溫胃陽湯對功能性消化不良大鼠肥大細胞活化及SCF/c-Kit信號通路的影響*

稅典奎， 黎舒婷， 黃慧花， 龍海華， 楊 健， 羅詩雨， 覃凌娜

[1柳州市中醫醫院（柳州市壯醫醫院），廣西 柳州 545001；2柳州市柳鐵中心醫院，廣西 柳州 545007］

功能性消化不良（functional dyspepsia， FD）是臨床中常見的功能性胃腸病，嚴重影響人類工作和生活。目前，FD 的發病機制尚未明確，胃腸動力障礙被認為是基本的病理機制之一，十二指腸異常是對FD發病機制的新認識[1-2］。肥大細胞（mast cell， MC）是機體重要的免疫細胞，可有效調節胃腸神經，MC活性因子可引起胃腸動力障礙及感覺異常。以往研究表明，干細胞因子（stem cell factor， SCF）/受體酪氨酸激酶c-Kit 通路是緩解FD 的有效途徑[3］。本課題組一直致力于FD 的發病機制和中醫藥治療策略研究，曾研制出的溫胃陽湯（Wenweiyang decoction，WWYD）被證明對胃動力低下大鼠具有良好的促胃動力作用[4］，然而目前基于該方劑治療FD 的作用機制尚未明了。本研究將探討WWYD 對FD 大鼠十二指腸黏膜下肥大細胞及SCF/c-Kit 信號通路的影響，進一步揭示該方改善FD大鼠胃腸動力的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 動物 5周齡SPF級SD雄性大鼠60只，體質量（206.9±5.8） g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0014。大鼠在標準實驗室條件[恒溫（20～26）℃、12 h 明暗交替］下飼養7 d，所有動物均自由進食水。實驗嚴格遵循柳州市中醫醫院（柳州市壯醫醫院）實驗動物倫理審查標準，審批號為2020JAN-KY-YN-003-01。

1.2 藥物 WWYD 組成：桂枝12 g、紅參12 g、法半夏9 g、炮姜10 g、砂仁6 g、茯苓20 g、紫蘇梗10 g、厚樸15 g、草豆蔻6 g、益智仁15 g，藥材為顆粒劑，用純凈水配成所需濃度的混懸液。鹽酸雷尼替丁膠囊ranitidine hydrochloride capsule， RHC）購自廣東恒健制藥公司（批號H44021173）。

1.3 主要試劑 ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）；兔抗GAPDH 抗體（江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGAA002）；兔抗c-Kit 抗體（Abclonal，A0357）；兔抗SCF 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，26582-1-AP）；Western blot 檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGP1201）；Trizol（Invitrogen，15596-026）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（TaKa-Ra，RR036B）。

2 主要方法

2.1 動物分組及給藥 將所有大鼠隨機分為6 組，即空白（control）組、模型（model）組、陽性對照RHC組、低劑量WWYD（low-dose WWYD， WWYD-L）組、中劑量WWYD（medium-dose WWYD， WWYD-M）組和高劑量WWYD（high-dose WWYD， WWYD-H）組，每組10 只。除control 組外，其余各組大鼠采用夾尾刺激加不規則喂養復合番瀉葉建立FD 模型[5］：不規則飲食法，單日進食，雙日禁食不禁水，普通飼料喂養；用蝴蝶夾夾住大鼠尾巴后1/3，每日夾2 次，一次30 min；同時每日灌胃番瀉葉，10 mL/kg，連續灌胃7 d 進行造模。control 組和model 組大鼠灌胃生理鹽水，WWYD-L、WWYD-M、WWYD-H 和RHC 組大鼠則分別用WWYD（0.743 g/mL、1.485 g/mL、2.970 g/mL）及鹽酸雷尼替丁膠囊（3 g/L）灌胃，灌胃量均為10 mL/kg。各組大鼠每日定時灌胃，連續7 d。

2.2 標本采集 十二指腸組織分離腸系膜，剪去組織周邊多余脂肪，將幽門至回盲部的腸管取出，輕拉成直線，置于白紙上，拍照記錄。十二指腸組織縱剪剖開，清洗干凈，一半組織放入-80 ℃保存，一半組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋。

2.3 小腸推進實驗 造模給藥結束后，將大鼠斷食不斷水24 h，每只灌胃3 g 營養糊，30 min 后處死，打開腹腔，剪取整個小腸，分離腸系膜，將幽門至回盲部的腸管取出，輕拉成直線，置于白紙上，此長度即為小腸總長度，幽門到碳墨前端的長度為碳墨在小腸內前行的距離。小腸推進率（%）=碳墨在小腸推進的距離/小腸總長度×100%。

2.4 甲苯胺藍染色觀察FD 大鼠MC 及MC 脫顆粒數目 取十二指腸組織切片，常規脫蠟，放入0.5%甲苯胺藍溶液中，95%乙醇分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察組織切片中MC形態并計數。在100倍視野下采集3個視野，進行肥大細胞計數。

2.5 ELISA 測定肥大細胞類胰蛋白酶（mast cell tryptase， MCT）和組胺（histamine， HA）的含量 腹主動脈采血法取血，取離心后上清液，采用ELISA 試劑盒檢測MCT 和HA 含量，讀取各孔的吸光度（A）值，以此計算樣本濃度。

2.6 RT-qPCR 檢測SCF 和c-Kit mRNA 表達 提取十二指腸組織中總RNA，按試劑盒步驟逆轉錄成cDNA，引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，40 個循環；監測熔解曲線。記錄樣本擴增反應的Ct 值，采用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測SCF 和c-Kit 蛋白表達 取適量十二指腸組織，提取蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。常規制SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠，上樣、電泳，濕法電轉將蛋白轉移至NC 膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入SCF（1∶500）、c-Kit（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體，4 ℃搖床孵育過夜。取出后，TBST 洗10 min×3 次，室溫搖床孵育相應Ⅱ抗（1∶1 000）2 h，洗膜。顯色后，使用Gel-Pro32 軟件對結果進行分析。

2.8 免疫組化法觀察SCF 和c-Kit 蛋白表達 按常規方法進行脫蠟、水合、抗原修復、滅活酶、封閉、滴加Ⅰ抗50～100 μL，4 ℃過夜。PBS 浸洗3 min×3 次，滴加羊抗鼠聚合物50 μL，室溫濕盒孵育20 min。PBS 浸洗3 min×3 次，DAB 顯色，蘇木素染液復染、脫水封片，數字病理切片掃描儀掃片觀察SCF 和c-Kit蛋白表達位置。結果判斷：顯微鏡下胞質出現棕黃色片狀或顆粒狀物為陽性。

3 統計學處理

采用SPSS 26.0 統計軟件進行分析。數據均用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析；如樣本資料不符合方差分析的條件，則采用完全隨機設計的秩和檢驗（Kruskal-Wallis 檢驗）。相關性比較采用Pearson 相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 WWYD對大鼠小腸推進率的影響

與control 組比較，model 組大鼠的小腸推進率顯著下降（P＜0.01）；與model 組相比，WWYD-L 組、WWYD-M 組、WWYD-H 組和RHC 組大鼠的小腸推進率均顯著提高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Effect of Wenweiyang decoction （WWYD） on small intestine propulsion rate in rats. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs model group.圖1 溫胃陽湯對大鼠的小腸推進率的影響

2 WWYD 對大鼠十二指腸黏膜組織肥大細胞數量及MCT和HA含量的影響

與control 組比較，model 組大鼠十二指腸組織中MC 數量顯著增加（P＜0.05），MCT 和HA 含量顯著升高（P＜0.01）；與model 組比較，WWYD-L 組、WWYDM 組和WWYD-H 組大鼠十二指腸組織中MC 數量顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01），MCT 和HA 含量均顯著下調（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. Effects of Wenweiyang decoction （WWYD） on mast cell counts and mast cell tryptase （MCT） and histamine （HA） content in rat duodenal mucosa tissues. A： morphological manifestations of mast cells （toluidine blue staining， scale bar=100 μm）and total number of mast cells； B： MCT content； C： HA content. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs model group.圖2 溫胃陽湯對大鼠十二指腸黏膜組織肥大細胞數量及肥大細胞類胰蛋白酶和組胺含量的影響

3 WWYD 對大鼠十二指腸SCF 和c-Kit mRNA 水平的影響

與control 組相比，model 組大鼠十二指腸組織SCF 和c-Kit 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與model 組相比，WWYD-M 組、WWYD-H 組和RHC組大鼠十二指腸組織c-Kit和SCF的mRNA 表達水平均顯著升高（P＜0.01），見圖3。

Figure 3. Effects of Wenweiyang decoction（WWYD） on the mRNA expression of SCF（A） and c-Kit （B） in rat duodenum. RHC：ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs model group.圖3 溫胃陽湯對大鼠十二指腸SCF和c-Kit mRNA表達的影響

4 WWYD 對大鼠十二指腸SCF 和c-Kit 蛋白水平的影響

與control 組比較，model 組大鼠十二指腸組織中c-Kit 和SCF 蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.01）；與model 組比較，WWYD-M 組、WWYD-H 組及RHC 組大鼠十二指腸組織c-Kit和SCF蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），WWYD-L 組c-Kit 和SCF蛋白表達升高，但差異不顯著（P＞0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of Wenweiyang decoction（WWYD） on the protein expression of SCF and c-Kit in rat duodenum. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs model group.圖4 溫胃陽湯對大鼠十二指腸SCF和c-Kit蛋白表達的影響

5 WWYD 對大鼠十二指腸SCF 和c-Kit 陽性細胞數的影響

免疫組化染色結果顯示，model組大鼠十二指腸組織中SCF和c-Kit陽性細胞數較control組顯著減少[（69±13）vs（101±9）/5 個 高 倍 鏡 視 野，（64±8）vs（97±11）/5個高倍鏡視野，P＜0.05］，WWYD-H組SCF和c-Kit 陽性細胞數較model 組顯著增加[（91±12）vs（69±13）/5 個高倍鏡視野，（80±13）vs（64±8）/5 個高倍鏡視野，P＜0.05］，見圖5。

Figure 5. Effects of Wenweiyang decoction （WWYD） on the numbers of SCF （A） and c-Kit （B） positive cells in rat duodenum （immunohistochemical staining， scale bar=100 μm）. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs model group.圖5 溫胃陽湯對大鼠十二指腸SCF和c-Kit蛋白陽性表達細胞數量的影響

6 相關性分析

小腸推進率分別與MCT 和HA 含量呈負相關，與SCF 和c-Kit 的表達呈正相關（r值分別為-0.482、-0.450、0.750 和0.742，P＜0.05）；SCF 和c-Kit 與MCT和HA不存在相關關系（P＞0.05）。

討 論

FD 癥狀反復、病情遷延難愈，久病易傷陽。本實驗采用夾尾刺激加不規則喂養復合番瀉葉法建立大鼠FD 模型，其中夾尾刺激加不規則喂養是經典的FD造模方法[6］，《脾胃論·飲食勞倦所傷始為熱中論》云：“苦寒之藥損其脾胃”，番瀉葉性味苦寒，苦寒瀉下傷脾陽引起脾胃虛寒。WWYD 集溫陽、益氣、化濕、祛痰、理氣多法于一方，可使中焦脾胃和小腸得以溫運，脾胃納運復常，腸氣通暢，諸病證自除。

SCF 又稱MC 生長因子，是c-Kit 的配體。c-Kit作為肥大細胞標志性蛋白，參與細胞內信號轉導，當c-Kit與SCF 結合時，可被迅速磷酸化，激活下游一系列信號分子，這些信號分子調節MC 的增殖、生長和活化[7］。在十二指腸部位，肥大細胞作為免疫炎癥細胞，SCF 促進腸道MC 增生，MC 活化可釋放多種介質，如組胺、5-羥色胺和類胰蛋白酶等，引起胃、十二指腸的炎癥反應[8-9］。治療FD 的有效方法包括質子泵抑制劑、H2 受體拮抗劑和促胃腸動力藥等，本實驗選用雷尼替丁作為陽性對照藥，其作為組胺H2 受體拮抗劑，能夠直接作用于MC，從而抑制組胺等所致組胺效應，緩解炎癥反應。有實驗顯示通過下調MC 表面受體c-Kit 及其配體SCF 水平使MC 脫顆粒減少，從而抑制HA釋放[10］。

SCF/c-Kit 通路可以通過調控Cajal 間質細胞、MC 內相關因子的數量及結構治療FD[3］，SCF 和c-Kit的低表達可能導致Cajal 間質細胞缺失并參與胃腸運動障礙[11］。MC 已被證實參與FD 發病過程，然而經SCF/c-Kit 通路調控MC 治療FD 的調控機制尚不明確。本研究顯示，經高劑量WWYD 給藥后，十二指腸組織中SCF 和c-Kit 的陽性細胞數目顯著升高，相應的mRNA 水平升高，MCT 和HA 表達顯著降低，并且小腸推進率與SCF 和c-Kit 的表達呈正相關，可見WWYD 通過調節FD 大鼠十二指腸SCF、c-Kit 及其受體表達，激活SCF/c-Kit 信號通路，同時抑制MCT和HA的生成，從而恢復大鼠十二指腸動力。

既往關于FD 的研究主要集中于胃的結構功能異常，包括動力障礙、敏感性增高及順應性下降等，前期研究證明WWYD 在治療FD 中促胃動力作用顯著[12］。最近的研究表明，十二指腸因素（如酸、膽鹽、微生物群以及肥大細胞活化）可能與胃腸感覺運動功能障礙有關[8，13］，本研究結果顯示，給予FD 模型大鼠WWYD 治療后，大鼠的小腸推進率顯著提高，進一步證實WWYD 具有促進大鼠十二指腸動力的作用。十二指腸黏膜伴有輕微的嗜酸性粒細胞和肥大細胞浸潤及脫顆粒增加[13-14］，十二指腸病理學的識別有望成為治療FD 新的生物標志物和治療靶點。本實驗初步完成MC 計數以及MCT 和HA 的自發釋放水平檢測，今后的研究將檢測MC 釋放炎癥因子，如白細胞介素10（interleukin-10， IL-10）、IL-1β、IL-6 等的水平，進一步揭示WWYD 改善十二指腸微炎癥的作用機制。

綜上所述，本研究首次證實WWYD 能夠激活SCF/c-Kit信號通路，抑制肥大細胞活化，促進大鼠十二指腸動力，為FD等相關胃腸動力疾病提供了參考。本實驗表明，小腸推進率與MCT 和HA 含量呈負相關，說明肥大細胞活化過程參與大鼠十二指腸運動，而SCF 和c-Kit 與MCT 和HA 不存在相關關系，提示FD大鼠中十二指腸肥大細胞活化可能與其他通路相互影響發揮促十二指腸動力作用，還需進一步研究。