核轉錄因子紅系2相關因子2和p62在宮頸鱗狀細胞癌和上皮內病變中的表達及診斷價值

鄭桂華，金曉霞，陶玉梅，劉丹陽，朱興華，衛穎澤

作者單位：1南通市腫瘤醫院/南通大學附屬腫瘤醫院病理科，江蘇 南通 226361；2南通市婦幼保健院病理科，江蘇 南通 226007；3復旦大學附屬婦產科醫院病理科，上海 200090

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率均位于女性惡性腫瘤第四位，2020 年全球新發病例和死亡病例大約分別為604 127例和341 831例［1］。在我國，宮頸癌的發病率和病死率均位于女性惡性腫瘤的前十位，分別是第六位和第七位［2］。組織病理學上宮頸癌主要分為兩大類：起源于鱗狀細胞的鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和起源于腺細胞的腺癌。SCC 約占宮頸癌的80%，一般由良性細胞不典型增生到宮頸上皮內瘤變（cervical inepithial neoplasm，CIN）發展而來［3］。

核轉錄因子紅系2 相關因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一系列細胞保護基因的主要調節因子，能夠在應激條件比如活性氧和親電試劑等情況下保護細胞［4］。近年來，越來越多的研究表明Nrf2 在多種癌中過表達，并且發揮著重要的促癌作用［5］。已有研究發現Nrf2不僅在宮頸癌中發揮著重要的作用［6-7］，而且與正常宮頸鱗狀上皮相比，Nrf2 和其下游基因醌NADH 脫氫酶1（NQO1）在宮頸SCC 表達最高，CIN 次之［8］，這一結果表明Nrf2 在正常鱗狀上皮至SCC 發生過程中的作用。選擇性自噬接頭蛋白p62/Sequestosome1（SQSTM1）含有多種結構域，能夠與包括有絲分裂原活化蛋白激酶激酶（MEKK）3，人BRCA1基因1相鄰蛋白（Nbr1），受體相互作用蛋白（RIP）1，人哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）調節相關蛋白（Raptor），腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAF）6，自噬標志物LC3，Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1），泛素等分子結合，從而影響炎癥、Nrf2、mTORC1、核因子-κB（NF-κB）等不同的信號通路。近年來，同樣有越來越多的研究表明p62在多種惡性腫瘤中過表達，并且發揮促癌的作用［9］。然而，Nrf2 與p62 在宮頸癌和上皮內病變診斷中的價值尚未有研究報道，在宮頸不同病變中二者之間的相關性尚不明確。因此，在本研究中我們首先檢測了Nrf2 和p62 在宮頸癌和上皮內病變中的表達情況并分析二者的相關性，最終評價其在宮頸癌和上皮內病變中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2008 年1 月至2021 年12 月南通市腫瘤醫院病理科120 例宮頸SCC、102 例低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）和101 例高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）病人及49 例宮頸良性/反應性鱗狀上皮病人的石蠟標本。本研究數據的使用已獲得病人或其近親屬及健康體檢者本人的知情同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑小單克隆抗體Nrf2（1∶200，AB62352）購自abcam 公司，p62（1∶200，88588S）購自CST 公司，一抗稀釋液和磷酸緩沖鹽溶液（PBS）均購自北京中杉金橋公司，二抗和顯影液購自Dako公司。

1.2.2 免疫組織化學法將4 μm 厚的石蠟切片置于65 ℃溫箱中過夜，二甲苯常規脫蠟，依次經100%、95%、85%、75%乙醇去除多余液體，蒸餾水沖洗后，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復液（pH 9.0）經高壓修復，滴加一抗，室溫下孵育1.5 h，滴加二抗，37 ℃溫箱中孵育1 h，3，3’-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，中性樹膠封固。為證明Nrf2和p62抗體免疫組織化學檢測的特異性，我們設置了陰性對照和陽性對照。

1.2.3 結果判讀由兩名病理科副主任分別閱片并記錄結果。Nrf2 和p62 以細胞質中呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。根據陽性細胞的染色強度計分［10］：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。根據陽性細胞百分比計分：＜5%為1 分，5%～30%為2 分，＞30%～60%為3 分，＞60%為4 分。將兩項得分結果相乘： 0 分為陰性（-），1～2 分為低表達（+），3～6 分為中等表達（++），＞6分為高表達（+++）。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0 軟件進行統計。采用χ2檢驗比較各組間Nrf2 和p62 的表達，計數資料以例表示，采用Spearman 秩相關分析各組間Nrf2和p62 之間的相關性，采用二元logistic 回歸分析和受試者操作特征曲線（ROC曲線）判斷Nrf2和p62在各組間的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Nrf2 和p62 在宮頸不同病變中的表達Nrf2和p62 在宮頸不同病變中均定位于細胞質。Nrf2 和p62 在良性/反應性宮頸鱗狀上皮中的表達低于LSIL、HSIL 與SCC（Nrf2χ2分別為30.74、41.31、129.15；p62χ2分別為29.93、30.64、159.27。均P＜0.05），并且Nrf2 和p62 在LSIL 中的表達明顯低于HSIL 與SCC（Nrf2χ2分別為126.71、176.49；p62χ2分別為101.14、60.02。均P＜0.05）。雖然p62 在HSIL 中表達低于SCC（χ2為126.93，P＜0.05），但是Nrf2在HSIL中表達高于SCC（χ2為161.64，P＜0.05）。見圖1；表1。

表1 核轉錄因子紅系2相關因子2（Nrf2）和p62在宮頸不同病變中的表達情況比較/例

圖1 良性/反應性鱗狀上皮、低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)、高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)、鱗狀細胞癌(SCC)等宮頸不同病變中的HE形態（HE染色×200）及核轉錄因子紅系2相關因子2（Nrf2）與p62表達情況（免疫組織化學染色×200）

2.2 Nrf2 和p62 在宮頸不同病變中的相關性Nrf2 和p62 在良性/反應性宮頸鱗狀上皮、LSIL、HSIL和SCC中均呈正相關性（均P＜0.05），見表2。

表2 核轉錄因子紅系2相關因子2（Nrf2）和p62在宮頸不同病變中的相關性/例

2.3 Nrf2 和p62 在宮頸不同病變中的診斷效能ROC曲線分析表明，除Nrf2在診斷HSIL與SCC中差異無統計學意義外，Nrf2、p62 以及聯合Nrf2 和p62在診斷良性/反應性鱗狀上皮與LSIL、良性/反應性鱗狀上皮與HSIL、良性/反應性鱗狀上皮與SCC、LSIL 與HSIL、LSIL 與SCC、HSIL 與SCC 各個組別中均差異有統計學意義（均P＜0.05）。與單獨使用Nrf2或者p62 相比，二者聯合鑒別這些宮頸病變效果更佳。見表3。

表3 核轉錄因子紅系2相關因子2（Nrf2）及p62在診斷宮頸不同病變中的ROC曲線結果

3 討論

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，而且近年來我國宮頸癌的發病年齡明顯年輕化［11］。宮頸LSIL 和HSIL 進展為SCC 的概率分別為1%和20%～40%［12-13］，目前，除了人乳頭瘤病毒（HPV）基因分型和p16INK4a基因以外，很少有其他分子標記在宮頸癌及癌前病變中被廣泛應用。然而，p16INK4a陽性也不是作為判斷HSIL的絕對指征，因此尋找更多的分子標記用于輔助診斷宮頸癌及癌前病變至關重要，從而避免育齡婦女可能增加流產或早產風險的不必要的外科治療。

Nrf2最初被認為是預防癌癥和其他疾病的化學預防化合物，隨后諸多研究表明Nrf2 不僅是多種癌癥發生、轉移及抗藥性的驅動因子，而且還具有調節代謝和其他基本細胞功能方面的新作用［14］。已有研究表明Nrf2在宮頸癌中的促癌作用。在維吾爾族女性中，宮頸SCC和CIN與Nrf2表達升高及Keap1表達降低有關。Nrf2 與組織學分級、淋巴結轉移和腫瘤分期呈正相關，而Keap1和這些指標呈負相關。Nrf2促進宮頸SCC細胞的增殖、遷移和侵襲，并且抑制細胞凋亡。Nrf2有望成為宮頸癌病人預后差的指標［6］。Nrf2 和其下游分子NQO1 及血紅素氧化酶-1（HO1）在宮頸腫瘤組織中不同程度地表達增高。在宮頸癌細胞CaSki 細胞中敲除Nrf2，其下游基因表達明顯降低，并且促進了化療藥物誘導的細胞死亡。除此之外，體內實驗證實順鉑聯合Nrf2 敲除進一步抑制了腫瘤的生長［7］。在本研究中，我們同樣發現與良性/反應性宮頸鱗狀上皮相比，Nrf2 在宮頸SCC 中過表達。并且Nrf2 能夠有效地鑒別良性/反應性宮頸鱗狀上皮和LSIL 或LSIL 和HSIL。值得注意的是，Nrf2 在SCC 和HSIL 表達均高于良性/反應性宮頸和LSIL，但是在SCC 中Nrf2 的表達略低于HSIL，具體原因還有待在今后的研究中發現。

許多文獻表明Nrf2和p62之間存在一個正反饋環。p62 堆積能夠激活Nrf2 和其下游靶向基因，而Nrf2 也可以直接與p62 啟動子區的抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）序列結合調節p62 的表達［15-16］。有學者發現敲減p62 后，宮頸癌細胞活力明顯下降、凋亡增加，活性氧產生。而且在宮頸癌細胞中敲除p62 后，Nrf2 表達水平明顯下降［17］，細胞水平證實二者具有相關性。目前Nrf2 和p62 在宮頸組織中的相關性尚不明確，本研究發現Nrf2 和p62 在良性/反應性宮頸鱗狀上皮、LSIL、HSIL 和SCC 中均具有正相關性，我們在組織水平進一步證實了Nrf2 和p62 具有相關性。Nrf2 和p62 的相關性不僅在宮頸組織中得到證實，我們早期就在乳腺癌細胞和組織中發現Nrf2和p62能夠相互調節并具有正相關性，誘導乳腺癌耐藥［10］。在肝細胞肝癌和胰腺導管腺癌中也同樣證實了Nrf2和p62之間具有相關性，從而誘導腫瘤的發生發展［18-19］。

p62 作為一種信號轉導蛋白，不僅協調癌細胞的代謝重編，而且還調節腫瘤內正常細胞的功能，以支持腫瘤生長和增殖。越來越多的證據表明，p62 在各種癌癥中都有異常表達，如肺癌、肝癌、腎癌、結直腸癌、乳腺癌、胃癌等［20-21］。梁冠男等［22］研究發現p62在宮頸浸潤性癌、CINⅡ/Ⅲ、CINⅠ、正常宮頸表達均不相同，且隨病情的加重表達量會隨之增加，我們的結果與其一致。本研究同樣發現p62在良性/反應性宮頸鱗狀上皮中表達最低，其次是LSIL、HSIL，在SCC 中表達最高。而且通過ROC 曲線分析顯示p62 能夠有效地鑒別良性/反應性宮頸鱗狀上皮、LSIL、HSIL 及SCC。與單獨使用Nrf2 或者p62 時相比，二者聯合使用鑒別這些不同的宮頸病變效果更佳。

綜上所述，Nrf2 和p62 在不同宮頸病變中表達各不相同，良性/反應性鱗狀上皮中不表達或低表達，在LSIL 中表達有所增高，HSIL 和SCC 中表達最高，且二者在不同宮頸病變中均具有正相關性，單獨使用或者二者聯用均能夠有效診斷不同的宮頸病變。Nrf2 和p62 有望成為像p16INK4a 一樣作為臨床診斷宮頸病變的分子標記。

（本文圖1見插圖3-5）