基于病證結合的冠心病動物模型制備研究進展與思考*

董雨蓉，解存，劉暢，趙佳，王朔

（1.天津醫科大學胸科臨床學院，天津 300070；2.天津大學胸科醫院急診科，天津 300222；3.天津市心血管危重癥重點實驗室，天津 300222；4.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；5.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

動物疾病模型是生物醫學研究領域中不可或缺的工具，其制備方法是模擬人類疾病的發病機制，或通過模擬致病因素，造成典型或類似的病理狀態，建立與人類疾病相應的動物模型[1]。建立合適的動物模型不僅能推進對于疾病發病機制的認識，而且可以為臨床診療方式的改進及新藥研發提供重要平臺[2]。近年來，中醫藥將“病證結合”“方證對應”的臨床診療方法引入動物模型的構建上，為深入探究中醫證候生物學基礎，實現中醫臨床辨證客觀化、規范化，挖掘并創新中醫理論提供了新的思路與方法。病證動物模型是在西醫動物疾病模型制備方法的基礎上，模擬臨床辨病辨證的方法，通過加入中醫干預因素，建立具有中醫特色的動物模型[3]。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦桥R床中致死率、致殘率較高的心腦血管疾病，《中國心血管健康與疾病報告2021》顯示，目前中國冠心病患病人數約為1 139 萬，近20 年來中國冠心病的發病率增幅較大，上升20.6%，心臟病城鄉病死率分別高達148.51/10 萬、164.66/10 萬，成為中國僅次于腦血管病的第二大疾病死亡原因[4]。中醫將冠心病歸于“胸痹、心痛”“真心痛”等范疇，認為本病往往與氣滯、血瘀、痰濁、寒凝等實邪及氣虛、陰虛、陽虛等虛損病理因素相關，具有本虛標實、虛實夾雜的病理性質，故衍生出多種中醫證型的冠心病。目前，對于冠心病中醫證型動物模型制備方法種類多樣，但存在與臨床病證相關性不強、穩定性較差、主客觀指標不夠明確、病理機制不夠明晰等問題，因此文章通過對冠心病常用動物模型制備方法整理歸納，對冠心病中醫證候動物模型的建立展開思考。

1 冠心病常用動物模型的制備方法

冠心病動物模型常用的動物有大鼠、小鼠、小型豬、兔、犬等，其選取主要以動物生理結構和功能與人的相似程度、實驗目的以及實驗的可操作性等為依據[5]。如大鼠及小鼠具有體積小、易于繁殖和飼養、操作性強、價格低廉等特點，運用最為廣泛；小型豬的生理解剖和血液生化指標與人類接近，且因體積較大，可通過中獸醫學“四診”方法直觀觀測并掌握其癥狀與病情；犬的心血管功能與人相似，但主要用于毒理研究；兔對于高脂飲食極為敏感，容易復制高脂血癥模型[6]。見表1。

表1 冠心病常用動物模型的制備方法匯總Tab.1 Summary of preparation methods of common animal models of CHD

1.1 手術損傷法

1.1.1 開胸手術造模 冠狀動脈結扎術是最常用的方法。該方法是通過對麻醉狀態下的實驗動物冠狀動脈分離處結扎，造成心肌局部缺血或壞死，復制臨床中類似心肌梗死的動物模型[7]。實驗動物根據心臟解剖結構的不同，結扎部位有所差異，如大鼠一般在左心耳與肺動脈圓錐之間，即冠狀動脈左前降支（LAD）部位結扎；小型豬在LAD 中下1/3 部位結扎；犬在LAD 第1 對角支部位結扎；兔在LAD第1、2 對角支部位結扎。記錄Ⅱ導聯心電圖，若ST段（ST-segment）抬高且結扎部位以下顏色發紺、搏動減弱為建模成功的標志。該方法阻塞冠狀動脈分支對血管損傷較大，動物死亡率相對較高，因此手術時可滴注硝酸甘油預防血管痙攣，或噴灑利多卡因降低心臟對手術的反應刺激，同時密切關注動物心律及呼吸狀態，及時進行搶救。

冠狀動脈夾閉法原理與結扎法類似，是將分離出的冠狀動脈通過無創動脈夾鉗進行阻斷，具有創傷小，操作簡單的特點，主要用于心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型的制備[8]。由于對操作者分離冠狀動脈的技術手法要求較高，沒有結扎法運用廣泛。

冠狀動脈壓迫法使用氣囊梗阻器或水囊縮窄器固定于冠狀動脈表面，通過控制球囊改變冠狀動脈的血流流量，造成血液循環障礙，從而構建心肌缺血模型[9]。這種方法可控性強，可以模擬冠狀動脈不完全狹窄和完全性狹窄的心肌缺血狀態[10]。

吸水性的塑料環（Ameroid）縮窄法是在動物麻醉狀態下開胸，將具有吸水性的Ameroid 環套在LAD 上，在閉合胸腔后，Ameroid 環塑料層會吸水膨脹，但由于其外層為金屬構造，膨脹的塑料層只能逐漸向內擠壓血管，造成慢性心肌缺血損傷[11]。該方法主要用于小型豬、犬等大型實驗動物慢性心肌缺血模型的制備。

1.1.2 閉胸手術造模 閉胸手術法借助于臨床中微創介入原理，一般是通過分離的頸總動脈將堵塞物（血栓栓塞或球囊）送入冠狀動脈內造成血流終止[12]。該方法主要用于小型豬、犬等大型實驗動物，具有創傷小、動物成活率高的特點。但對操作者技術手法、操作經驗要求較高，且由于不同動物可能存在較大的體積差異，堵塞物大小不一，易造成較大的實驗誤差。

內膜損傷法是將球囊通過預置導管經頸總動脈進入冠狀動脈，利用球囊機械性抽動導致血管內膜損傷，內膜平滑肌細胞增殖，造成管壁增厚管腔狹窄，模擬臨床冠心病患者心肌缺血狀態。該方法常用于小型豬心肌缺血模型的制備[13]。

微電流刺激法是用電極導管置于LAD 處釋放微電流，刺激冠狀動脈血管外膜使之受損，經生理性止血過程產生血栓或血管閉塞[14]。該方法操作損傷小，可以模擬急性冠狀動脈綜合征發生后產生的瘢痕組織。

1.2 藥物造模

1.2.1 腦垂體后葉素（Pit）誘導法 Pit 的藥物機制是大劑量注射致可使血栓烷A2 （TXA2）/前列環素（PGI2）異常，從而全身小血管收縮、冠狀動脈痙攣，外周負荷增大，心肌耗氧增加從而導致心肌缺血[15]。此方法操作簡便，且與冠心病心絞痛急性發作時的狀態相近。大鼠一般可采取皮下注射、腹腔注射、舌下靜脈推注等方式，兔采用耳緣靜脈注射的方式進行模型的制備。

1.2.2 異丙腎上腺素（ISO）誘導法 連續注射ISO至動物體內，通過激動心臟β1 受體使心率加快，心肌收縮力增強，心肌耗氧量增大，導致氧供需失衡，造成心肌缺血損傷[16]。同時激動β2 受體使全身骨骼肌血管舒張，冠狀動脈血管舒張，由于靜脈給藥舒張壓明顯下降，冠狀動脈血流減少，加重心肌缺血狀態。大鼠、小鼠可采用腹腔注射方式，兔采用耳緣靜脈注射或腹腔注射方式進行模型的制備。

1.2.3 阿霉素（Dox）誘導法 將生理鹽水配置的Dox 溶液連續注射至動物體內，刺激神經內分泌系統，造成心臟毒性，表現為心功能下降，即可說明心肌缺血[17]。大鼠、小鼠可采用尾靜脈注射或腹腔注射方式進行模型的制備。

1.3 飲食誘導造模

1.3.1 高脂飲食 高脂飼料喂養誘導法通過喂養動物高脂飼料，使其機體發生脂代謝紊亂，動脈形成粥樣硬化性斑塊，并表現出心功能損傷的癥狀，即可說明心肌缺血[18]。該法主要適用于基因缺陷型小鼠心肌缺血模型的制備，如載脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）小鼠、低密度脂蛋白受體（LDL-R）缺陷小鼠等[19]。

1.3.2 維生素D3（VD3） VD3是鈣離子誘導劑，通過大量的VD3灌胃，機體血鈣升高，促使鈣鹽在動脈內膜中沉積，平滑肌細胞鈣化或變性，血漿內脂質對動脈管壁發生侵蝕和損傷，從而建立冠狀動脈粥樣硬化模型[20]。

1.4 其他

1.4.1 運動負荷法 采用強迫跑臺運動的方法，并采用聲音、小木棍敲打、電擊等刺激，使大鼠保持運動強度至力竭，以大鼠下跑臺后腹部著地、四肢癱軟、翻正反射暫時消失作為模型成功的標準。力竭性運動使心臟處于高負荷狀態，需氧量明顯增加，導致心肌組織缺血缺氧，從而心電圖呈現缺血性改變、心肌形態結構發生改變，并且心血管活性物質失衡加重心肌損傷[21]。

1.4.2 轉基因動物模型 最常用的小鼠模型是ApoE 聯合LDL-R 基因敲除。ApoE 缺乏會使脂質代謝紊亂，且LDL-R 基因缺失影響低密度脂蛋白的降解，從而脂質沉積于血管內皮產生粥樣斑塊[22-23]。在ApoE 和神經元型一氧化氮合酶（nNOSα）雙基因敲除動物中，nNOSα 具有在血管受損后抑制內膜增生，預防動脈粥樣硬化的作用，其遺傳缺失則加速了動脈粥樣硬化發生的風險。

目前制備冠心病動物模型的方法較為成熟，結合造模后動物的一般情況、生化指標、心電圖表現及病理指標，來模擬臨床癥狀和體征，選擇制備具有相應實驗目的的冠心病動物模型。一般來講，手術法具有創傷大、程度重的特點，更加偏于模擬急性心肌缺血狀態，藥物及飲食法造模周期相對較長，用于模擬創傷程度相對較輕的慢性心肌缺血狀態。冠心病結合中醫證型模型的制備是當下研究熱點，目前模型多在西醫病因病理基礎之上，結合中醫對冠心病即“胸痹心痛”病機理論，而建立的病證結合動物模型。

2 冠心病中醫證候動物模型的制備方法

根據《中醫內科學》教材及《中藥新藥臨床研究指導原則》，總結并列舉常見冠心病中醫證候動物模型，主要包括血瘀證（心血瘀阻證）、氣虛血瘀證、氣陰兩虛證、痰瘀互結證、脾虛痰濁證、寒凝血瘀證等[3，24]。見表2。

表2 冠心病中醫證候動物模型制備與評價指標Tab.2 Preparation and evaluation index of animal model of traditional Chinese medicine syndrome of CHD

2.1 血瘀證動物模型 血瘀證是最常見的冠心病中醫證型，多因血行不暢，凝滯心脈，引起心胸刺痛，可見胸部固定性痛，舌質或舌體紫暗且有瘀斑瘀點，舌下靜脈紫暗，口唇紫暗或暗紅。

在大鼠高脂飼料飼養后的第7 日和第14 日分2 次進行VD3注射，并在飼養12 周大鼠主動脈斑塊形成后，結扎LAD，以即時Ⅱ導聯心電圖所示ST 段弓背抬高，肉眼所見結扎部位以下心肌蒼白作為判斷模型成功建立的標準，并以養心通脈方作為“以方測證”的藥物反證模型建立[25]。有學者采用高脂飼料喂養、VD3灌胃復合皮下多點注射ISO 方法造成實驗大鼠心肌缺血，模擬心脈痹阻的情況，觀察心電圖J 點及ST 段的改變程度證實模型建立，并通過觀察其代謝物的變化，發現血瘀證的特異性標志物[26-29]。藺瑞等[30]采用Ameriod 縮窄環置入術建立模型，在第8 周時通過冠狀動脈造影提示冠狀動脈狹窄程度達99%，結合血脂、凝血、血流變指標升高，提示冠心病處于血瘀狀態，證明模型建立成功。以上方法均可在一定程度上造成單純或復合的冠狀動脈血流速度減緩、內皮損傷或血液流變學改變，模擬臨床中血瘀證的表現。

2.2 氣虛血瘀證動物模型 氣虛血瘀證是常見的虛實夾雜復合證型，多因氣虛無力或血行瘀滯互為因果，引起心陽不振，瘀阻心脈之癥，常有胸悶心悸，心痛如刺，精神疲憊，舌色暗淡或有斑點等臨床表現，一般采用模擬“氣虛+血瘀”的聯合誘導方式制備模型。

采用LAD 結扎復合強迫跑步的方法模擬“氣虛血瘀”狀態，結合臨床辨證依據，觀察模型大鼠主癥、兼癥，將胸痛胸悶、心悸氣短主癥量化為心臟功能和呼吸幅度具體指標，身倦乏力、面色紫暗兼癥量化為空場實驗指標、力竭運動和舌底紅-綠-藍-色彩模式（RGB）值，并采集舌象RGB 值及脈搏幅度，以雙參通冠方進行干預，全面觀測上述證型表征，證明模型建立成功[31]。復合控制飲食、疲勞運動及冠狀動脈結扎的方法建立冠心病氣虛血瘀證大鼠模型，以心電圖ST 段弓背抬高、舌色RGB 值改變、舌頭蘇木精-伊紅（HE）染色法及PGI2、TXA2 的變化作為評價標準，從西醫病理機制、中醫辨證理論及微觀生化指標方面證明該模型的成立[32]。采用游泳、高脂飼料饑餓飼養聯合Pit 腹腔注射的方法建立的小鼠模型，通過中醫證候評分量化氣虛血瘀“證”的特征，觀測心電圖示T 波低平或倒置聯合心率增快、血液黏稠微觀指標模擬冠心病“病”的特征，以此評價“病證結合”的冠心病氣虛血瘀證小鼠模型[33]。以上方法在“血瘀證”的基礎上，從干預因素（疲勞運動、飲食控制）到癥狀表現（倦怠乏力、證候評分）再到理化客觀指標復合臨床“氣虛證”的表現，更加貼合臨床氣虛血瘀證的發病機制及癥狀表現。

2.3 氣陰兩虛證動物模型 氣陰兩虛證是冠心病中后期常見的證型，多因心氣虛損并見陰血不足，引起心神失養，心胸隱痛，表現為胸部隱痛或悶痛、神疲力乏、煩躁不安、舌紅苔少或舌淡胖有齒痕。

采用小型豬為研究對象，通過經皮冠狀動脈腔內血管成形術（PTCA） 球囊擴張導管阻塞LAD 血流，造成冠心病心肌缺血狀態，其中心肌損傷致使心臟結構和功能表征指標下降，以及舌脈評分的變化均提示氣陰兩虛證病理及體征的改變，并以通脈養心丸和生脈膠囊干預，驗證該模型評價指標的可靠性[34]。該模型用球囊加壓阻斷血流供應，并采用“以方測證”的方法結合客觀指標進行評價，對研究氣陰兩虛證具有指導作用，但該證在臨床中多為冠心病久病或老齡人群，因此制備模型時間較長。

2.4 痰瘀互結證動物模型 痰瘀互結證是隨著現代疾病譜改變逐漸增多的一類復雜證型，多因脾虛生痰，氣血瘀滯，相互搏結，引發心脈損傷，表現為胸部悶痛、唇舌青紫的“血瘀”，并見頭昏乏力、身體肥胖、大便黏膩、舌苔肥膩、毛發油膩的“痰濁”癥狀。

陳潔等[35]用高脂高糖飼料喂養復合腹腔注射VD3建立痰瘀互結證大鼠模型，以大鼠造模后出現精神萎靡、嗜睡少動、反應遲緩，血脂檢查見三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高，胸主動脈解剖見不穩定的粥樣斑塊提示造模成功。潘永明等[36]用長期高脂飼料喂養復合注射VD3+ISO 的方法建立模型，觀察小型豬下腹部出現紅色瘀斑、耳部瘀紫、喘息加快、趴伏煩躁或不動等心肌缺血的體征，舌苔厚膩、舌色紫暗、毛發油膩無光澤等情況來判定“痰瘀互結證”模型是否成功建立。李磊等[37]在高脂飼料喂養基礎上，在冠狀動脈造影后將球囊送入LAD 并進行拉動，造成冠狀動脈損傷，模擬痰濁與血瘀并見的狀態，檢測血脂、血流變改變情況。使用小動物超聲觀察心功能變化，采集中醫證候評分信息，綜合評估冠心病痰瘀互結證小型豬模型的建立情況[37-38]。

課題組對比高脂飼料聯合手術、藥物造模的方法，發現采用高脂飼料喂養結合LAD 結扎術的方法，模擬“由痰致瘀、痰瘀互結”的病理變化來制備痰瘀互結證大鼠、小鼠模型，具有穩定性好、成模率高、可復制性強的特點[39-40]。以造模后血脂異常、HE染色脂肪細胞沉積作為“痰濁”的病理表現，以心功能降低、心肌纖維化作為“瘀血”的病理表現，并觀察一般情況，檢測血流變、心肌酶、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）指標改變及機制通路相關指標變化作為輔助提示該證型建立的參考依據[41-44]。通過丹蔞片干預冠心病痰瘀互結證大鼠模型，發現相關藥理學指標、生化指標及代謝產物均有顯著回調，進一步反證“病證結合”指導下痰瘀互結證模型的可靠性及實用性[45]。

2.5 脾虛痰濁證動物模型 因過食肥甘，脾失健運，聚生濕痰，久聚不散可損傷脈道，形成動脈粥樣斑塊，瘀塞心脈，表現為胸悶胸痛、胃脘痞滿、肢體沉重、面色無華、納呆、倦怠，多采用高脂飲食喂養制備模型。

在高脂飼料喂小型豬24 周后，觀察發現小型豬出現類似于痰濁證的臨床癥狀，如形體肥胖、毛發干枯及神志淡漠、舌色淡白、嗜睡懶惰的表現，進一步檢測血清及心臟組織的血脂及生化指標水平，發現脂質水平及內皮功能均出現明顯損傷，提示脾虛痰濁證小型豬模型建立成功[46]。采用高脂飼料喂養及腹腔注射VD3建立大鼠模型，通過觀察大鼠一般情況及主動脈病理學染色，檢測血脂及炎癥、內皮損傷指標，發現該模型出現粥樣斑塊沉積、脂質過氧化表現，符合脾虛痰濁證的病理變化[47]。用隔日游泳、高脂飼料喂養聯合冠狀動脈結扎法制備冠心病“脾虛生痰”型小型豬模型，心肌細胞病理學及缺血區超微結構顯示心肌細胞結構破壞，線粒體腫脹，炎性因子蛋白及信使RNA（mRNA）表達明顯增高，提示痰濁內生加劇心臟損傷[48]。該模型主要仍以高脂飼料喂養模擬痰濁壅盛的病理性質，復合微觀指標提示心臟損傷，從而制備脾虛痰濁的動物模型。

2.6 寒凝血瘀證動物模型 寒凝血瘀證也是臨床常見的冠心病證型，多因陰寒凝滯，閉阻陽氣，發為驟然心痛，表現為胸痛遇寒而發或猝然心痛、面色蒼白、畏寒肢冷、舌色紫暗癥狀。

通過將大鼠間斷反復冷刺激將大鼠置于寒冷/復溫的環境，模擬寒邪凝滯的病機，加之Pit 注射造成心肌缺血的血瘀病機，構建寒凝血瘀證的動物模型，將宏觀表征（體溫下降、唇周爪子黏膜顏色變淺、心率降低等）和微觀指標[微靜脈收縮、血液流速減慢、血漿TXB2、大鼠6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）值升高等]作為寒凝血瘀證大鼠模型建立的診斷標準[49]。該造模方法通過寒冷刺激的方式模擬因寒致病的病理機制，聯合理化指標反映血管痙攣、血流變改變、心肌微循環障礙等血瘀病理性質，但存在無法模擬臨床猝然胸痛的客觀表現等問題。

上述方法是目前制備冠心病病證結合模型最為常見的，多是在中醫理論指導下，西醫病理模型復合多因素模擬中醫病因病機建立證候模型，主要通過觀察實驗動物的一般情況，結合相關生化指標建立證候模型，一定程度上體現出中醫病證結合的特色，可與中醫臨床辨治相對應。

3 討論

3.1 中醫與西醫對冠心病實驗動物模型建立的比較 冠心病動物模型的制備是模擬人類冠心病病因病機所致的病理狀態，其基礎仍以西醫病理學為基礎，是連接基礎研究和臨床應用的重要工具。西醫冠心病動物模型多施加單一物理、化學、生物手段，造成實驗動物組織器官損傷，模擬冠心病發展某一階段典型或類似的病理狀態，具有操作簡便、模型穩定、公認度較高的特點[50]。而中醫冠心病動物模型則是結合中醫辨證論治原則，多采用西醫病理模型復合中醫病因病機的造模方法，更具中醫藥病證結合研究特色，更貼合中醫認識冠心病的角度和思路，但普遍來講，中醫冠心病動物模型制備及評價方法尚未形成研究領域統一標準，因此推廣度較差、公認度較低[51]。

3.2 病證結合動物模型制備的實踐與認識 以冠心病痰瘀互結證大鼠、小鼠模型建立為例，課題組依據“脾虛生痰，心脈瘀阻，終致痰瘀搏結”的病機演變規律模擬建立動物模型，參照臨床獲得的客觀化、特異性指標在實驗動物上進行佐證，并進行方證對應的相關研究，形成了較為系統的冠心病痰瘀互結證病證結合研究思路，總結以下幾個特點。

3.2.1 病證結合，反映中醫辨證思路及特色 西醫認為冠心病的病理基礎為各種原因導致的心肌供氧和需氧失衡，造成冠狀動脈粥樣硬化不斷累積，引起斑塊破裂，導致心臟功能受損，中醫將其歸因于瘀血痹阻心脈，并認為脾虛導致的痰濁內生，是冠心病發生的始動因素[52]?；谏鲜稣J識，在模型制備時，先采用高脂飲食的方式進行喂養，模擬“痰濁”的病理狀態，并采用結扎的方法阻斷冠狀動脈血流，模擬西醫心肌缺血的病理狀態，即中醫的“血瘀”病理性質，并通過指標檢測證明復合的證候模型病變程度重于單一證候模型，并與臨床癥狀相吻合，即判定為“痰瘀互結”模型制備成功。

3.2.2 方證對應，反證動物模型的穩定性 丹蔞方作為治療冠心病痰瘀互結證臨床的辨治用藥，在“以方測證”原則指導下，分別給予冠心病痰瘀互結證大鼠、小鼠灌胃干預，通過觀測模型建立和評價相關指標的改善，反證該模型的可靠性、穩定性和科學性。此外，通過將臨床研究獲得的證型特異性指標，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、白細胞介素-6（IL-6）、血管緊張素Ⅱ（Ang-Ⅱ）等在動物實驗層面進行驗證，并觀察動物有臨床患者的類似體征（一般情況、舌紫暗等），形成結合宏觀表征與微觀辨證的研究方法，進一步驗證該模型的可信度，明確該模型在病理層面的作用機制，為中醫藥“病-證-方”對應研究提供研究方向。

3.2.3 中西匯通，融合現代生物分析技術 采用系統生物學及藥物化學分析技術，將組學分析手段引入冠心病痰瘀互結證分子水平領域的探索研究，找到其特異性組學生物標志物，也為揭示冠心病痰瘀互結證的證候規律及意義提供依據。課題組采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（UPLC-QTOF/MS）檢測經丹蔞片干預后冠心病痰瘀互結證大鼠血清中代謝物的變化，發現亞油酸、γ-亞麻酸和溶血磷脂酰膽堿出現明顯回調變化，也可作為冠心病痰瘀互結證微觀辨證的代謝生物標志物，為中醫證候的研究提供研究思路。

3.3 不足與展望 目前，病證結合的冠心病實驗動物制備方法已成為中醫藥領域內中醫病因病機探索、證候類型比較、中藥新藥開發、藥效物質基礎等基礎研究的重要工具和手段，一定程度上推動了中醫藥科研的客觀化、現代化。就動物模型本身而言，現有的制備方法不可能完全模擬人類冠心病動脈斑塊破裂引起的血管內皮損傷，最終導致心臟功能受損的致病機制，只是反映某一病理階段的具體表現，主要通過動物生化指標結果提示具有類似的病理機制。加之中醫辨證所創造的復合模型，僅是從中醫理論角度出發，對中醫臨床實際進行了模擬，且未形成公認的客觀評價標準和研究路徑，故部分學者對病證結合模型持有懷疑或否認的態度[53]。此外，中醫診斷主要通過望、聞、問、切4 個方面獲取診斷信息，然而其中的“問”詢問患者的主觀感受以及“切”切脈來判斷陰陽表里、寒熱虛實等相關情況無法在實驗動物上實現，這是無法跨越的壁壘，且對于實驗動物生活狀態、飲食情況、身體狀況等變化情況的客觀化標準，冠心病病證結合動物模型的發展之路仍需要不斷探索和完善[54]。