入枯草芽孢桿菌感受態細胞后可進行獨立復制與表達[74]。使用游離型載體構建表面展示系統操作簡單, 轉化率相對較高, 但質粒遺傳不穩定, 容易隨著宿主菌的分裂增殖而丟失,給后續實驗帶來一定的風險[80]。因此, 尋找遺傳穩定不易丟失的穿梭型質粒是未來探究的方向。非基因重組方法是將純化的外源蛋白與芽孢共同培養, 由于兩者之間存在靜電和疏水作用可相互結合,最后吸附于芽孢表面, 或使用交聯劑將它們固定在孢子表面, 最終發揮作用[81,82]。

總之, 無論是基因重組方法, 還是非基因重組的方法, 都可以將外源目的蛋白展示在芽孢表面, 進而發揮作用。表面展示效率是系統構建的關鍵, 容易在體外得到大量純化的外源蛋白, 可先通過基因重組方法將其展示到芽孢表面, 再利用非基因重組方法, 將外源蛋白吸附于芽孢表面, 兩種方法結合將更多的外源蛋白展示于芽孢表面, 提高表面展示效率。

2.4 連接肽

在錨定蛋白和外源蛋白之間插入合適的連接肽, 可使錨定蛋白和外源蛋白之間形成空間位阻,利于兩者正確進行空間折疊, 保證表面展示外源蛋白的活性[83]。GGGGS和EAAAK是目前常用的兩種連接肽[84,85]。連接肽(GGGGS)n(n≤6), 由于甘氨酸含量高, 使其柔軟易彎曲, 因此也被稱為柔性連接肽[84]。但柔性連接肽存在一些弊端, 過于柔軟導致融合蛋白整體易對折靠攏形成二聚體, 導致外源蛋白活性下降。隨后研究人員在兩種綠色熒光蛋白之間引入了能形成α-螺旋結構的(EAAAK)n(n=2—5)序列, 該序列可有效控制兩種蛋白間的距離, 減少功能域之間的干擾, 也被稱為剛性連接肽[85]。其后, Huang等[86]將柔性連接肽GGGGS (F)和剛性連接肽EAAAK (R)結合形成RRRRR、FFFFF及FFFRR三種連接肽, 進一步構建酸性磷酸酶-綠色熒光蛋白融合蛋白PhoC-GFP, 比較分析發現連接肽的靈活性可以有效調節PhoC-GFP的活性, 在使用FFFRR連接肽時, PhoC-GFP的酶活性最高。綜上所述, 適當地利用連接肽可一定程度上提升外源蛋白展示的穩定性和高效性, 在構建芽孢表面展示系統時加入連接肽是非常有必要的。

3 芽孢表面展示系統在水產養殖中的應用

從動物福利、經濟成本和方便程度等角度考慮, 口服接種是水產動物較理想的免疫接種方式[87]?？诜庖咧饕峭ㄟ^刺激魚體腸道黏膜系統來產生免疫應答反應, 但口服后抗原會受到高濃度胃酸和腸道蛋白酶的作用而被破壞, 免疫原性降低, 保護效果不佳, 這是阻礙水產動物口服疫苗發展的主要原因[88,89]。研究表明, 芽孢桿菌芽孢可以作為免疫佐劑, 還可作為疫苗的呈遞載體[90]。在具有適應性免疫系統的脊椎動物中, 芽孢能被腸道中特異性上皮細胞微褶細胞攝取, 與Peyer氏斑中的淋巴細胞和抗原提呈細胞發生相互作用, 刺激機體產生免疫應答; 在不具有適應性免疫系統的無脊椎動物中, 芽孢能夠刺激細胞吞噬作用和非特異性免疫保護[91—93]。芽孢具有強抗逆性, 因此芽孢表面展示系統可作為口服疫苗抗原遞送的理想平臺, 目前芽孢表面展示系統已經在預防水產動物細菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病方面有相關報道(表1)。

表1 芽孢表面展示系統在水產疫苗研發中的研究進展Tab. 1 Research progress of spore surface display systems in aquatic vaccine development

3.1 細菌病疫苗

羅非魚鏈球菌病是嚴重威脅羅非魚(Oreochromis mossambicus)養殖產業健康發展的一類疾病, 發病率和死亡率高, 造成嚴重的經濟損失[94]。致病的病原菌有無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae), 其中無乳鏈球菌是主要病原, 屬于鏈球菌科(Streptococcace),鏈球菌屬(Streptococcus), 而Sip蛋白是位于大部分無乳鏈球菌表面的一種蛋白, 具有高度保守性[95]。Yao等[96]利用衣殼蛋白CotC在芽孢表面展示Sip蛋白, 用重組芽孢GC5-Sip口服灌胃免疫羅非魚, 發現GC5-Sip組血清中存在Sip特異性抗體, 脾臟和腸道中免疫相關基因TNF-α、TGF-β、MHC-I和T-bet的表達水平顯著提高。攻毒試驗后GC5-Sip對無乳鏈球菌感染的相對保護率(Relative Percentage Survival,RPS)達到41.7%, 表明重組芽孢GC5-Sip可誘導魚體的細胞免疫和體液免疫反應, 在一定程度上保護羅非魚免受無乳鏈球菌感染。

弧菌病是水產養殖中最嚴重的細菌性疾病之一, 能感染各種淡水和海水魚類、蝦類和雙殼類動物, 引起出血性敗血癥, 死亡率高, 制約水產養殖業可持續發展[97]?；【鷮?Vibriospp.)細菌, 如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)等均可引起弧菌病[98]。外膜蛋白OmpK是致病性弧菌的共同抗原, Gon?alves等[19]利用衣殼蛋白CotY在芽孢表面成功展示OmpK蛋白, 以重組芽孢CotY-OmpK浸泡免疫斑馬魚(Danio rerio)幼魚,V.parahaemolyticus或V.anguillarum感染斑馬魚后, 幼魚存活率分別提高了40%和85%; 繼而口服免疫歐洲齒舌鱸(Dicentrarchus labrax)幼魚,V.anguillarum感染鱸后, 結果CotY-OmpK組幼魚存活率從60%提高至87%, 表明芽孢可以作為弧菌病口服疫苗載體, 提高魚類感染致病弧菌后的存活率。

目前雖然可以使用滅活疫苗或者減毒活疫苗預防細菌性疾病, 但這些疫苗主要通過注射方式來進行接種, 使用極不方便。如果利用非基因重組的方式, 將滅活疫苗吸附于芽孢表面, 芽孢作為免疫佐劑, 將滅活疫苗呈遞到水生動物腸道, 進而發揮更加高效、安全、快捷的免疫保護效果, 將能夠大大降低水生動物細菌性疾病的發病率。

3.2 病毒病疫苗

草魚出血病 草魚出血病是危害我國草魚(Ctenopharyngodon idella)養殖行業最嚴重的一種病毒性疾病, 患病草魚死亡率高達70%—80%, 幾乎每年都會造成巨大的經濟損失[99]。該病病原是草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV), 隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae), 水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus), 不僅能感染草魚, 而且還能感染其他經濟魚類; 病毒的11個基因片段共編碼13個蛋白, 包括7個結構蛋白(VP4、VP7和VP56等)和6個非結構蛋白(NS31、NS38和NS80等)[100]。

任鵬麗[101]構建重組芽孢CotC-VP4并口服免疫草魚, 以注射珠江水產研究所商品化減毒活疫苗為陽性對照組, 基礎飼料為陰性對照組。研究發現,與陰性對照相比, CotC-VP4組血清中特異性IgM抗體水平和腎臟中免疫相關細胞因子IgM和TLR22表達水平顯著升高, 表明CotC-VP4可使魚體產生一定的抗病毒免疫效應, 在病毒入侵時提供保護作用,但免疫保護效果不及陽性對照組顯著。Jiang等[102]也構建了重組芽孢CotC-VP4口服疫苗并免疫草魚,以注射商品GCRV減毒疫苗為陽性對照, 基礎飼料為陰性對照。結果發現與陰性對照相比, CotC-VP4可誘導腸黏液中特異性IgZ抗體水平升高, 多個免疫相關基因的表達水平顯著上調; 在GCRV攻毒后,CotC-VP4組草魚存活率為57%, RPS 47%, 表明該重組芽孢可觸發魚體免疫反應, 提高草魚抗GCRV感染的能力, 但整體保護效果低于陽性對照組(存活率達89%)。

Chen等[103]利用魚源枯草芽孢桿菌GC5菌株,構建重組芽孢CotC-VP4和CotC-NS38, 經口灌服免疫草魚后, 發現均提高了草魚抗GCRV感染的能力。進一步研究發現, CotC-VP4主要通過誘導IgT轉錄水平上調, 引發魚體特異性抗體反應; 而CotCNS38通過誘導炎癥反應和主要組織相容性復合物(MHC)的表達, 最終保護草魚免受GCRV感染。Sun等[104]分別以淀粉酶基因amyE和芽孢萌發必需基因cwlJ為整合位點, 構建重組芽孢ΔamyECotB-VP7和ΔcwlJCotB-VP7。在口服免疫草魚后, 各實驗組均可誘導血清中特異性IgM抗體水平、腎臟中免疫相關基因IL-1β、TNF-α、MHCII和CD4L的表達水平上調, 在感染GCRV后, ΔamyECotB-VP7和ΔcwlJCotB-VP7的RPS分別達到28.09%和50.66%。但ΔcwlJCotB-VP7可引發草魚更高的免疫反應水平,可能是因為其一直處于芽孢狀態, 可持續呈遞抗原[104]。而Gao等[105]將編碼VP56蛋白的基因分成4個片段,篩選得到最佳抗原VP56-2, 繼而構建重組芽孢CotC-VP56-2并口服免疫草魚。結果顯示, CotCVP56-2誘導了脾臟和頭腎中更高的特異性IgM抗體水平, 以及免疫相關細胞因子IL-1β、TNF-α、IFN1和MHC-Ⅱ的轉錄表達, 在感染GCRV后, 腎臟和脾臟組織中病變范圍明顯縮小, 病毒載量降低, 有效保護草魚抗GCRV感染。

大口黑鱸蛙虹彩病毒病大口黑鱸蛙虹彩病毒病會在短時間內造成大口黑鱸(Micropterus salmoides)暴發疾病并大規模死亡, 導致大口黑鱸養殖產業遭受重大經濟損失[106]。該病由大口黑鱸蛙虹彩病毒(Largemouth bass virus, LMBV)引起, LMBV屬于虹彩病毒科(Iridoviridae), 蛙病毒屬(Ranavirus),其MCP蛋白對于病毒顆粒的組裝和誘導免疫反應至關重要[107]。Wang等[20]利用衣殼蛋白CotC表面展示MCP, 構建重組芽孢CotC-LMBV, 口服免疫大口黑鱸后發現, CotC-LMBV組鱸血清中特異性IgM抗體水平顯著升高, 脾臟中免疫相關基因CD4-1、IgM、IL-6和IFN-γ表達水平顯著上調; 攻毒試驗表明, CotC-LMBV組鱸的存活率提高, RPS達45.0%,表明鱸的先天性和適應性免疫被激活, 以提供免疫保護作用。

魚類病毒性神經壞死癥魚類病毒性神經壞死癥, 作為世界動物衛生組織(Office International Des épizooties)必報的傳染病之一, 危害多種海水和淡水魚類, 感染后幼魚的死亡率高達80%—100%[108]。該病的病原為神經壞死病毒(Nervous Necrosis Virus, NNV)[109], 其主要衣殼蛋白MCP是保守的, 在病毒侵襲和復制中發揮重要作用[110]。Mai等[111]構建重組芽孢CotC-MCP, 口服免疫石斑魚(Epinephelusssp.)幼魚, 發現CotC-MCP組腎臟中免疫相關基因TNF-α、IL-1β、MHCI、IgD和IgM的轉錄水平均顯著提高, 在感染試驗后, CotC-MCP組幼魚相對存活率達88.89%, 對照組成活率為0, 說明展示的MCP發揮了很好的免疫保護效果。

對蝦白斑綜合征對蝦白斑綜合征是嚴重危害對蝦(Penaeus)養殖業健康發展的病毒性疾病之一, 會引起對蝦暴發性死亡, 該病病原為白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV), 屬線頭病毒科(Nimaviridae), 白斑病毒屬(Whispovirus)[112]。VP26和VP28蛋白是WSSV兩種最主要的囊膜蛋白,約占囊膜蛋白的60%[113]。

Ning等[114]構建重組芽孢CotB-VP28和CotCVP28, 口服免疫克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)后, 進行感染試驗, 發現重組芽孢組克氏原螯蝦的存活率均提高, RPS分別為37.9%和44.8%。這是首次在水生無脊椎動物中使用芽孢表面展示系統, 所展示的抗原都有免疫保護效果, 但免疫保護效果的高低與錨定蛋白的選擇相關。而后Nguyen等[115]構建重組芽孢CotB-VP28, 口服免疫南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)后, 發現CotB-VP28組超氧化物歧化酶和酚氧化酶活性均有增加的趨勢, 表明對蝦的先天免疫反應在一定程度上被激發。Pham等[116]也構建重組芽孢CotB-VP28, 口服免疫斑節對蝦(Penaeus monodon), 發現CotB-VP28誘導血液中產生更多的總血細胞、透明細胞和顆粒細胞, 以及血清中更高的酚氧化酶活性(1.26倍); 在病毒感染后,CotB-VP28組對蝦存活率達75%, 表現出更強的免疫保護效果。此外, Valdez等[93]構建了重組芽孢CotC-VP26和CotC-VP28, 口服免疫南美白對蝦, 感染試驗發現CotC-VP26和CotC-VP28芽孢可保護100%和90%的幼蝦免受WSSV感染, 顯示VP26具有更強的免疫保護效果。

以上研究表明, 利用芽孢表面展示系統展示病毒抗原片段, 對于病毒的感染具有一定的保護效果,但保護效果低于直接注射減毒疫苗, 可能是由于目前的研究展示的病毒抗原較單一。此外, 胃腸道環境對疫苗的破壞、接種的疫苗難以突破黏膜屏障、抗原呈遞細胞對芽孢表面展示抗原的識別效率低, 這些因素都會影響到疫苗的免疫保護效果。每一個病毒顆粒都有很多的不同抗原片段, 若將多個抗原蛋白通過多個錨定蛋白同時進行表面展示,并使用連接肽以減少不同抗原蛋白相互之間的干擾, 將可能提高表面展示效率, 刺激機體產生更強的免疫反應。

3.3 寄生蟲病疫苗

華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)是重要的魚源性人畜共染寄生蟲, 能夠引起華支睪吸蟲病, 嚴重危害人類和動物的健康[117,118]。華支睪吸蟲的生活史包括成蟲、蟲卵、毛蚴、胞蚴、雷蚴、尾蚴、囊蚴及后尾蚴等階段, 其中當尾蚴遇到合適的第二中間宿主(一些淡水魚或蝦)時, 可寄生其體內并形成囊蚴[119]。

華支睪吸蟲的半胱氨酸蛋白酶(CsCP)與其孵化、營養獲取、免疫逃避等密切相關[120], Tang等[121]構建重組芽孢CotC-CP, 口服免疫草魚, 發現CotCCP組血清、膽汁、腸黏液和體表黏液中特異性IgM抗體水平顯著提高, 低密度尾蚴(50尾/每尾魚)感染試驗發現CotC-CP芽孢可提供100%的保護率, 表明重組CotC-CP芽孢可預防囊蚴的形成和感染。烯醇化酶(CsENO)是華支睪吸蟲行寄生生活時, 宿主與病原體相互作用的表面受體[122]。Jiang等[123]構建重組芽孢CotC-CsENO, 口服免疫草魚, 發現CotCCsENO誘導血清、腸黏液和體表黏液中特異性IgM抗體水平提高, 脾臟、頭腎和后腸中多個免疫相關基因轉錄水平顯著上調, 表明CotC-CsENO芽孢可誘導體液免疫、細胞免疫及全身和局部的黏膜免疫, 為草魚提供免疫保護。華支睪吸蟲副肌球蛋白(CsPmy)是蠕蟲類寄生蟲的一種參與肌肉生理收縮和免疫調節的多功能分子[124], 也是囊蚴階段囊壁的重要組成部分[125], Sun等[18]構建重組芽孢CotC-CsPmy, 在口服免疫草魚后, 發現CotC-CsPmy可誘導血清、膽汁、腸黏液和體表黏液中特異性IgM抗體水平顯著上調, 以及脾臟和頭腎中IgM、IgZ、IL-8和TNF-α的mRNA水平顯著提高, 感染試驗發現, 每克魚肉中囊蚴數量明顯減少, 表明CotC-CsPmy重組芽孢可預防尾蚴粘附或入侵草魚, 進而影響囊蚴的形成。

目前芽孢表面展示系統在寄生蟲病方面的研究還局限在華支睪吸蟲一種寄生蟲上, 對水產養殖動物危害嚴重的寄生蟲如小瓜蟲、三代蟲等, 尚未涉及。將重要寄生蟲病原的抗原蛋白展示到芽孢表面, 用于預防魚類寄生蟲的感染, 將能夠降低寄生蟲病的發病率。

4 展望

盡管芽孢表面展示系統在水產養殖方面的應用還不是很多, 但目前在重要的細菌[96]、病毒[104]和寄生蟲[18]病原中的研究已表明其作為口服疫苗抗原遞送平臺的優勢及可行性。我國水產養殖動物品種眾多, 重要病原也很多, 如嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鱖傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus)、桃拉綜合征病毒(Taura syndrome virus)、小瓜蟲(Ichthyophthirius)和三代蟲(Gyrodactylus)等[126—128]。未來可針對重要病原, 利用芽孢表面展示系統開發更多的水產動物口服疫苗, 提供一種新型高效的病害防控手段。另外, 提高抗原呈遞效率和免疫保護效果也是未來的研究方向之一。影響抗原的呈遞效率的因素很多, 包括錨定蛋白的定位和特性、展示的抗原蛋白的性質、連接方式、表達載體的類型及連接肽的種類等[129], 都可以進行優化以提高抗原呈遞效率。也可以利用多個不同的錨定蛋白, 在芽孢衣殼表面展示多種不同的抗原, 制備多價重組抗原疫苗?？梢酝ㄟ^優化免疫時間、免疫次數和免疫接種量[130], 以及優化抗原片段(尋找高特異性和高敏感性的抗原)等方法提高免疫保護。目前所使用的宿主菌多數為工程菌株, 雖然遺傳操作容易,但水生動物消化道環境未必適合其定植, 會影響免疫保護效果, 因此發掘更多水產動物來源的益生芽孢桿菌[87], 構建重組芽孢, 表面展示重要病原的抗原片段, 不但能提供免疫保護, 還可以發揮益生菌的作用。有效的口服疫苗除了在遞送部位提供黏膜局部免疫, 還應該誘導全身系統免疫。深入研究表面展示口服疫苗進入水產養殖動物消化道后發揮作用的機制, 開發高效安全的口服疫苗對預防魚病的發生, 減少化學藥物的使用, 促進我國水產養殖行業的綠色健康發展非常必要。