燈盞細辛注射液通過調節JAK2/STAT3信號通路抗腦卒中大鼠神經損傷的研究*

趙倩，曾利敏，周麗平，齊林

（1.鄭州市第七人民醫院神經內科，鄭州 450016；2.鄭州市第七人民醫院檢驗科，鄭州 450016）

腦卒中又稱中風、腦血管意外，是一種急性、突發性腦血管疾病。它是由腦血管阻塞或破裂引起的，導致血瘀，阻止血液進入大腦，并引發與腦組織缺氧損傷相關的疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1]。缺血性腦卒中主要以腦缺血和神經功能缺損為特征，占卒中總發病率的80%以上[2]。目前的臨床治療集中在靜脈溶栓和血管內取栓的快速再灌注，盡管血管再通率不斷增加，但仍有近一半的患者在缺血后殘疾[3]。Janus 激酶2（JAK2）是蛋白酪氨酸激酶家族的成員，可通過多種細胞因子受體傳遞信號，其被激活時磷酸化信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3），進而參與細胞因子的產生、免疫細胞的募集和激活以及適應性反應的啟動等活動[4]。研究顯示，抑制JAK2/STAT3 通路能夠抑制NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥體激活，從而改善缺血性腦卒中損傷和神經炎癥[5]。燈盞細辛注射液（EBI）是由燈盞花素干燥制成的含黃酮類和咖啡酸類化合物的中藥注射劑，具有祛風散寒、活血止痛的功效，主要用于治療心臟和肝臟疾病[6]。研究顯示，EBI 也能夠降低腦缺血再灌注模型大鼠的腦梗死率，也可以通過維持神經元線粒體形態的穩定性在缺血性卒中中發揮神經保護作用，具有起效快、時效長等特點[7-8]。但其對缺血性腦卒中的神經保護作用機制研究甚少。因此，本研究旨在探索EBI 對缺血性腦卒中大鼠神經保護作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠，8 周齡，體質量250～280 g，將大鼠放置在透明的籠子中，在12 h光/12 h 暗交替循環，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%下飼養，所有大鼠均可自由獲取食物和水。本研究獲得動物倫理委員會批準（批準號2022-039）。

1.2 主要試劑及儀器 燈盞細辛注射液（規格：10 mL，云南生物谷藥業股份有限公司，國藥準字Z53021569）；尼莫地平注射液（規格：0.2 mg/mL，上海旭東海普藥業有限公司，國藥準字H20084238）；AG490 、Coumermycin A1（CA1 ，美國Med Chem Express，貨號：HY-12000、HY-N7452）；2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G3005）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、尼氏（Nissl）染色液（貨號：C0105S、C0117，上海碧云天生物技術有限公司）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：40308ES20，上海翌圣生物科技股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）ELISA 檢測試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司，貨號：YK-08006、YK-09134）；丙二醛（MDA）ELISA 檢測試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJ-R0007）；Bax、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 兔單抗及B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、GAPDH兔多抗（英國abcam 公司，貨號：ab32503、ab108596、ab32101、ab68153、ab32143、ab196495、ab9485）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔（和元李記生物技術有限公司，貨號AP31L014）；DXS-3 倒置生物顯微鏡（上海帝倫光學儀器有限公司）；XKDG001 倒置熒光顯微鏡（深圳市西尼科光學儀器有限公司）；Multiskan FC 酶標儀（賽默飛世爾科技）；ChemiDoc MP 凝膠成像系統（伯樂生命醫學有限公司）。

1.3 大鼠腦卒中模型制備 將大鼠適應性飼喂1 周后，均腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，并固定在立體定位架上，然后將大鼠隨機分為假手術組（n=20）和實驗組（n=105），實驗組大鼠利用大腦中動脈閉塞（MCAO）建立大鼠模型[9]：仔細分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ICA）和頸內動脈（ECA），在CCA/ECA 的分叉處用5-0 線進行結扎，在距CCA/ECA 分叉約0.5 cm 處的CCA 上開1 個小切口，將尼龍單絲從CCA 插入，經過ICA 到達大腦中動脈，在動脈夾處結扎CCA 以防出血。2 h 后，抽出尼龍單絲恢復血流。假手術組大鼠只暴露頸動脈，不進行結扎。手術期間使用加熱毯使大鼠保持恒溫，手術24 h 后對大鼠進行神經功能缺損評分，評分在1～3 分之間則視為造模成功。

1.4 分組及給藥 將造模成功后的大鼠隨機分為模型組、尼莫地平組、EBI 組、JAK2 抑制劑組（AG490 組）、EBI+JAK2 激動劑組（EBI+CA1 組），每組20 只。尼莫地平組大鼠按0.5 mg/kg 的劑量腹腔注射陽性藥物尼莫地平注射液[7]，EBI 組大鼠按5 mL/kg 的劑量腹腔注射EBI[7]，JAK2 抑制劑組大鼠腹腔注射6 μL、20 nmol/mL 的JAK2 抑制劑AG490[10]，EBI+JAK2 激動劑組大鼠在腹腔注射5 mL/kg 的EBI 30 min 后再注射100 μg/kg 的JAK2 激動劑CA1[11]，假手術組和模型組均以相同方式注射等體積的生理鹽水。24 h 后對各組大鼠再次進行神經功能缺損評分及后續實驗。

1.5 神經功能缺損評分 使用Zea-Longa 方法對各組大鼠進行神經功能評估。評分標準為0 分：表示沒有可見的神經缺損；1 分：左前爪未能完全伸展，表示輕度神經功能障礙；2 分：牽拉尾巴時單向轉圈，表示中度神經功能障礙；3 分：容易向缺血側傾倒，表示嚴重神經功能障礙；4 分：意識減退，無法自主行走。

1.6 TTC 染色檢測大鼠腦梗死面積 神經評分結束后，每組選取5 只大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后斷頸處死，取出完整的腦組織用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗，取部分腦組織（n=5）固定于4%多聚甲醛中，剩余組織全部置于-80 ℃冰箱中保存。10 min 后取部分（n=5）冷凍的腦組織，切成2 mm 的冠狀切片。將腦切片放入2% TTC 溶液中，在37 ℃下孵育20 min，隨后棄去TTC 溶液，用4%多聚甲醛固定切片24 h，然后進行拍照，并使用Image J 軟件分析梗死面積。

1.7 HE 和Nissl 染色檢測大鼠腦組織的病理性形態 將1.6 中固定過夜的腦組織進行石蠟包埋并切成5 μm 厚的薄片。隨后將石蠟切片分別用二甲苯和梯度乙醇常規脫蠟水化，蒸餾水洗滌后，將切片置于HE 染色液或Nissl 染色液中染色，30 min 后將腦切片用蒸餾水洗滌后，再用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹脂封片。使用倒置生物顯微鏡觀察缺血側神經元損傷情況，并利用Image J 軟件分析神經元數量，每張切片選取5 個區域計算均值。

1.8 TUNEL 染色檢測大鼠腦組織中神經細胞凋亡情況 取1.7 中石蠟切片，在二甲苯中脫蠟，在梯度乙醇中水化，然后用蒸餾水清洗后吸干水分。在樣本切片上滴加100 μL 蛋白酶K 工作液，室溫孵育20 min，再加入100 μL 平衡液孵育10 min。用蒸餾水洗滌后在切片上加入預先配制好的TUNEL 反應混合液，37 ℃避光孵育1 h，清洗后加入DAPI 進行核染5 min，清洗后用抗熒光猝滅的封片劑進行封片。用熒光顯微鏡觀察染色情況并利用Image J 軟件計算凋亡率。凋亡率（%）=TUNEL 陽性細胞（紅色熒光）/總細胞（藍色熒光）。

1.9 ELISA 檢測大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 的水平 取1.6 中凍存的腦組織（n=5）置于冰上溶解，洗滌后吸干水分進行稱質量，然后加入預冷的PBS 研磨成勻漿，在4 ℃下，3 000 r 離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清液。根據ELISA 試劑盒的操作步驟檢測待測上清液中SOD、GSH-Px 和MDA 的水平。

1.10 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達 將剩余的腦組織（n=5）置于冰上溶解，并使用RIPA 裂解緩沖液勻漿，在4 ℃下以10 000 r的速度離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清液即為提取的蛋白質。用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，然后在每個泳道加入40 μg 蛋白質用SDS-PAGE凝膠分離，并轉移至PVDF 膜。隨后將膜置于含有5%脫脂奶粉的TBST 中封閉2 h，TBST 洗滌后與一抗（Bax、Bcl-2、STAT3、p-STAT3 比例1∶1 000，JAK2、p-JAK2 比例1∶5 000，GAPDH 比例1∶2 500） 在4 ℃下孵育過夜，將膜再次用TBST 洗滌后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶500）在室溫下孵育1 h，最后用ECL 試劑盒顯色。以GAPDH 為內參蛋白，在凝膠成像系統中觀察蛋白條帶，并利用Image J軟件量化蛋白表達。

1.11 統計學方法 采用Graphpad prism8.0 軟件進行數據統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示。多組之間比較使用單因素方差分析，組間多重比較使用Tukey 事后檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EBI 對各組大鼠神經功能缺損的影響 與假手術組相比，模型組大鼠的神經功能缺損評分升高（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠的神經功能缺損評分降低（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統計學意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠的神經功能缺損評分升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分的比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 神經功能缺損評分（分）假手術組 20 0.00±0.00模型組 20 2.57±0.16*EBI 組 20 0.54±0.04#尼莫地平組 20 0.60±0.05#AG490 組 20 0.58±0.04#EBI+CA1 組 20 2.11±0.13△

2.2 EBI 對各組大鼠腦梗死面積的影響 與假手術組相比，模型組大鼠的腦梗死面積增大（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠的腦梗死面積減?。≒＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統計學意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠的腦梗死面積增大（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 TTC 染色檢測各組大鼠腦梗死面積Fig.1 Cerebral infarction area detected by TTC staining of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死面積的比較（±s）Tab.2 Comparison of cerebral infarction area of rats in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 梗死面積（%）假手術組 5 0模型組 5 38.65±2.54*EBI 組 5 16.37±1.31#尼莫地平組 5 18.46±1.52#AG490 組 5 17.93±1.45#EBI+CA1 組 5 32.58±2.16△

2.3 EBI 對各組大鼠腦組織中神經元損傷的影響 假手術組大鼠神經元排列規則，染色均勻；與假手術組相比，模型組大鼠神經元退化，細胞排列不規則且間隙增大，細胞核縮小，神經元數量減少（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠神經元損傷減輕，細胞排列規則，細胞核形態恢復，神經元數量增加（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統計學意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠神經元形態與模型組無顯著差異，神經元數量減少（P＜0.05）。見表3 和圖2、圖3。

圖2 HE 染色檢測各組大鼠腦組織的病理學形態（×200）Fig.2 HE staining was used to detect the pathological morphology of brain tissue of rats in each group(×200)

表3 各組大鼠神經元數量的比較（±s）Tab.3 Comparison of the number of neurons in rats in each group（±s）

表3 各組大鼠神經元數量的比較（±s）Tab.3 Comparison of the number of neurons in rats in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 神經元數量（個）假手術組 5 98.63±8.24模型組 5 53.47±4.83*EBI 組 5 84.32±7.65#尼莫地平組 5 81.43±7.26#AG490 組 5 83.64±6.90#EBI+CA1 組 5 59.31±5.10△

2.4 EBI 對各組大鼠腦組織中細胞凋亡的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中神經細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠腦組織中神經細胞凋亡率降低（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統計學意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠腦組織中神經細胞凋亡率升高（P＜0.05），見表4 和圖4。

圖4 TUNEL 染色檢測各組大鼠神經細胞凋亡情況（×200）Fig.4 Detection of neuronal apoptosis in rats of each group by TUNEL staining(×200)

表4 各組大鼠神經細胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis rate in rats of each group（±s）

表4 各組大鼠神經細胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis rate in rats of each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 細胞凋亡率（%）假手術組 5 2.53±0.18模型組 5 42.17±2.37*EBI 組 5 12.98±1.14#尼莫地平組 5 15.72±1.23#AG490 組 5 14.39±1.20#EBI+CA1 組 5 37.60±1.87△

2.5 EBI 對各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490組大鼠腦組織中MDA 水平降低，SOD、GSH-Px 水平升高（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490組的差異均無統計學意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠腦組織中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 水平的比較（±s）Tab.5 Comparison of SOD，GSH-Px and MDA levels in brain tissue of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 水平的比較（±s）Tab.5 Comparison of SOD，GSH-Px and MDA levels in brain tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

MDA（mmol/mg）假手術組 5 134.68±9.37 58.34±4.86 1.23±0.08模型組 5 72.35±5.18* 26.63±2.17* 4.87±0.32*EBI 組 5 116.62±8.91# 49.71±4.62# 2.55±0.16#尼莫地平組 5 112.97±8.24# 48.98±4.51# 2.63±0.17#AG490 組 5 114.39±7.69# 49.12±3.82# 2.70±0.16#EBI+CA1 組 5 75.84±6.23△ 30.23±3.10△ 4.59±0.28△組別 動物數 SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）

2.6 EBI 對各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中Bax 表達及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 升高，Bcl-2 表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠腦組織中Bax 表達及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 降低，Bcl-2 表達升高（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統計學意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠腦組織中Bax 表達及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3升高，Bcl-2 表達降低（P＜0.05）。見圖5 和表6。

圖5 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達Fig.5 Expression of Bax，Bcl-2，JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 in brain tissue of rats in each group

表6 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 蛋白及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達的比較（±s）Tab.6 Comparison of Bax，Bcl-2 protein and p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 expression in brain tissue of rats in each group（±s）

表6 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 蛋白及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達的比較（±s）Tab.6 Comparison of Bax，Bcl-2 protein and p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 expression in brain tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

p-STAT3/STAT3假手術組 5 0.96±0.07 0.99±0.08 0.21±0.01 0.17±0.01模型組 5 2.15±0.16* 0.28±0.01* 0.94±0.07* 0.89±0.06*EBI 組 5 1.24±0.09# 0.87±0.06# 0.32±0.02# 0.26±0.01#尼莫地平組 5 1.29±0.10# 0.83±0.05# 0.34±0.02# 0.30±0.02#AG490 組 5 1.26±0.10# 0.85±0.06# 0.35±0.03# 0.28±0.02#EBI+CA1 組 5 2.07±0.15△ 0.35±0.02△ 0.87±0.05△ 0.83±0.05△組別 動物數 Bax Bcl-2 p-JAK2/JAK2

3 討論

缺血性腦卒中是一種常見的急性腦血管疾病，主要是由缺血性血管的短暫或永久閉塞引起，可導致腦組織損傷、梗死甚至殘疾[12]。據報道，神經元死亡可發生在缺血性腦卒中后數分鐘至數小時內，主要通過細胞凋亡或壞死發生。雖然給予重組組織纖溶酶原激活劑和血管內介入可以恢復血流灌注，但缺血再灌注損傷可能導致神經元活性下降，甚至導致更嚴重的細胞損傷[13]。目前，溶栓治療是通過在不可逆的神經元死亡之前向腦組織提供再灌注來改善結果的最有效治療方法。然而，這種策略只能在發病后較短時間內進行才能有效改變缺血的進程[14]。因此，尋找一種有效的方法來預防缺血性神經元損傷對于腦卒中治療是非常必要的。本研究利用MCAO 法建立缺血性腦卒中大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠神經缺損評分高于假手術組，腦梗死面積大于假手術組，同時腦組織神經元退化，細胞排列不規則且核縮小，神經元數目低于假手術組，表明大鼠腦卒中模型復制成功。而EBI 干預后，大鼠神經缺損評分降低，腦梗死面積減小，神經元損傷減輕，細胞形態恢復，神經元數量增加，且EBI 組與陽性藥物尼莫地平組無顯著差異。揭示了EBI 能夠減輕缺血性腦卒中大鼠的神經功能障礙，抑制大腦梗死和神經元損傷。

腦缺血后的神經功能損害歸因于各種病理生理事件，包括神經細胞凋亡、炎癥、免疫功能障礙和血腦屏障損傷，其中神經細胞的凋亡對于缺血性腦卒中的病理生理學至關重要，涉及許多凋亡相關基因，包括抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax[10]。本研究通過TUNEL 染色和Western blot 發現，陽性藥物和EBI 干預后大鼠腦組織中神經元細胞凋亡率小于模型組，Bax 蛋白表達低于模型組，Bcl-2 蛋白表達高于模型組，揭示了EBI 能夠抑制缺血性腦卒中大鼠的神經元凋亡。除此之外，氧化應激也被認為是缺血性腦卒中腦損傷的關鍵致病機制，在再灌注期間，氧和葡萄糖水平異常升高會加劇氧化應激和由于初始缺血而已經發生的細胞死亡[15]。氧化應激主要是由活性氧的過量產生引起的，該過程會促進脂質過氧化來誘導MDA 等活性醛的產生，同時導致SOD、GSH-Px 等抗氧化酶表達減少，抗氧化防御系統失衡，引起更嚴重的氧化應激和神經元損傷[16]。本研究結果顯示，陽性藥物組和EBI 組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 活性高于模型組，MDA 水平低于模型組，表明EBI 能夠抑制缺血性腦卒中大鼠的氧化應激損傷，進而減輕神經元損傷。

據報道，JAK2/STAT3 信號通路是主要的細胞因子信號通路之一，該通路廣泛參與各種疾病的發展，包括免疫反應、細胞凋亡、血管生成、氧化應激和神經炎癥等[17]。研究發現，JAK2/STAT3 激活會導致腦缺血永久神經元損傷，而干擾JAK2/STAT3 信號通路可改善神經功能[18]。因此，本研究探討了JAK2/STAT3 通路在EBI 改善腦卒中神經元損傷中的作用，結果顯示，EBI 組大鼠腦組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 水平均低于模型組，且與JAK2 抑制劑AG490 組無顯著差異，揭示了EBI 能夠抑制腦卒中大鼠中JAK2/STAT3 信號通路的激活。接著又利用JAK2 激活劑CA1 進行回補實驗，結果顯示，EBI對腦卒中大鼠神經元的保護作用被消除，揭示了EBI 對腦卒中大鼠神經元發揮保護作用的具體機制可能與抑制JAK2/STAT3 信號通路有關。

綜上所述，EBI 可能通過抑制JAK2/STAT3 信號通路對腦卒中大鼠神經元發揮保護作用。本研究為減輕缺血性腦卒中神經元損傷提供了新的藥物和理論依據。