外周血EETs水平與咳嗽變異性哮喘患兒Th1和Th2及其細胞因子、小氣道功能的相關性分析

蔣萍影,唐國英

(重慶市開州區人民醫院兒科,重慶 405400)

小兒咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)是一種特殊類型的哮喘,以咳嗽為唯一或主要臨床表現,對支氣管擴張劑治療有反應,具有氣道高反應、嗜酸性粒細胞炎癥和氣道重塑等經典哮喘特征,CVA患兒往往反復咳嗽發作,部分患兒最終進展為典型哮喘[1]。嗜酸性粒細胞(eosinophil,EOS)參與感染誘導的免疫應答,參與免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介導的Ⅰ型超敏反應過程,EOS氣道炎癥可增加CVA小氣道功能障礙[2]。嗜酸性粒細胞胞外誘捕網(eosinophil extracellular traps,EETs)是EOS以彈射器形式釋放的線粒體、細胞核內DNA、組蛋白及游離顆粒組成的網狀結構,具有免疫調節和促炎作用,可促進氣道高分泌和炎癥反應,在哮喘、變應性支氣管肺曲霉病、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系統疾病中發揮重要作用[3]。EETs與CVA相關性的報道十分少見,其臨床意義尚不清楚。本研究擬探討EETs與CVA的免疫功能、炎癥因子及小氣道功能的關系,以期為臨床CVA的診治提供參考依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年10月至2022年10月重慶市開州區人民醫院收治的95例CVA患兒為CVA組,其中男51例(53.68%),女44例(46.32%);年齡為5～12歲,平均(9.12±2.09)歲。

納入標準:①符合《咳嗽的診斷與治療指南(2015)》[4];②近期無呼吸道感染史及激素、免疫抑制劑應用史;③年齡在5歲以上,能配合小氣道功能檢測;④患兒家屬或監護人均知情同意,并簽署同意書。排除標準:①合并支氣管炎、支氣管擴張、肺癌、囊性纖維化或肺炎等其它肺部疾病;②合并上氣道咳嗽綜合征、嗜酸性支氣管炎和胃食管反流相關咳嗽;③合并心、肝、腎等重要器官功能障礙;④合并惡性腫瘤。

另選取同期于本院兒科保健門診體檢的67例健康兒童為對照組,均排除近2周內感染、免疫缺陷及系統性疾病,其中男39例(58.21%),女28例(41.79%);年齡為5～12歲,平均(9.37±2.21)歲。

CVA組與對照組的性別、年齡比較差異均無統計學意義(χ2=0.732、t=0.326,P>0.05)。

本研究已經獲得重慶市開州區人民醫院醫學倫理委員會批準(編號:2019Z210)。

1.2 方法

1.2.1 CVA的診斷標準

①刺激性干咳,清晨或夜間發作;②支氣管激發試驗(bronchial provocation test,BPT)陽性或最大呼氣峰流速(peak expiratory flow,PEF)平均變異率>10%或支氣管舒張試驗陽性;③抗哮喘治療有效[4]。

1.2.2 EETs的檢測

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當日),均于次日晨采集外周靜脈血5mL,注入含檸檬酸-葡萄糖溶液的Vacutainer?真空采血管(美國BD公司)中,以密度梯度離心法(挪威Axis-Shield公司生產的LymphoprepTM密度梯度離心液,20℃,879×g離心25min)分離外周血單個核細胞,再采用EOS分離試劑盒和免疫磁珠細胞分選(magnetic activated cell sorting,MACS)(美國Miltenyi Biotec公司),從中分離EOS。取外周血EOS(1×106)樣本,將EOS維持在無血清RPMI-1640培養基(美國Thermo Fisher Scientific)中,用1mg地塞米松(美國Sigma-Aldrich公司)、10mg羥氯喹(美國Sigma-Aldrich公司)或1μg/mL的n-乙酰-l-半胱氨酸(美國Sigma-Aldrich公司)預處理15min。采用25ng/mL的人重組白細胞介素(interleukin,IL)-5(美國Sigma-Aldrich公司)引發20min,并用0.3μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美國Sigma-Aldrich公司)刺激3h,以誘導EET。使用Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA試劑盒(美國Invitrogen公司)測量DNA濃度,以QuantiPro BCA Assay Ki(美國Sigma-Aldrich公司)評估蛋白質濃度,以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚和抗促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)抗體(美國Cell Signaling公司)對細胞進行染色,用Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss AG公司)觀察形成EETs的EOS,計算形成EETs的EOS百分比,并以%表示。

1.2.3輔助性T淋巴細胞1和輔助性T淋巴細胞2的檢測

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當日),均于次日晨采集外周靜脈血2mL,以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌2次,將細胞懸浮在RPMI 1640培養基(美國Sigma-Aldrich)中,37℃孵育4h,加入50μL乙二胺四乙酸渦旋,室溫下孵育15min,加入5mL FACS Permeabilizing Solution(美國BD Biosciences),去離子水以1∶10比例稀釋,渦旋并孵育10min,250×g離心10min,加入7mL Cell Wash洗滌棄上清,再次洗滌棄上清,平均注入2個流式管中,分別加入20μL干擾素(interferon,IFN)-γ PE(美國Biolegend)、5μL IL-10 PE-Cy7(美國Biolegend),4℃避光孵育30min,PermWash緩沖液重復洗滌2次,加入450μL的PBS重懸細胞,用Attune NxT流式細胞儀(美國賽默飛公司)檢測輔助性T淋巴細胞(Th)1和Th2細胞百分比,計算Th1/Th2比值。

1.2.4 Th1和Th2細胞因子的檢測

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當日),均于次日晨采集外周靜脈血2mL,注入干燥試管,待血液自然凝固后取上層液離心(37℃,650×g離心5min)分離血清,采用WX-SY96A酶標儀(山東萬象環境科技有限公司),應用酶聯免疫吸附試驗檢測Th1(血清IL-2、IFN-γ)和Th2(血清IL-4、IL-6)細胞因子水平,試劑盒購自上海酶聯生物公司。

1.2.5小氣道功能的評估

所有CVA患兒入組后(對照組于門診當日),采用FGY-200便攜式肺功能檢測儀(濟南泰醫生物技術有限公司)測定小氣道功能,檢測過程中指導患兒用力吸氣后盡力呼出最大量氣體,記錄25%、50%、75%肺活量的最大呼氣量(FEF25%、FEF50%、FEF75%),以及最大中期呼氣流速(FEF25%～FEF75%),測量3次,取平均值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組外周血形成EETs的EOS百分比水平比較

CVA組外周血形成EETs的EOS百分比為(20.35±6.09)%,對照組為(6.32±1.28)%,CVA組外周血形成EETs的EOS百分比明顯高于對照組,經比較差異有統計學意義(t=18.554,P<0.05)。

2.2 兩組Th1和Th2細胞占比及比值比較

CVA組Th2細胞占比明顯高于對照組(P<0.05),Th1細胞占比、Th1/Th2比值均明顯低于對照組,經比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組Th1、Th2細胞占比及Th1/Th2比值的比較

2.3 兩組Th1和Th2細胞因子水平比較

CVA組血清IL-4、IL-6水平均明顯高于對照組,血清IL-2、IFN-γ水平均明顯低于對照組,經比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組Th1和Th2細胞因子水平的比較

2.4 兩組小氣道功能比較

CVA組FEF25%、FEF50%、FEF75%,以及FEF25%～FEF75%均明顯低于對照組,經比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組小氣道功能各指標的比較

2.5 外周血形成EETs的EOS百分比與Th1和Th2及其細胞因子和小氣道功能的相關性分析

CVA組外周血形成EETs的EOS百分比與Th2細胞占比及血清IL-4水平和血清IL-6水平均呈正相關(r值分別為0.532、0.421、0.395,P<0.05),與Th1細胞占比、Th1/Th2比值、血清IL-2水平、血清IFN-γ水平、FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～FEF75%均呈負相關(r值分別為-0.253、-0.605、-0.321、-0.385、-0.421、-0.377、 -0.485、 -0.568,P<0.05)。

2.6 外周血形成EETs的EOS百分比診斷CVA的價值分析

經ROC分析結果顯示,外周血形成EETs的EOS百分比診斷CVA的臨界值為15.42%,曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.760(95%CI:0.687～0.824),靈敏度為78.95%(75/95),特異度為77.61%(52/67),約登指數為0.566,見圖1。

3 討論

3.1 EETs與CVA發病有關

CVA是導致慢性咳嗽的最主要原因,好發于學齡前期和學齡期兒童,由于缺乏典型的喘息、氣促等哮喘癥狀或體征,臨床上難以與支氣管炎或呼吸道感染鑒別,該病主要臨床表現為陣發性夜間咳嗽,不伴喘鳴,通過激素治療可緩解咳嗽癥狀[5-6]。EOS來自骨髓造血干細胞,含有大量細胞內顆粒,這些顆?？苫罨行粤＜毎头蚀蠹毎?增強Th2免疫應答,在氣道高反應性和組織重塑中起重要作用[7]。已知EOS可通過胞吐、脫顆粒、細胞溶解方式釋放次級顆粒。近年來研究發現,除上述方式外,EOS還可以彈出載有特定EOS顆粒蛋白的線粒體DNA,或釋放富含染色質的細胞外誘捕網,這一過程稱為EOS誘捕網的形成(eosinophil extracellular trap cell death,EETosis),這一網狀結構被稱為EETs[8]。EETs是一種DNA纖維和細胞毒性顆粒蛋白組成的復雜網狀結構,內包含分泌性嗜酸性粒細胞顆粒,在EOS死亡后可繼續提供免疫調節、促炎和其他免疫致病刺激,DNA纖維則可吞噬體型較大寄生蟲,增加氣道分泌物黏性,DNA骨架上聚集大量分泌型顆粒,不易被巨噬細胞清除,EETs外層包裹組蛋白分子,不易被內源性蛋白酶消化,可穩定存活7d[9]。自2008年Yousefi等[10]首次發現克羅恩病患者腸黏膜中存在EETs以來,已有多數研究證實EETs與哮喘[11]、變應性支氣管肺曲霉病[12]、慢性阻塞性肺疾病[13]等多種慢性氣道疾病也存在密切關聯。本研究發現,CVA組患兒外周血形成EETs的EOS百分比明顯高于對照組,說明EETs可能也參與了CVA的發病過程。

3.2 EETs與CVA患兒Th1/Th2比值失衡有關

本研究顯示,外周血形成EETs的EOS百分比與Th2細胞占比及血清IL-4、IL-6水平均呈正相關,與Th1細胞占比、Th1/Th2比值、IL-2、IFN-γ均呈負相關,表明外周血EETs的形成與CVA患兒Th1/Th2比值失衡、Th2過度活化介導的炎癥反應有關。免疫失調與炎癥反應是CVA發病的主要基礎,Th反應失衡,使以Th2為主的免疫反應介導的細胞因子分泌增多,啟動了免疫級聯激活反應,導致IgE產生的增加,促進了EOS生長分化,氣道黏液分泌物增加,誘發氣道炎癥反應,進而促使CVA發生和進展[14]。EETs可通過卷曲螺旋結構域25-整合素連接激酶-蛋白激酶Cα-CRTC1通路激活肺神經內分泌細胞,肺神經內分泌細胞通過神經肽和神經遞質放大過敏性免疫反應,增加杯狀細胞增生、黏液產生、炎癥細胞浸潤和Th2型細胞因子表達[11]。EETs還可引發不受控制的中性粒細胞誘捕網形成,間接促使呼吸道炎癥性損傷[13]。

3.3 EETs與CVA患兒小氣道功能下降有關

本研究顯示,形成EETs的EOS百分比與FEF25%、FEF50%、FEF75%、FEF25%～FEF75%均呈負相關,表明外周血EETs的形成與CVA患兒小氣道受損有關。EETs會誘導有毒顆粒蛋白釋放和與損傷相關的分子模式激活,促使氣道上皮損傷,降低黏液清除率[12]。EETs的DNA骨架可增加氣道局部分泌物黏稠度,導致支氣管阻塞和小氣道功能障礙[15]。EETs參與CVA小氣道損傷也可能通過介導Th1/Th2比值失衡,引起Th2過度活化和炎癥反應。推測可能的機制為:首先,EETs游離顆粒內含有陽離子蛋白,可誘導氣道上皮細胞脫落,破壞氣道上皮完整性和防御功能,并調節氣道上皮免疫應答,促使炎癥反應[16];其次,EETs可直接刺激氣道上皮細胞釋放IL-33、IL-1α、IL-1β、IL-5等眾多細胞因子,加劇氣道炎癥損傷,同時IL-5可活化EOS,促使EETs釋放,形成相互促進的正反饋通路,加劇氣道炎癥反應[17];再次,EOS含有大量細胞質夏科-萊登晶體(charcot-leyden crystals,CLCs),在EETosis過程中伴隨EETs釋放到外周血中[18],而CLCs可促使Th2細胞分化,誘導Th2型氣道炎癥[19]。由此可見,EETs可能引起Th2介導的炎癥反應,最終導致小氣道損傷和功能障礙。

3.4 EETs鑒別診斷CVA的價值分析

本研究中經ROC曲線分析結果顯示,外周血形成EETs的EOS百分比診斷CVA的AUC為0.760,靈敏度為78.95%,特異度為77.61%,表明EETs在CVA診斷中具有較高的價值,可作為CVA的潛在標志物,對臨床診斷和治療有著積極的意義。

綜上,CVA患者外周血形成EETs的EOS百分比顯著增高,高外周血形成EETs的EOS百分比與CVA患兒Th1/Th2比值失衡、以Th2免疫反應為主的炎癥反應及小氣道損傷有關。EETs有望成為CVA的新標志物,通過抑制EETs的形成可能是治療CVA的一種新方法。