二氧化硅所致急性肺損傷大鼠肺部菌群的特征及相關性分析*

劉 暢， 蘆 俊， 肖 榮， 李迎秋， 胡 玨， 田 玥， 張家祥， 盧芳國△

（1湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208；2湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；3湖南省中西醫結合醫院，湖南 長沙 410006）

很多工業生產過程中均可以接觸到二氧化硅（silica），尤其是建筑、化工、機械、電子等工作崗位，如防護措施不良可能患矽肺（silicosis）。矽肺是一種不可逆的肺部疾病，由長期吸入空氣中大量游離二氧化硅粉塵引起，可導致肺部炎癥和纖維化[1-2］。多數早期矽肺病患無明顯體征或癥狀輕微，但隨病情發展，會出現呼吸困難、咳嗽、咳痰、胸痛等不適，并伴有肺功能障礙。即使病人不再接觸二氧化硅粉塵工作環境，其肺部病變仍有可能繼續惡化，并可能導致嚴重的并發癥[3］。矽肺的發病機制尚不清楚，治療措施也缺乏突破，最好是預防在先，控制或減少接觸二氧化硅粉塵。研究二氧化硅所致急性肺損傷的生物學機制，可以為早期矽肺預防及治療提供新的思路和方法。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性SD 大鼠16 只，6～7 周齡，體質量（200±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[SCXK（湘）2019-0009］，并飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心（訂購編碼為DWDG-202208010006，質量合格編號為ZS-202208020015）。根據湖南中醫藥大學動物實驗倫理學相關規定進行所有實驗。

2 二氧化硅顆粒物混懸液

參考相關文獻[4］，用滅菌生理鹽水稀釋，制備成50 g/L的二氧化硅顆粒物混懸液，然后將其置于冰袋上備用。

3 儀器與試劑

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）多克隆抗體（Ab-DF7438）和消皮素D（gasdermin D， GSDMD）多克隆抗體（Ab-AF4012）均購自Affinity；糞便DNA 小提試劑盒（HiPure Stool DNA Kit； D3141）購自廣州美基生物科技有限公司；DAB 顯色試劑盒（ZLI-9018）和通用二步法試劑盒（PV-9000）均購自中杉金橋生物技術有限公司；大鼠白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β） ELISA 試劑盒（E20230316-30206A）、大 鼠IL-18 ELISA 試 劑 盒（E20230316-30204A）和大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA 試劑盒（E20230316-31063A）均購自上海酶聯生物科技有限公司。以上實驗用藥4 ℃避光保存備用。

4 分組與制備模型

實驗設立正常組和模型組。在實驗開始前進行3 d 的適應性飼養，稱重以確定其初始質量。隨機數字法選取8 只大鼠，采用非暴露氣管滴注法來建立二氧化硅急性暴露模型：戊巴比妥鈉輕度麻醉大鼠后，每只大鼠接受1 mL 含50 g/L 二氧化硅顆粒物的混懸液氣管滴注。正常組的動物則被隔離飼養在同等條件的房間內，接受1 mL 0.9%氯化鈉溶液氣管滴注。

5 標本采集

造模后第7 天，大鼠禁水禁食8 h 后，稱量體質量。隨后，通過腹主動脈采血并處死大鼠，稱量臟器質量，取部分肺組織，固定于4%多聚甲醛中；剩余部分肺組織放入EP管中，置于-80 ℃的冰箱中凍存。

6 檢測指標

6.1 體重增長率、肛溫和肺指數 稱量動物體質量后計算體重增長率。體重增長率（%）=（取材當天體重-造模當天體重）/造模當天體重×100%。造模和取材當天，戊巴比妥麻醉后測量動物肛溫（℃）；稱量體質量和肺質量，再計算肺指數。肺指數（%）=肺質量（g）/體質量（g）×100%。

6.2 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色檢測肺組織病理變化 采用4%的多聚甲醛對肺組織進行固定，之后再脫水，用石蠟將其包埋，石蠟切片機切片（厚度約5～7 μm），脫蠟后用HE 染色法染色，最后封片。切片制作完成后，使用光鏡觀察。

6.3 免疫組織化學檢測肺組織NLRP3和GSDMD表達 采用PV-9000 通用二步法，檢測大鼠肺組織中NLRP3和GSDMD 蛋白表達水平。石蠟切片處理后，孵育Ⅰ抗并在37 ℃下孵育60 min。正常組使用PBS替代Ⅰ抗。沖洗之后加反應增強劑，并孵育20 min。再加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 聚合物并孵育20 min。使用DAB 顯色后，自來水沖洗并且復染。再進行脫水和透明，最后封片處理。結果顯示細胞膜和細胞質著色為棕褐色或棕黃色即為陽性表達。使用Axiocam 503 color 顯微鏡相機（Zeiss）采集圖像，每張切片選5 個視野進行圖像分析，評估每個視野陽性表達的平均吸光度并求均值（平均吸光度=積分吸光度/目標分布區域的面積），以此作為該樣本的蛋白相對表達量。

6.4 ELISA 法檢測大鼠血清IL-1β、IL-18 和TNF-α含量 在液氮環境中取出冷凍保存的血清標本，待其自然融化后，再使用標本稀釋液將其充分勻漿，制備成10%的勻漿。然后于4 ℃、2 000 r/min 離心20 min，取上清液，舍棄沉淀。操作過程嚴格遵循試劑盒說明書所要求的具體步驟。最后，運用酶標儀進行檢測。

6.5 16S 核糖體RNA（ribosomal RNA， rRNA）基因V3-V4 區測序 每組各選取4 個肺組織樣本，使用HiPure Stool DNA Kit 提取DNA，用NanoDrop 分光光度計檢測DNA 濃度，用瓊脂糖凝膠電泳評估DNA 完整性。DNA 質量符合要求的樣本用于構建文庫。樣本中的基因組DNA 提取后，用帶有barcode的特異引物將rDNA 的保守區擴增，設定相應的反應參數，將16S rRNA 基因V3-V4 區進行PCR 擴增。引物為341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）?；厥誔CR 產物后，用QuantiFluorTM熒光計將其定量。再將純化產物等量混合，連接接頭，構建文庫，最后在Illumina PE250 測序儀上進行測序。16S rRNA 基因的測序分析由廣州基迪奧生物科技有限公司高通量實驗室完成。

6.6 生物信息學分析 測序得到raw reads 后，進行過濾和組裝得到tag，再過濾得到Clean tag?；贑lean tag 聚類，去嵌合體得到Effective tag。得到運算分類單元（operational taxonomic unit， OTU），統計OTU 豐度，先完成物種注釋，再進行Alpha 和Beta 多樣性分析。采用線性判別分析（linear discriminant analysis， LDA）效應量（LDA effect size， LEfSe）對物種豐度差異進行分析，選用LDA 分布圖和進化分支圖表示結果，LDA score （log 10）＞3 則表示物種差異顯著。結合環境因子完成典范對應分析（canonical correspondence analysis， CCA）等高級分析，探究菌群與環境之間的相互關系。

7 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件統計數據。以均數±標準差（mean±SD）表示計量數據。兩組比較時，符合正態性和方差齊性用t檢驗，否則用Wilcoxon 秩和檢驗。Spearman 相關分析用以分析肺部菌群與肺組織蛋白和血清炎癥因子水平的關聯性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 肺指數、肛溫和體重增長率

造模7 d 后，與正常組比較，模型組大鼠肛溫沒有顯著差異（P＞0.05），而體重增長率顯著降低（P＜0.05），肺指數顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠體重增長率、肛溫和肺指數比較Table 1. Comparison of weight growth rate， rectal temperature，and lung index in rats （Mean±SD. n=6）

2 肺組織病理變化

光鏡觀察HE 染色切片，正常組肺組織結構較完整，肺泡腔較清晰，炎癥細胞浸潤不明顯；二氧化硅混懸液暴露后第7 天，模型組肺組織中可見大量炎癥細胞，肺泡結構被破壞，肺泡隔明顯增厚，出現孤立的巨噬細胞吞噬二氧化硅顆粒物形成的細胞性結節，見圖1。上述結果提示，二氧化硅混懸液暴露能成功建立大鼠二氧化硅致急性肺損傷模型。

Figure1. Pathological changes of rat lung tissues （HE staining，×200）.圖1 大鼠肺組織HE染色病理結果

3 肺組織NLRP3和GSDMD蛋白表達

與正常組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3 和GSDMD 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），見圖2及表2。

Figure 2. Expression of NLRP3 and GSDMD in rat lung tissues（immunohistochemical staining， ×200）.圖2 肺組織中NLRP3和GSDMD蛋白表達水平

表2 各組大鼠肺組織中NLRP3和GSDMD的平均吸光度Table 2. Average absorbance values of NLRP3 and GSDMD in rat lung tissues （Mean±SD. n=4）

4 血清中IL-1β、IL-18和TNF-α含量

ELISA 結果顯示，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-18 和TNF-α 含 量 顯 著 高 于 正 常 組（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥細胞因子水平的比較Table 3. Comparison of serum levels of inflammatory cytokines in rats （ng/L. Mean±SD. n=4）

5 OTU聚類分析

16S rRNA 基因測序后，獲得5 413 條有效序列。其中，正常組特有101 個OTU，模型組特有92 個OTU，二者共有266個OTU。

6 肺部菌群物種分布（微生物群落結構分析）

6.1 門（phylum）水平分布結果 在門水平，與正常組對比，模型組5 大菌門，變形菌門（Proteobacteria；20.30%）相對豐度降低，而擬桿菌門（Bacteroidota；19.53%）、厚壁菌門（Firmicutes； 12.85%）、疣微菌門（Verrucomicrobiota； 8.25%）和藍菌門（Cyanobacteria； 5.04%）相對豐度升高，見圖3A。

Figure 3. Relative abundance of rat lung flora at the phylum and genus levels. A： phylum level； B： genus level.圖3 大鼠肺部菌群在門和屬水平的相對豐度

6.2 屬（genus）水平分布結果 在屬水平，正常組優勢菌群為嚙齒桿菌屬（Rodentibacter； 20.57%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus； 5.15%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（2.93%）、阿克曼氏菌屬（Akkermansia； 2.86%）、Methylobacterium-Methylorubrum（2.58%）、假單胞菌屬（Pseudomonas； 1.70%）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium； 0.23%），而模型組優勢 菌群為Akkermansia（5.37%）、Methylobacterium-Methylorubrum（4.67%）、Pseudomonas（1.70%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（1.67%）和Bifidobacterium（1.22%），見圖3B。

7 肺部菌群的Alpha多樣性分析

正常組與模型組大鼠肺部菌群的Shannon 多樣性指數稀釋曲線分析（圖4）顯示，稀釋曲線在小于500 條測序序列時，Shannon 指數隨著序列增加而迅速增加，大于500 后Shannon 指數隨著序列增加趨向平緩，步入平臺期，本次序列樣本數量都多于5 000，說明測序數據量大到可全面反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息，可以進行進一步分析。

Figure 4. Shannon-Wiener rarefaction curves.圖4 Shannon指數稀釋曲線圖

主要的Alpha 多樣性指數有5 類：Simpson、Shannon、ACE、Chao1 和Coverage。這些指數分析OTU 信息，評估豐富度、多樣性和測序深度：Simpson 值小、Shannon 值大表示多樣性高；Chao1 和ACE 指數數值大表示物種豐富度越高；Coverage 評估覆蓋率，接近1表示符合真實情況。表4為各組樣本的Alpha 多樣性指數[5］。經Alpha 多樣性分析，模型組ACE 指數和Chao1 指數降低，Simpson 指數和Shannon 指數升高，但與正常組相比均無顯著差異，表明兩組大鼠肺部菌群豐富度無顯著差異。

表4 大鼠肺部菌群的Alpha多樣性指數Table 4. Alpha diversity of the lung microbiota in each group （Mean±SD. n=4）

8 肺部菌群的Beta多樣性分析

Beta 多樣性分析主要用于量化樣本間微生物群落的差異程度。非度量多維尺度分析（non-metric multi-dimensional scaling， NMDS）是評估Beta 多樣性的方法之一[6］，它以點形式將樣本物種信息在多維空間展示，通過計算點間距離反映樣本間差異程度，距離越近，微生物群落構成越相似。正常組和模型組各有1 個離散樣本，其余樣品點集中，表明組內肺部菌群構成相似，見圖5。

Figure 5. Beta diversity of the lung microbiota in each group （n=4）. NMDS： non-metric multi-dimensional scaling.圖5 大鼠肺部菌群的Beta多樣性分析

9 組間差異物種的篩選

LEfSe 使用LDA 評估每個組分豐度對差異效果的影響，找出劃分樣品差異的群落或物種。LEfSe 分析軟件常用于篩選差異有統計學意義的標志物，當物種LDA score 大于預設值（如LDA score＞3）時，被認定為差異物種。差異物種進化分支圖展示分類級別和物種豐度，差異物種根據其不同組別著色。模型組豐度增加的菌群為雙歧桿菌（Bifidobacterium）、Clostridiumsensu stricto 1、副薩特氏菌（Parasutterella）和Ellin6067 屬，正常組豐度增加的菌群是嚙齒桿菌（Rodentibacter）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、鏈球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）和鷗桿菌（Laribacter），見圖6。

Figure 6. Linear discriminant analysis （LDA） effect size （LEfSe） difference analysis. A： histogram of LDA scores； B： cladogram.圖6 LEfSe差異分析結果

10 肺部菌群相對豐度與肺組織NLRP3和GSDMD及血清IL-1β和TNF-α水平的相關性分析

Spearman 相關性分析結果顯示，肺部菌群中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和副薩特氏菌屬（Parasutterella）豐度與NLRP3、GSDMD、TNF-α 和IL-1β 水平均呈顯著正相關（P＜0.05）；Clostridiumsensu stricto 1豐度與TNF-α、IL-1β 和GSDMD 水平呈顯著正相關（P＜0.05）；鏈球菌屬（Streptococcus）和嚙齒桿菌屬（Rodentibacter）豐度與NLRP3、GSDMD 和TNF-α 水平均呈顯著負相關（P＜0.05），見表5。

表5 肺部菌群的相關性分析Table 5. Correlation analysis of relative abundance of lung microbiota linked to serum TNF-α and IL-1β levels， and lung NLRP3 and GSDMD levels

討 論

根據呼吸道的一些特性，如pH 值、溫度和營養物質對微生物生長的不利影響，一般認為正常的肺部不應存在細菌。然而，呼吸系統中確實存在微生物。首先，肺臟是直接與外界環境相通的器官，在呼吸過程中不斷將空氣中的微生物吸入肺內。其次，下呼吸道具有溫暖和濕潤的環境，非常適宜微生物的停留和生長?；谶@兩點，已有矽肺早期模型小鼠的肺泡灌洗液菌群的研究[7］，也有矽肺模型小鼠的腸道菌群的研究[8］，本研究是針對二氧化硅所致急性肺損傷的肺組織菌群的研究，相較于腸道菌群，肺部菌群能精準體現肺損傷情況；相較于肺泡灌洗液，肺組織能更全面體現肺部菌群的變化。

肺微生態的破壞可以誘發炎癥細胞活化，多種炎癥因子被釋放，進一步加重肺組織的損傷[9］。本研究結果顯示，二氧化硅所致急性肺損傷模型大鼠與健康大鼠的肺微生態存在顯著差異，說明二氧化硅急性暴露可引起肺部菌群的結構發生改變。雙歧桿菌（Bifidobacterium）、副薩特氏菌（Parasutterella）和Clostridiumsensu stricto 1 在模型組大鼠的相對豐度較正常組增加，可能作為不良反應的標志物。

副薩特氏菌（Parasutterella）在腸道內是一種與人體活化脂肪酸合成途徑有關的菌群，可能通過參與維持膽汁酸體內平衡和膽固醇代謝而有助于小腸降解和吸收食物中的脂肪[10-11］；也有研究發現誘發的肺癌患者的腸道菌群中富集Parasutterella[12-13］。關于Clostridiumsensu stricto 1的研究不多，文獻顯示糖尿病模型大鼠中Clostridiumsensu stricto 1 在糞便樣品中大量富集[14］。本研究中首次發現二氧化硅所致急性肺損傷模型大鼠肺組織內有這兩類菌群大量富集。

腸道菌群的相關研究大多認為雙歧桿菌（Bifidobacterium）能產生短鏈脂肪酸，是有益菌[15］。然而，在肺部菌群的臨床研究發現Bifidobacterium是輻射誘發的肺癌患者肺活檢組織微生物組的標志菌群之一[16］；膿毒癥肺外感染導致急性呼吸窘迫綜合征患者的支氣管肺泡灌洗液中Bifidobacterium的陽性檢出率顯著升高[17］。肺部菌群與腸道菌群的研究結論相悖，原因可能是：肺部與腸道微生物群是兩個截然不同的生態系統，其生態功能也存在顯著差異。腸道腔內形成了密集的細菌群落，而肺部的微生物群落則相對稀疏且與黏膜表面緊密相關。肺部菌群的特性取決于遷移（通過微呼吸和黏膜擴散）和消除（通過咳嗽和黏液纖毛清除）的相對平衡?？傊?，益生菌Bifidobacterium可能對宿主免疫系統產生負面影響，促進二氧化硅致急性肺損傷的發生和惡化。

TNF-α、IL-1β 和IL-18 作為經典的促炎細胞因子，多項研究表明TNF-α、IL-1β 和IL-18 在二氧化硅致急性肺損傷的表達高低與二氧化硅致急性肺損傷的炎癥反應密切相關[18-19］?？赏ㄟ^活化NLRP3 炎癥小體，促進釋放炎癥因子IL-1β 和IL-18，激活細胞焦亡，進而加重炎癥反應[20-21］。本研究結果顯示二氧化硅暴露模型組的NLRP3、GSDMD、IL-18 和IL-1β 表達水平均顯著高于正常組，說明模型組二氧化硅致急性肺損傷的炎癥形成和NLRP3、GSDMD 蛋白的表達及炎癥因子TNF-α、IL-1β 的表達密切相關。這提示NLRP3、GSDMD、TNF-α 和IL-1β 表達水平的升高可能是二氧化硅致急性肺損傷的重要致病機制之一。

綜上所述，肺部菌群的變化、炎癥程度升高可能是發病的內在致病機理。模型組和正常組的差異優勢菌群可能是其菌群標志。二氧化硅顆粒物入肺，被肺巨噬細胞吞噬，產生炎癥反應，使得肺上皮屏障功能被破壞，影響肺部菌群變化，肺部菌群又可以通過放大肺部和全身炎癥來促進二氧化硅所致急性肺損傷的發展。為進一步深入研究，課題組后續將擴大樣本數量，基于炎癥和菌群的變化進行深入的系統研究。