蔥白提取物對OGD/R誘導的RCMECs損傷的作用及機制

吳勇宏 付聰 劉翰 田立群 段剛峰 卜文玉 柯于鶴

(武漢市中西醫結合醫院,湖北 武漢 430000)

缺血性心臟病(IHD)是全世界范圍內致死的主要病因之一,每年造成900萬人死亡,緊急時呈現為急性心肌梗死(AMI)〔1〕。AMI與高發病率和死亡率有關,可造成不可逆轉的心肌損傷,迅速而有效地恢復缺血心肌的血流灌注對于限制梗死大小和挽救缺血性心肌至關重要〔2〕。然而,隨著再灌注療法在AMI患者中的廣泛應用,缺血引起的心肌損傷明顯減少,但再灌注引起的心肌損傷日益明顯〔3〕。且再灌注可能會加劇致命的組織損傷,這種現象稱為心肌缺血/再灌注(I/R)損傷〔2〕。I/R損傷的特點包括微血管灌注缺陷、血小板激活和連續心肌細胞死亡,其中微血管阻塞,即無復流現象,決定了梗死區、心肌功能和術外死亡率〔3〕。而微血管阻塞引起的微循環功能障礙是死亡的獨立危險因素,通常出現在心力衰竭等重病的早期階段〔4〕。心臟微血管內皮細胞損傷可能比心肌細胞損傷發生得更早,嚴重程度要大得多〔3〕。在I/R損傷過程中,心肌微血管的損傷很可能是心肌損傷的起始因素,因此,保護心肌微血管內皮細胞(RCMECs)能減輕心肌I/R損傷。在改善缺血心肌方面,中醫藥治療優勢明顯。其中,從蔥科植物細香蔥成熟莖下端蔥白中提取的一類活性成分被發現可以有效抗氧化損傷、改善缺血心肌〔5,6〕。楊淑華等〔7〕研究結果也顯示,蔥白提取物(FOB)對I/R損傷具有保護作用。楊劍鋒等〔8〕研究結果同樣表明,FOB具有改善I/R模型大鼠心功能作用,且其機制與調節p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路蛋白表達、抗心肌細胞凋亡相關。本課題探討FOB對RCMECs細胞外信號調節激酶/細胞外調節蛋白激酶(MEK/ERK)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 大鼠心肌微血管內皮細胞(RCMECs)購自賽佰康;FOB來源于武漢市第一醫院;培養基199(M199)、胎牛血清(FBS)、Ⅱ型膠原(Collagenase Ⅱ)、青鏈霉素(雙抗)購自Gibco公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、肝素鈉、抗熒光衰減封片劑〔含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)〕、3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液購自Solarbio公司;DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-AcLDL)購自thermofisher公司;重組鼠血管內皮生長因子(VEGF)購自PeproTech公司;基質膠購自CORNING公司;CCK8溶液購自北京索萊寶科技有限公司;二喹啉甲酸(BCA)定量測定試劑盒購自金克隆公司;乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自DOCLAB公司;化學發光試劑購自rongbai公司;兔抗大鼠細胞周期素(Cyclin)D2抗體,兔抗多重腫瘤抑制基因(P16)抗體,兔抗MEK抗體,兔抗p-MEK抗體,兔抗ERK抗體,兔抗p-ERK1/2抗體購自Bioswamp公司。

1.2細胞復蘇與培養 將收集的細胞用完全培養基(M199+20%FBS+1%雙抗+50 μg/ml肝素鈉)重懸,接種至T25瓶后每2 d換液。取正常細胞樣本(12孔板),加入1 ml 4%多聚甲醛室溫固定20 min,棄固定液用1 ml PBS洗2遍,每次3 min,棄PBS,再加入1 ml 15 μg/ml LDL染色液,37 ℃孵育4 h,PBS重復洗后加入500 μl含DAPI的抗熒光衰減封片劑,室溫孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察拍照鑒定。

1.3FOB對RCMECs毒性作用 用不同濃度的FOB(0、1、10、20、50、100 μg/ml)干預正常RCMECs細胞,調整細胞懸液濃度,接種于96孔板中,每孔3×103個細胞。處理細胞24、48和72 h后,每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續培養4 h,在酶聯免疫檢測儀上檢測450 nm處各孔的吸光值。

1.4細胞氧糖剝奪/復氧(OGD/R)模型構建及鑒定 將細胞置37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜,使細胞貼壁,再于1% O2,5% CO2及95% N2中培養2 h后換正常條件繼續培養4 h〔9〕。取出細胞培養板,向每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續培養4 h,在酶聯免疫檢測儀450 nm 處測量各孔的吸光值,檢測OGD模型細胞活力。

1.5CCK8檢測細胞增殖 OGD/R前加入FOB預孵育1 h(0、1、10、20、50、100 μg/ml),再構建OGD/R模型,調整細胞懸液濃度,接種于96孔板中,每孔3×103個細胞,培養過夜。根據不同分組處理細胞24、48和72 h后,每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續培養4 h,在酶聯免疫檢測儀上檢測450 nm處各孔吸光值,選擇FOB最佳作用濃度為50 μg/ml。

1.6細胞分組 將細胞分為對照組、模型組、低、中、高劑量組。對照組細胞不做處理,正常培養;模型組構建OGD/R模型;低、中、高劑量組分別用12.5、25、50 μg/ml的FOB預處理1 h再構建OGD/R模型。

1.7生化檢測細胞LDH活性 收集細胞,根據LDH測定試劑盒說明書檢測LDH釋放量。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測細胞中MEK和ERK1/2 mRNA表達水平 收集各組細胞,取1×106個細胞,利用Trizol法提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA,將制備好的cDNA進行PCR擴增。PCR條件為：95 ℃預變性3 min,95 ℃變性5 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸25 s,共40個循環。引物序列MEK正向5′-GACGCAGAAGCAGAAGGTG-3′,反向5′-GTAGAAGCCCACTATGTACGG-3′;ERK1/2正向5′-ATAGGC ATCCGAGACATCC-3′,反向5′-GCTCAGGGTCAGCA ATCC-3′;β-actin正向5′-CGTTGACATCCGTAAA GAC-3′,反向5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′。以β-actin為內參,2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.9Western印跡檢測細胞中CyclinD2、P16和MEK/ERK通路相關蛋白表達水平 取1×106個細胞,提取細胞總蛋白質后取20 μg蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,再轉移到PVDF膜上封閉4 ℃過夜。根據說明書稀釋一抗孵育1 h,洗膜后加入按照 1∶10 000稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h,洗膜。加入化學發光試劑,與膜充分接觸后,置于全自動化學發光儀中檢測,讀取相關條帶灰度值。

1.10統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1微血管內皮細胞鑒定 90%以上的細胞呈因子陽性,并且能夠攝取Dil-Ac-LDL,表明培養的細胞為內皮細胞。見圖1。

圖1 RCMECs鑒定(免疫雙標染色,×200)

2.2FOB對正常RCMECs細胞毒性作用比較 FOB對正常RCMECs細胞具有毒性作用,且毒性作用隨著濃度的升高和時間延長逐漸增大。見表1。

表1 各組FOB細胞毒性及增殖能力比較

2.3FOB對各組OGD/R細胞增殖能力的比較 OGD/R細胞增殖能力隨著FOB作用時間的增加而增強,72 h時細胞增殖能力最高;作用72 h時,20、50、100 μg/ml的增殖能力無明顯差異,但48 h時,50 μg/ml時增殖能力最高。見表1。因此,FOB最佳作用時間為48 h,濃度為50 μg/ml。

2.4OGD/R模型的鑒定 OGD/R組細胞活力(0.75±0.02)較對照組(0.94±0.01)顯著降低(t=19.08,P<0.05),表明OGD/R模型構建成功。

2.5各組細胞LDH活性比較 模型組細胞LDH活性顯著高于對照組(P<0.05)。低、中、高劑量組細胞LDH活性均顯著低于模型組,且呈劑量依賴性,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞LDH活性、CyclinD2、P16蛋白、MEK和ERK1/2 mRNA及磷酸化水平比較

2.6各組細胞CyclinD2和P16蛋白表達水平比較 與對照組比較,模型組細胞CyclinD2蛋白表達水平顯著降低,P16蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,除低劑量組細胞CyclinD2蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05),其他劑量組細胞CyclinD2蛋白表達水平顯著升高且呈上升趨勢,P16蛋白表達水平顯著降低且呈劑量依賴性,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表2、圖2。

1～5：對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組圖2 FOB對RCMEC細胞CyclinD2、P16蛋白表達及MEK、ERK1/2磷酸化的影響

2.7各組細胞中MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白磷酸化水平 與對照組比較,模型組細胞MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白磷酸化表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,各劑量組細胞MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白磷酸化顯著升高,且呈劑量依賴性,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表2、圖2。

3 討 論

LDH是一種存在于幾乎所有身體組織的酶,可以標記各種組織損傷〔10〕。組織損傷的病因有AMI、貧血、肺栓塞、肝炎、急性腎衰竭等疾病〔11〕。組織損傷后,細胞在血液中釋放LDH,血清中的LDH升高,肝病、肌肉損傷、心臟病發作等都可能導致血液中LDH活性升高,在AMI中,LDH-1異構體從第2天一直升高到第4天,而治療期間LDH活性降低則表明AMI或肝損傷等疾病對治療的預后或反應良好〔10〕。Wu等〔12〕研究結果顯示,生長停滯特異性轉錄因子(GAS)5下調可減輕離體心肌I/R損傷使其LDH活性降低。本文結果提示,缺血能引起心肌細胞膜損傷,FOB對心肌I/R損傷有保護作用,且濃度越高損傷越小。

CyclinD2是調節細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)4活性的輔助因子,CDK4介導細胞周期通過限制點的轉運,CyclinD2在成年心肌細胞中的靶向表達誘導內源性CDK4的表達,研究表明,CyclinD2轉基因小鼠在成年心臟中表現出持續的心肌細胞更新〔13〕。而P16是衰老的體內生物標志物,低水平P16的細胞因衰老而經歷細胞周期停滯〔14〕。成人心臟干細胞衰老與生理和病理過程有相應的關聯,包括心肌損傷修復和器官功能障礙等,而衰老主要通過P16等的激活來執行〔14〕。本研究提示,FOB可抑制RCMECs的P16蛋白表達,促進CyclinD2蛋白表達,即延緩心肌細胞衰老,促進其更新。

研究發現,MEK/ERK信號抑制了用奧洛平治療的老鼠心肌I/R損傷〔15〕。蔣智等〔16〕研究結果也顯示,子宮內膜干細胞來源細胞因子“雞尾酒”(EdCC)通過激活MEK1-ERK1/2信號通路減輕心肌I/R損傷。富丹婷等〔17〕研究結果顯示,纖維肉瘤(Raf)/MEK/ERK通路在心肌肥大中的調控作用,可能通過激活關鍵因子c-Raf、MEK1、MEK2、ERK1和ERK2特異性位點的磷酸化實現的。本研究提示,FOB可激活心肌微血管內皮細胞MEK/ERK1/2通路,且濃度越高效果越好。

綜上,FOB可以調控RCMECs的活性,其作用機制可能與激活MEK/ERK通路有關。