川陳皮素對單純性肥胖癥大鼠腸道菌群和短鏈脂肪酸的影響*

咼 燕， 鄭近園▲， 張 佳， 庹余興， 張夢蘋， 劉 霞△

（1重慶三峽醫藥高等?？茖W校，重慶 404120；2長江師范學院，重慶 408100）

近年來，由于人們飲食習慣的改變以及缺乏鍛煉等因素，全球肥胖患病率顯著上升[1］。肥胖是誘發高血壓、糖尿病、脂肪肝和腦卒中等疾病的重要原因[2］。目前，治療肥胖癥的方式主要包括飲食控制[3］、藥物治療[4］及手術治療[5］等，但由于飲食控制難以堅持、藥物副作用以及手術風險大等因素，其長期效應難以維持。

川陳皮素（nobiletin，NOB）又稱蜜桔黃素，是從中藥陳皮中提取的一類黃酮類化合物[6］，具有降血脂、降血糖等作用[7］，其在治療肥胖癥方面的效果已被證實[8］，但其具體機制尚不明確。腸道菌群及其代謝產物，如短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）與肥胖癥及相關代謝性疾病的發生發展關系密切[9］。SCFAs 在因肥胖引起的腸道菌群紊亂的情況下會發生相應改變[10-11］，是預防和治療肥胖及相關代謝紊亂的關鍵環節[12］。本項工作以單純性肥胖癥大鼠模型為研究對象，分析NOB 對肥胖癥大鼠腸道菌群、SCFAs及脂質代謝的影響，為NOB 的抗肥胖研究提供參考。

材 料 和 方 法

1 動物

22 只SPF 級SD 雄性大鼠，4 周齡，體質量（150±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司 [許可證號為SCXK（湘）2019-0004］。本課題動物實驗經重慶三峽醫藥高等?？茖W校生物醫學倫理委員會批準，倫理審查批號為：SYYZ-A-2211-0001。實驗動物飼養于重慶三峽醫藥高等?？茖W校實驗動物中心，溫度24～26 ℃，相對濕度50%～60%，光暗周期為12 h，適應性喂養1周后開始實驗。

2 主要試劑及儀器

川陳皮素（成都德思特生物技術有限公司）；低脂飼料及高脂飼料（Research Diet）。全自動生化分析儀（山東博科生物產業有限公司）；PCR 儀（Biorad）；凝膠成像儀（Tanon）；全自動樣品快速研磨儀（上海萬柏生物科技有限公司）；高靈敏質譜儀（AB Sciex）；超高效液相色譜儀（日本島津公司）。

3 造模、分組及給藥

22 只SD 大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為對照組（6 只）和模型組（16 只），對照組予以低脂飼料喂養，模型組予以高脂飼料喂養。以高脂飼料組大鼠體質量超過低脂飼料組大鼠平均體質量的20%為成模標準[13］。將造模成功的12 只大鼠隨機分為模型組和川陳皮素組，每組各6 只。對照組、模型組給予同體積生理鹽水，川陳皮素組給予100 mg/kg NOB 懸浮液灌胃[14］，每天1次，連續給藥21 d，隔天記錄各組大鼠體質量。

4 標本采集與檢測方法

4.1 各組大鼠血脂水平檢測 禁食不禁水12 h 后用2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）進行麻醉，腹主動脈采血，954 ×g離心15 min，取血清。采取臨床全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。

4.2 肝臟、脂肪組織病理學檢查 腹主動脈取血后，迅速分離出肝臟和腎周脂肪組織，用PBS 沖洗后濾紙吸干水分，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規包埋、切片后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-Eosin，HE）染色，用光學顯微鏡觀察并拍照記錄。

4.3 腸道菌群16s rRNA 高通量測序 末次給藥后采用逼迫法令其應激排便，采集1 粒糞便樣本于無菌凍存管中后置于液氮中猝滅。檢測由上海歐易生物醫學實驗室完成。測序分析過程如下：（1）DNA 抽提和PCR 擴增：采用MagPure Soil DNA LQ Kit（Magan）試劑盒，按照其說明書提取糞便菌群總基因組DNA。以提取的基因組 DNA 為模板，使用帶 Barcode 的特異引物和Takara Ex Taq 高保真酶進行細菌16S rRNA基因的PCR擴增。采用通用引物343F （5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’）和798R（5’-AGGGTATCTAATCCT-3’）擴增16S rRNA 基因的V3-V4 可變區，用于細菌多樣性分析；（2）文庫構建和測序：PCR 擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后使用AMPure XP beads 磁珠純化，純化后作為二輪PCR 模板，并進行二輪 PCR 擴增。并再次使用磁珠純化，取純化過的二輪產物進行Qubit定量，然后調整濃度進行測序。使用Illumina NovaSeq 6000 測序平臺進行測序，并生成250 bp雙端reads；（3）生物信息學分析：使用Cutadapt 軟件，將raw data 序列剪切掉引物序列。然后使用DADA2，將合格的雙端raw data 按照QIIME 2默認參數進行質控分析，得到代表序列及ASV豐度表格。使用QIIME 2 軟件包挑選出各個ASV 的代表序列后，并將所有代表序列與Silva（version138）數據庫進行比對注釋。物種比對注釋使用q2-feature-classifier 軟件默認參數進行分析。采用QIIME2軟件進行α 和β 多樣性分析?；赗 包，采用ANOVA統計算法，進行差異分析。

4.4 短鏈脂肪酸含量檢測 以同上方法采集大鼠糞便1 粒，大鼠糞便經過研磨、提純、富集、純化等樣本預處理后，采用LC-MS分析方法，對目標代謝物進行定性定量檢測，色譜條件：進樣量：1μL；流速：0.4 mL/min；流動相：A（0.1%甲酸-水溶液），B（乙腈/甲醇=2：1）；梯度洗脫方法（Gradient Elution Procedures）：0 min A/B（80：20，V/V），2 min A/B（80：20，V/V），8min A/B（60：40，V/V），8.1min A/B（5：95，V/V），9.5 min A/B（5：95，V/V），9.6 min A/B（80：20，V/V），10 min A/B（80：20，V/V）。質譜條件：氣簾氣：35（psi）；碰撞誘導電離（collision-activated dissociation，CAD）參數：medium；負離子噴霧電壓：-4500V；離子源溫度：450 ℃；柱溫：40 ℃；噴霧氣（Gas1）：50（psi）；輔助加熱氣（Gas2）：50（psi）。代謝物定量利用三重四極桿質譜的多反應檢測（MRM）模式進行分析。獲得不同樣本的質譜分析數據，對所有的色譜峰進行峰面積積分，并對其中同一物質在不同樣本中的色譜峰進行積分校正。

5 統計學處理

采用SPSS 27.0軟件進行統計學分析，數據均以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較進行單因素方差分析；方差齊用LSD 分析，方差不齊用Dunnet T3分析，以P＜0.05定義為差異有顯著性。

結 果

1 各組大鼠體質量和攝食量比較

如圖1A 所示，給藥前，與對照組比較，模型組和川陳皮素組體質量均顯著升高（P＜0.01），模型組與川陳皮素組間體質量無統計學差異；給藥后，與模型組比較，川陳皮素組體質量顯著降低（P＜0.05）。圖1B 可見與模型組比較，川陳皮素組大鼠攝食量減少。

Figure 1. Comparison of body weight （A） and food intake （B） before and after intervention among groups. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vsCON group； #P＜0.05 vs HFD group.圖1 各組大鼠干預前后體質量和攝食量比較

2 各組大鼠脂肪組織病理學分析

對照組大鼠脂肪組織細胞在單個視野下呈現細胞直徑小、數量多并且形態正常；與對照組比較，模型組脂肪組織細胞直徑增大。干預后，與模型組比較，川陳皮素組脂肪細胞直徑顯著變?。▓D2）。

Figure 2. Comparison of histopathology of adipose tissue in each group. Compared with the control group， the diameter of adipocytes in the model group was significantly increased. After the treatment， the diameter of adipocytes in the NOB group was significantly decreased.圖2 各組大鼠脂肪組織病理形態學比較

3 各組大鼠肝臟組織病理形態學分析

與對照組相比，模型組大鼠可見明顯的肝細胞空泡化現象，空泡面積較大且數量較多，伴有細胞脂肪變性和炎癥反應。經NOB 干預后，肝細胞空泡化現象較少，炎癥浸潤現象得到顯著改善（圖3）。

Figure 3. Comparison of histopathology of liver tissue in each group. Black arrow： inflammatory infiltration； Red arrow： lipid droplets. Scale bar=100 μm. Compared with the control group， there were a large number of lipid droplets in the liver of the model group rats， accompanied by inflammatory infiltration. Compared with the model group， there were only a small amount of lipid droplets in the liver of the NOB group， and the inflammatory infiltration was significantly improved.圖3 各組大鼠肝臟組織病理形態學比較

4 NOB對肥胖癥大鼠血清血脂的影響

如表1所示，與對照組相比，模型組大鼠的TG和TC 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，經NOB干預后，大鼠的TG 和TC 水平顯著降低（P＜0.05）。各組間HDL-C和LDL-C無顯著差異。

表1 NOB對肥胖癥大鼠血清血脂的影響Table 1. Effects of NOB on serum lipid in obese rats （mmol/L. Mean±SD. n=6）

5 各組大鼠腸道菌群變化

5.1 各組大鼠腸道菌群的物種注釋 花瓣圖用于分析各樣品之間所特有、共有的ASVs 個數，如圖4A所示，通過高通量測序共得到890個ASVs，樣本間共有ASVs 28 個。Venn 圖可用于直觀表現樣本的ASVs 數目及各組重疊情況，如圖4B 所示，對照組獨有277個ASVs，模型組獨有174個ASVs，川陳皮素組獨有211 個ASVs。經鑒定分別屬于16 個門和168 個屬。該結果表明各組大鼠腸道菌群結構存在一定的差異，但又有一定的相似。

Figure 4. Petal diagram （A） and Venn diagram （B） of ASV distribution of gut microbiota. CON： control group； HFD： model group；NOB： NOB group. n=6.圖4 腸道菌群ASV分布花瓣圖和Venn圖

5.2 各組大鼠腸道菌群α 多樣性分析 稀釋曲線隨著抽取序列數的增加而趨于平緩，說明樣本測序量合理（圖5A）。通過Simpson 指數分析，對照組、模型組和川陳皮素組之間的物種豐富度和多樣性無顯著差異（P＞0.05）（圖5B）。

Figure 5. α diversity analysis of gut microbiota in each group. A： rarefaction curve； B： simpson index. CON： control group； HFD：model group； NOB： NOB group. Mean±SD. n=6.圖5 各組大鼠腸道菌群α多樣性分析

5.3 各組大鼠腸道菌群β 多樣性分析 主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）可觀察出不同樣品間群落組成的差異和距離。對照組明顯區別于模型組和川陳皮素組，模型組與川陳皮素組雖有重合，但也有部分區域分開（圖6）。

Figure 6. PCoA analysis of gut microbiota in each group. CON：control group； HFD： model group； NOB： NOB group. n=6.圖6 各組大鼠腸道菌群PCoA分析

5.4 各組大鼠腸道菌群物種組成及差異分析

5.4.1 門水平物種組成及差異分析 在門水平上，各組大鼠腸道菌群的優勢物種主要為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）和螺旋體菌門（Spirochaetota）等。其中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度占比95%以上，脫硫桿菌門次之。與對照組比較，模型組厚壁菌門相對豐度顯著上升，擬桿菌門顯著下降（P＜0.05）；相對于模型組，川陳皮素組厚壁菌門相對豐度減小，而擬桿菌門增加（P＜0.05）（圖7）。

Figure 7. Relative abundance of gut microbiota at the level of phylum. CON： control group； HFD： model group； NOB： NOB group.n=6.圖7 門水平物種組成及差異分析

5.4.2 屬水平物種組成及差異分析 在屬水平上，各組大鼠主要的優勢菌種有：瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、Muribaculaceae屬、Lachnospiraceae-NK4A136-group屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、經黏液真桿菌屬（Blautia）、羅氏菌屬（Roseburia）、大腸桿菌屬（Colidextribacter）、Clostridia-UGG-014屬、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、糞球菌屬（Coprococcus）等。與對照組相比，模型組擬桿菌屬、乳桿菌屬、經黏液真桿菌屬顯著下降（P＜0.05），大腸桿菌屬顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，川陳皮素組以上菌屬均出現回調（圖8）。

Figure 8. Relative abundance of gut microbiota at the level of genus. CON： control group； HFD： model group； NOB： NOB group. n=6.圖8 屬水平物種組成及差異分析

5.5 各組大鼠糞便SCFAs 的變化 與對照組相比，模型組中的丙酸和丁酸水平出現下降；與模型組比較，川陳皮素組的丙酸和丁酸出現顯著上升（P＜0.05），見圖9。

Figure 9. Alterations in SCFAs in each group. CON： control group； HFD： model group； NOB： NOB group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs CON group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs HFD group.圖9 各組大鼠糞便SCFAs的變化

討 論

肥胖是由于脂肪細胞體積增大和數量增多引起脂肪組織異?；蜻^度的堆積而導致的一種慢性代謝性疾病，對健康造成嚴重威脅[12，15］。近年來，許多研究結果表明，腸道菌群的結構、功能和多樣性的改變在肥胖的發生和進展中起著關鍵作用[16-17］，肥胖者和非肥胖者腸道菌群的結構組成存在著明顯差異[18］。本研究主要探討NOB對單純性肥胖癥大鼠腸道菌群及其產物SCFAs和脂質代謝的影響。

目前對于肥胖癥腸道菌群α 多樣性分析的結果不完全一致，有研究顯示肥胖小鼠腸道菌群α 多樣性指數顯著下降[19-20］，也有研究表明肥胖個體腸道菌群與健康個體無顯著差異[21-22］。在本研究中，各組大鼠的α 多樣性指數無顯著性差異，但在門和屬水平上是存在差異的，經過NOB 的干預后又可將紊亂的腸道菌群進行回調。在門水平上，人體腸道菌群中最豐富的兩個菌門為厚壁菌門和擬桿菌門。厚壁菌門與擬桿菌門比值變化可作為肥胖診斷的生物標記物[23］，肥胖人群其比值增加。本研究中，與對照組相比，模型組厚壁菌門相對豐度顯著上升，擬桿菌門顯著下降，厚壁菌門與擬桿菌門比值增加，這與孫程遠等[12］研究結果一致。經過NOB 的干預后，厚壁菌門豐度顯著下降，擬桿菌門顯著上升，厚壁菌與擬桿菌比值下降。在屬水平上，擬桿菌屬是有益菌，參與三羧酸循環產生丙酸[24］。研究表明，擬桿菌屬可增強棕色脂肪中的支鏈氨基酸分解代謝，從而防止肥胖[25］。在正常飲食的情況下補充乳酸桿菌可以降低TC和TG，參與脂質代謝[26］。經黏液真桿菌屬則可通過產生細菌素來防止病原體的定植，并通過上調調節性T 細胞和SCFAs 而表現出抗炎特性[27］。在本研究中，與對照組相比，模型組擬桿菌屬、乳桿菌屬、經黏液真桿菌屬顯著下降，而大腸桿菌屬則出現顯著升高。經NOB 干預后，以上菌屬均有一定的回調。由此推斷，NOB 可能通過提高有益菌、降低有害菌的豐度改善肥胖癥大鼠的腸道菌群紊亂。

SCFAs 是腸道菌群的代謝產物，主要由乙酸、丙酸和丁酸組成[28］，其中擬桿菌主要產生乙酸和丙酸，而厚壁菌主要產生丁酸[29］。SCFAs 不僅能為菌群提供能量，還可以調控脂質代謝。丙酸可通過多種途徑來促進能量消耗和抑制食欲，從而影響肥胖的發生發展[11］；丁酸通過激活G 蛋白偶聯受體（G proteincoupled receptor， GPR）43 和41 的表達，進而改善肝臟脂肪變性、脂質代謝異常從而延緩肥胖的進程[30］。在本研究中，模型組中的丙酸和丁酸水平顯著下降，經NOB 干預后丙酸和丁酸水平顯著增加，且血液中TC 和TG 含量以及肝臟的脂肪變性在NOB 干預后得到改善，由此推測NOB 治療肥胖癥的機制可能與回調腸道菌群產物SCFAs的含量，改善脂質代謝有關。

綜上所述，經NOB 干預可降低肥胖癥大鼠體質量，其發揮抗肥胖的作用可能與調節大鼠腸道菌群的結構和SCFAs 的含量，從而調節脂質代謝紊亂有關，為臨床應用提供了實驗依據。