有機物對ANAMMOX性能及微生物影響的研究進展

駱子琛，李星燃，王建芳，，3，4

（1.蘇州科技大學環境科學與工程學院，江蘇蘇州 215009； 2.蘇州科技大學天平學院，江蘇蘇州215009； 3.城市生活污水資源化利用技術國家地方聯合工程實驗室，江蘇蘇州215009；4.江蘇高校水處理技術與材料協同創新中心，江蘇蘇州 215009）

厭氧氨氧化工藝（ANAMMOX）是指在厭氧條件下，厭氧氨氧化菌（AnAOB）以亞硝酸鹽（NO2--N）為電子受體，氧化氨氮（NH4+-N）為氮氣（N2）的一種高效低耗的廢水脫氮工藝〔1〕。迄今為止，全世界建有約兩百多個全規模ANAMMOX處理系統，主要應用于側流高濃度氨氮廢水（如垃圾滲濾液、制藥廢水、污泥消化液等）的處理〔2-4〕。相對于傳統硝化-反硝化工藝，ANAMMOX無需添加外部有機碳源，污泥產量可下降80%～90%〔5〕。然而，ANAMMOX的應用仍然面臨AnAOB增殖時間長、對環境因素（如有機物）敏感度較高等諸多挑戰。

在過去的十年間，研究ANAMMOX的文章以每年約14%的增速增長，其中涉及到有機物影響方面的研究就高達27%〔6〕。有研究表明，過高的有機物含量會通過多種途徑抑制AnAOB的活性，認為高的有機物含量會對AnAOB酶活造成不可逆轉影響，致使細胞失活，進而影響ANAMMOX的性能〔7〕。Zhengzhe ZHANG等〔8〕發現過高的有機物濃度會造成異養細菌大量繁殖，與AnAOB競爭NO2--N，例如Thauera和Denitratisoma更傾向于利用NO2--N作為電子供體〔6〕。然而，更深入的研究發現一定濃度的有機物可對ANAMMOX產生促進作用〔9〕。目前的研究主要集中在有機物對協同體系和單一ANAMMOX體系脫氮性能的影響、不同體系中微生物群落對有機物的影響，這對反應器穩定運行、保持微生物群落之間的平衡至關重要。

筆者論述了有機物類型、濃度對ANAMMOX脫氮體系效能和對功能微生物的影響，并探討了原因，揭示了ANAMMOX系統對有機物的耐受度及有機物對AnAOB的影響機制，優化有機物存在下ANAMMOX系統的脫氮性能，為ANAMMOX工藝工程化應用提供參考。

1 有機物對單一ANAMMOX運行性能及微生物群落的影響

通常認為ANAMMOX是以HCO3-作為無機碳源進行代謝的自養脫氮工藝，HCO3-在900～1 500 mg/L可提高AnAOB的活性〔10-11〕。關于有機物對ANAMMOX系統的影響，國內外學者持有不同的觀點。有研究認為，有機物的存在會對ANAMMOX系統的脫氮效果、微生物群落及活性產生抑制作用〔12〕。但也有研究發現，有機物可參與到ANAMMOX的運行過程中，AnAOB具有代謝有機物的能力〔13〕。

在已發現的6個ANAMMOX屬中，有5個屬的AnAOB可以利用簡單的有機酸〔6〕。Candidatus Jettenia和Candidatus Brocadia均具有代謝乙酸鹽的能力〔14-15〕。部分AnAOB代謝有機物的能力甚至強于異養反硝化細菌〔16〕。

總的來說，有機物的類型、濃度對AnAOB活性有重要影響，筆者將論述有機物類型、濃度對AnAOB活性以及微生物種群競爭的影響。

1.1 低濃度有機物對AnAOB的促進作用及機理

1.1.1 低濃度常規有機物對AnAOB的促進作用

微生物對有機物的利用與有機物類型、分子結構密切相關。污水中各類常規有機物（如甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽和葡萄糖等）對ANAMMOX系統性能均有影響。小分子有機物（甲酸鹽、乙酸鹽）極易被微生物利用，AnAOB易于將乙酸鹽轉化為乙酰輔酶A后固碳〔17〕，最終實現以乙酸鹽為碳源進行代謝（圖1）。在ANAMMOX工藝中，投加少量乙酸鹽（COD＜100 mg/L）會提高AnAOB活性，縮短ANAMMOX啟動時間，提高脫氮性能。Xuejiao YIN等〔18〕發現加入少量乙酸鈉（COD 82 mg/L）可將AnAOB的生長速率提高3倍以上，啟動時間縮短20 d左右。Zhengzhe ZHANG等〔8〕以乙酸鹽作為碳源（COD為84 mg/L），ANAMMOX系統總氮去除率（TNRE）提高，浮霉菌門（Planctomycetes）豐度明顯上升，Candidatus Kuenenia豐度提高6.37%。

圖1 不同碳源代謝途徑機理及競爭抑制原理Fig.1 Mechanisms of metabolic pathways of different carbon sources and the principle of competitive inhibition

甲酸鹽作為結構最簡單的有機物，在低濃度條件下對ANAMMOX脫氮效能也具有一定的促進作用。研究發現當甲酸鹽質量濃度＜100 mg/L時，可提高AnAOB的活性〔19〕。

丙酸鹽和葡萄糖相較乙酸鹽及甲酸鹽代謝途徑更為復雜，但這2種有機物對應的COD低于100 mg/L，對AnAOB群落仍然具有一定促進效果。Yuhai LIANG等〔20〕發現，在丙酸鹽質量濃度逐步上升到30 mg/L這一過程中，TNRE提高3.2%，Candidatus Jettenia豐度由0.03%上升到3.84%。研究者發現，低濃度的葡萄糖對AnAOB有促進作用。劉金苓等〔21〕研究發現葡萄糖對應的COD為90 mg/L時，NO2--N和NH4+-N去除率分別提高26.5%和47.6%。Chongjun CHEN等〔22〕證 實 當COD為50 mg/L時，NH4+-N去除率達97.23%，ANAMMOX性能并沒有受到影響，Planctomycetes豐度上升5%左右。

1.1.2 低濃度常規有機物提升AnAOB活性的機理

有機物提升ANAMMOX工藝脫氮性能及AnAOB微生物活性的路徑與碳源類型有關。甲酸鹽對ANAMMMOX的促進原因歸納如下：甲酸鹽可以直接被AnAOB通過Wood-Ljungdahl途徑的甲基分支同化〔23-24〕；從熱力學角度分析，氧化甲酸鹽可釋放出更多的能量〔6〕，從而使得甲酸鹽更易于被微生物利用。乙酸鹽提高ANAMMOX性能可能與其促進AnAOB相關功能酶的合成有關。例如CandidatusKuenenia具有乙酰輔酶A的合成酶（ADP-ACS），在乙酸鹽投加量較低的情況下，ADP-ACS的豐度上升了35.1%，而ADP-ACS可催化乙酸鹽到乙酰輔酶A的轉化〔25〕。丙酸鹽及葡萄糖則需分別通過SBM途徑（Sleeping Beauty Mutase）、糖酵解途徑轉化成琥珀酰輔酶A及乙酰輔酶A（見圖1），并進入TCA循環后被AnAOB利用從而達到促進作用〔26-27〕。

1.2 有機物對AnAOB的抑制作用及機理

1.2.1 高濃度常規有機物對AnAOB活性的抑制作用

低濃度常規有機物的存在會一定程度上提升AnAOB活性，但有機物對自養AnAOB的影響相對比較復雜。長期高濃度常規有機物（如乙酸鹽、丙酸鹽、葡萄糖、乳糖、蛋白胨及脫脂干奶等有機物，COD＞100 mg/L）的存在，會改變ANAMMOX系統中微生物群落結構，致使異養微生物過度生長，與AnAOB競爭基質、生態位，影響ANAMMOX工藝的性能。

ANAMMOX工藝中長期存在高濃度乙酸鹽時，反硝化菌可利用有機物反硝化脫氮，自養AnAOB與反硝化菌之間會競爭基質（NO2--N），AnAOB活性被抑制〔28〕。Chongjun CHEN等〔29〕發現，在乙酸鹽質量濃度為150 mg/L的體系中，Candidatus Kuenenia豐度降低17.4%，反硝化細菌大量繁殖，ANAMMOX脫氮效能下降。當以葡萄糖為碳源，COD為150 mg/L時，ANAMMOX系統中NH4+-N去除率下降至68.11%，Planctomycetes豐度下降7%左右，典型的菌屬Candidatus Kuenenia豐度下降10%，表明AnAOB活性受到一定程度的抑制〔22〕。以丙酸鹽為碳源的系統中也出現了類似現象〔30〕，當丙酸鹽質量濃度為200 mg/L時，NH4+-N去除率僅70%左右，優勢菌種Candidatus Brocadia豐度下降13.7%。研究者還對乳糖、蛋白胨、脫脂干奶等常規碳源的影響進行了研究，發現COD越高，對ANAMMOX的抑制效果越強烈〔31-32〕。相對來說，有機物分子質量越小、結構越簡單，越容易直接被利用，對AnAOB的影響越顯著。

有機物類型及濃度的改變可能導致系統中AnAOB優勢菌屬存在差異。表1綜述了不同類型碳源和不同COD條件下對AnAOB菌屬相對豐度的影響。

表1 碳源類型及濃度對AnAOB菌屬相對豐度及ANAMMOX運行性能的影響Table 1 Effect of carbon source type and concentration on the relative abundance of AnAOB and the operational performance of ANAMMOX

在有機物存在條件下，AnAOB菌屬類型和相對豐度也會發生變化，主要有以下幾種情況：1）Candidatus Brocadia可 能 比Candidatus Jettenia、Candidatus Kuenenia更能適應甲酸鹽、乙酸鹽的存在，因為Candidatus Brocadia對小分子有機酸的利用率更高，具有較強的競爭力和耐受力〔37-38〕；2）在丙酸鹽存在的條件下，Candidatus Jettenia具有更強的適應性，這可能是因為該類菌可以更有效利用丙酸鹽，從而表現出更好的活性〔15〕；3）Candidatus Kuenenia能夠代謝脂肪酸，對碳水化合物（如葡萄糖）的代謝能力較差〔39〕，因此Candidatus Kuenenia更容易受到葡萄糖的抑制。

1.2.2 高濃度有機物濃度對AnAOB抑制性影響的機理探討

高濃度COD對ANAMMOX產生的抑制影響機制主要有以下幾種理論闡釋。

1）從吉布斯自由能角度看，異養反硝化比（ΔG=-843 kJ/mol）ANAMMOX更 容 易 進 行（ΔG=-297 kJ/mol）〔40〕。因 此，當ANAMMOX系 統 中 存 在 較 高COD時，微生物傾向于反硝化反應。

2）高COD有利于反硝化細菌的生長，易導致體系中功能微生物群失衡，甚至AnAOB的消亡〔29，40〕，即所謂的“競爭淘汰引發的抑制”的因素。然而其引發的抑制效果可能與“碳源代謝途徑的復雜程度”密切相關。研究表明，復雜的代謝方式導致更低的反硝化率，反硝化細菌與AnAOB競爭底物時并不占優勢〔41〕。例如，葡萄糖的降解過程需要首先經過糖酵解途徑轉化為丙酮酸，隨后丙酮酸轉化為乙酰輔酶A并進入TCA循環，從而為反硝化提供反應所需的電子和能量；丙酸鹽的轉化途徑則需分為兩個階段，即SBM途徑和TCA循環（見圖1）；而乙酸鹽則可以直接轉化為乙酰輔酶A，而后進入TCA循環。這就解釋了相比乙酸鹽，相同濃度的葡萄糖及丙酸鹽對ANAMMOX抑制程度較小的原因。

3）在高COD存在的條件下，AnAOB雖可作為優勢物種，但并不執行正常的脫氮途徑，即AnAOB使用有機物而不是以NH4+-N和NO2--N作為底物〔7，16〕。因此，系統往往表現出脫氮效果惡化。這種現象可以被認為是“轉換代謝途徑”引發的抑制。某些AnAOB菌屬有能力將NO3--N作為電子受體氧化揮發性脂肪酸（VFA），同時以NO2--N作為中間產物生成NH4+-N，即異化硝酸鹽還原為銨（DNRA）的最終產物〔42〕。例如Candidatus Brocadiacaroliniensis和Candidatus Brocadiafulgida均已被證明具有進行DNRA的功能基因nrfA，表明這2種微生物可以利用有機物進行DNRA〔18〕。

總之，有機物濃度是影響ANAMMOX性能的重要因素。COD低于100 mg/L，可提高AnAOB的功能酶活性，促進AnAOB與反硝化細菌等微生物協同獲得更高的TNRE；當COD高于100 mg/L，則主要體現“競爭淘汰”及“轉換代謝途徑”，一定程度上對AnAOB產生抑制，通常COD越高，抑制效果越強烈。因此，維持合理的有機物濃度，對反應器高效脫氮及微生物群落結構的穩定具有重要意義。根據系統中AnAOB優勢菌屬對不同類型有機物的適應性，“對癥下藥”，促進ANAMMOX工藝的快速啟動和穩定運行，并為后續研究提供參考。

1.2.3 有毒有機物對AnAOB的抑制性影響

常見的有毒有機物如醇類、酚類、抗生素等都會對ANAMMOX產生抑制效果。這類有機物一般通過抑制AnAOB功能酶以及阻礙細胞蛋白質合成等方式影響ANAMMOX。

1）甲醇。甲醇超過一定濃度會對ANAMMOX有強烈的抑制作用，甚至會造成不可逆轉的影響〔7〕。甲醇可被AnAOB中羥胺氧化還原酶（Hao）氧化為甲醛，再與肽鏈交聯造成酶和蛋白質損傷，從而使AnAOB失活〔43-44〕。K.ISAKA等〔45〕研究發現，隨著甲醇濃度的提高，AnAOB活性逐漸下降。M.M.JENSEN等〔46〕發現加入3.3 mmol/L甲醇時，AnAOB活性下降到2%，甲醇濃度越高對AnAOB毒害作用越強烈。

2）酚類。酚類物質主要存在于某些工業廢水中，如造紙廢水、紡織廢水、化工廢水和制藥廢水等〔47〕，對AMAMMOX會產生較大影響。苯酚是酚類物質出現的常見形式，通過與AnAOB肼合成酶（Hzs）的α和γ亞基結合競爭蛋白質，抑制AnAOB活性。但不同于甲醇，苯酚對AnAOB的毒害往往快速且可逆〔48〕。苯酚對AnAOB的抑制可能與接觸苯酚的時間長短有關。短期內可通過抑制關鍵酶的活性抑制AnAOB的活性，長期影響則可改變微生物群落結 構〔48〕。Guopeng WANG等〔49〕發 現 苯 酚 可 以 使ANAMMOX的SAA（specific anammox activity）在5 d內下降80%；A.D.PEREIRA等〔50〕發現添加苯酚42 d后，ANAMMOX適應苯酚，SAA僅下降49.5%。通過降低進水苯酚濃度、進水負荷、更新部分污泥等方式，可使苯酚脅迫下的ANAMMOX性能得以快速恢復〔49，51〕。

通過比較甲醇、苯酚的存在對不同屬AnAOB相對豐度及ANAMMOX性能的影響，發現：Candidatus Brocadia比Candidatus Jettenia、Candidatus Kuenenia對 苯 酚 有 更 高 的 適 應 性〔48，52〕；相 較 于Candidatus Jettenia asiatica和Candidatus Jettenia caenia，Candidatus Kuenenia stuttgartiensis對甲醇有更高的適應性；Candidatus Kuenenia stuttgartiensis比Candidatus Brocadia sinica對甲醇的耐受度更高〔53-54〕。

3）抗生素?？股赝ㄟ^阻礙蛋白質和細胞壁的合成，與細胞膜的相互作用以及抑制DNA轉錄和復制〔4，55-56〕，抑制有害細菌的生長、繁殖和代謝，已被廣泛用于醫學、工業、畜牧業和水產養殖業中〔57〕。不同抗生素對ANAMMOX抑制效果具有差異，Zhengzhe ZHANG等〔58〕研究3種抗生素（阿莫西林、氟苯尼考、磺胺甲素）對ANAMMOX系統SAA的影響，16 d內3個反應器SAA分別下降50%、44%、48%。此外，抗生素抑制對AnAOB的影響與污泥形態有關，附著態污泥能更好地抵御抗生素的毒害作用。S.PHANWILAI等〔59〕在連續投加27 d 6 mg/L的氯霉素后發現，絮狀污泥和附著污泥SAA分別下降82%和71%?？股貙nAOB的抑制與抗生素類型、抗生素濃度、污泥形態均存在較為密切的聯系。在添加抗生素的ANAMMOX系統中，AnAOB可以表現出對低濃度抗生素的適應性〔58，60〕，而SAA的恢復以及抗生素抑制效果的減緩，可能與系統中EPS含量增加、微生物豐度提高以及微生物對抗生素的適應性上升有關。

在上述有毒有機物中，抗生素和酚類的抑制效果往往是可逆的，而醇類例如甲醇則表現出極強的抑制作用，并且大多數醇類的抑制都是不可逆的。此外，不同菌屬AnAOB對有毒有機物表現出不同的耐受性；污泥形態不同所表現出的抑制作用也不盡相同，總的來說，顆粒污泥和生物膜比絮狀污泥具有更高的耐受性。

2 有機物對ANAMMOX與反硝化競爭和協同的影響

2.1 C/N對AnAOB和反硝化菌協同體系的影響

低濃度有機物長期存在于ANAMMOX體系中，反硝化菌與AnAOB可在同一環境下共存。由于反硝化菌具有更高的生長率（產量系數0.27～0.3＞0.066）〔61-62〕，如不嚴格控制反應條件，反硝化菌將壓縮AnAOB生長空間，并最終抑制ANAMMOX脫氮性能。

合理的C/N是反硝化菌與AnAOB互利共生的重要條件。反硝化分為完全反硝化及短程反硝化（Partial denitrification，PD），通常C/N影響反硝化的程度。較高的C/N更容易發生完全反硝化，反硝化菌將與AnAOB競爭共同的“NO2--N”基質，從而對ANAMMOX產生抑制效果。而在較低的C/N下，反硝化進程終結在短程反硝化階段，NO3--N還原為NO2--N，可有效降低廢水中有機物含量及減少溫室氣體排放，中間產物NO2--N為AnAOB提供基質。

為探究最佳的進水C/N，國內外學者做了大量的研究。當C/N＜2.6時，盡管AnAOB仍是優勢菌，其活性會受到一定程度的抑制，PD反應也未得到充分發揮〔63-65〕。當C/N在2.6～3.5范圍內，AnAOB可協同反硝化菌獲得良好的脫氮效果。Jingwen ZHANG等〔66〕在SBR反應器中將C/N控制在2.6，反應器平均總氮去除率（TNRE）為81.2%，ANAMMOX對TN去除的貢獻率達83.6%。Shuzhe DING等〔67〕在SBR反應器中將C/N控制在3.5，實現86.1%的TNRE，其中ANAMMOX對TN去除的貢獻率高達89%。然而，當C/N＞3.5時，AnAOB與反硝化菌在競爭基質與空間中逐漸處于劣勢，反硝化反應逐漸轉化為完全反硝化，并開始占據主導地位，AnAOB活性受到較大抑制。Jianwei LI等〔68〕利用MBBR反應器探究較高C/N對ANAMMOX及反硝化脫氮貢獻率的影響發現，當C/N＞4時，ANAMMOX脫氮貢獻率僅15.9%，反硝化較ANAMMOX的脫氮貢獻率高68.2%。因此，維持進水C/N在2.6～3.5，可實現AnAOB與反硝化菌的互利共生，達到理想的脫氮效果。

2.2 協同作用中微生物群落結構變化研究

有機物存在條件下，ANAMMOX體系中最主要的AnAOB和反硝化菌分別屬于Planctomycetes、變形菌門（Proteobacteria），但進水C/N的差異會導致以上2種微生物相對豐度及優勢菌屬存在較大差異。在低C/N的環境中，Planctomycetes和Proteobacteria的相對豐度分別在2.54%～10.08%及31.15%～64.73%〔69〕。當環境中C/N在2.6～3.5時，Planctomycetes和Proteobacteria的相對豐度分別在12.88%～24.2%及40.69%～53.5%〔70〕。Thauera（Proteobacteria的一種菌屬）被認為是短程反硝化的功能菌，其活性直接影響短程反硝化耦合厭氧氨氧化（PD-A）脫氮性能〔71〕，合理的C/N有利于提高功能微生物的豐度。Qi ZHAO等〔72〕發現當C/N為3.2時，Thauera豐度上升5.27%，Candidatus Brocadia豐度上升1.99%。當C/N＞3.5時，Proteobacteria往往呈現出較高豐度，可達55%～65%，Planctomycete受到抑制，其相對豐度下降至0.5%～3.53%〔36，68〕?？梢?，在反硝化耦合厭氧氨氧化體系中，C/N的差異將影響反硝化-ANAMMOX體系中優勢種群及其相對豐度，甚至改變反硝化菌及AnAOB中的優勢菌屬。

3 結語

厭氧氨氧化菌世代周期長，對環境因子敏感，有機物作為污水中最常見的物質，其種類、濃度對ANAMMOX性能及微生物群落都會產生較復雜影響。

1）通常較低濃度簡單有機物，如甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽及葡萄糖可通過不同的代謝轉化方式被AnAOB利用，對ANAMMOX性能產生明顯的促進效果；C/N在2.6～3.5范圍內有利于實現ANAMMOX與反硝化的協同，可獲得更佳的脫氮效果。

2）較高有機物濃度易導致反硝化菌占優勢，以“競爭淘汰”及“轉換代謝途徑”2種方式與AnAOB競爭基質，甚至改變AnAOB正常的代謝途徑，從而抑制AnAOB。通常COD越高，作用時間越長，抑制效果越強烈。

3）甲醇、苯酚、抗生素等有毒物質可通過抑制AnAOB功能酶，阻礙細胞蛋白質合成等方式影響AnAOB代謝，從而抑制ANAMMOX脫氮性能。醇類對AnAOB有較強的不可逆抑制作用，抗生素和酚類的抑制效果往往是可逆的。

4）典型的AnAOB菌Candidatus Brocadia和Candidatus Jettenia對有機物具有相對較好的適應性。