基于超高效液相色譜-質譜聯用技術的慢性腎臟病骨代謝異常大鼠血清代謝組學研究

李瑾，李雨靜，邢暉林，鄧喜文，郭明好

作者單位：新鄉醫學院第一附屬醫院腎臟內科，河南 新鄉 453000

慢性腎臟?。╟hronic kidney diseases，CKD）全球發病率已超過10%，呈現發病率高、并發癥多的特點［1］。慢性腎臟病骨代謝異常（chronic kidney diseases bone disorder，CKD-BD）特指與CKD 相關的骨組織學異常，臨床表現為骨痛、骨骼變形及骨折發生率增加，是CKD 礦物質及骨代謝異常（chronic kidney disease-mineral bone disorder，CKD-MBD）的重要組成部分，是CKD 的嚴重并發癥，也是病人致殘、致死等不良結局的重要原因之一［2］。目前CKDBD發病機制尚不明確，臨床治療效果欠佳。尿毒癥毒素是指隨著CKD 進展、腎小球濾過率下降，不斷蓄積在病人體內的異常代謝產物，可導致代謝紊亂或產生一系列臨床表現［3］。目前已有研究證實尿毒癥毒素參與了CKD 病人多種并發癥發生，例如尿毒癥心肌病、尿毒癥腦病等［4-5］，然而尿毒癥毒素在CKD-BD 中的作用尚不明確。本研究于2021 年1 月至2022 年4 月通過構建CKD-BD 大鼠模型，借助超高效液相色譜-質譜（UHPLC-MS）聯用技術，了解CKD-BD 大鼠血清代謝組學變化，探索尿毒癥毒素在CKD-BD 發病中的作用，為CKD-BD 的臨床干預提供依據。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑四環素（美國Sigma 公司，批號87128）、鈣黃綠素（美國Merck 公司，批號0875）、水合氯醛（中國國藥公司，批號H37022673）、Goldner's三色染色試劑盒（廣州三旭生物科技公司）、包埋樹脂液（德國Technovit公司）。純化鼠糧購自廣州佰匯生物科技有限公司，大鼠全段甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）試劑盒購自美國SAB公司。

1.1.2 主要儀器硬組織切片機（德國EXAKT 公司，型號310CP）、磨片機（德國EXAKT 公司，型號400CS）、光固化機（德國EXAKT 公司，型號E520）、熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號BX53）、超高效液相質譜儀（Thermo Fisher Scientific，型號Vanquish）、骨形態學圖像分析系統（美國 Bioquant，型號BIOQUANT OSTEO）。

1.1.3 實驗動物16 只8 周齡SPF 級SD 雄性大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，體質量范圍為240～260 g，分籠飼養于24～28 ℃的環境中，每日更換墊料，自由攝食及飲水。

1.2 方法

1.2.1 骨代謝異常大鼠動物模型建立通過高磷高腺嘌呤飲食誘導CKD-BD 大鼠，具體方法如下：所有大鼠經過1 周適應性喂養后，隨機數字表法分為兩組，每組8 只：（1）健康對照組（NC 組）：使用普通大鼠飼料喂養90 d；（2）CKD-BD 組：采用高磷高腺嘌呤飼料（含1.8 % 磷及0.75 % 腺嘌呤）喂養60 d之后更換高磷飼料（含1.8%磷）喂養30 d 后處死。大鼠處死前15 d 及14 d 腹腔注射四環素（30 mg/kg），處死前3 d 及2 d 腹腔注射鈣黃綠素（5 mg/kg），四環素及鈣黃綠素注射液均為當日配制且避光保存。水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，腹主動脈采血處死大鼠。離心后取血清置于-80 ℃冰箱分裝保存。分離大鼠右側股骨，中性福爾馬林固定。

1.2.2 血清生化指標檢測使用BeckmanAU 5800全自動生化分析儀檢測血鈣、磷、肌酐。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測血清全段PTH水平。

1.2.3 皮質骨包埋及切片制備大鼠右側股骨標本經福爾馬林液固定48 h 后，行梯度酒精（70%，80%，95%）脫水，每步24 h。脫水后浸泡于Technovit 7200 樹脂液中，使用光固化機包埋聚合。固化后的組織塊用硬組織切片機切取厚度約200 μm的切片，并使用磨片機打磨至20 μm，最后以4 000目砂紙拋光。磨片根據試劑盒說明進行Goldner's 三色染色：首先將磨片放入Weigert's 蘇木素液染色15 min，再用流動水漂洗10 min，后使用酸性品紅－麗春紅染液染色5 min。使用1%冰醋酸洗2 次后用1%磷鉬酸染色，直到膠原脫色，再用1%冰醋酸洗2 次，2%亮綠液染色5 min，1%冰醋酸洗2 次，濾紙吸干，封片在顯微鏡下進行骨形態計量學檢測。

1.2.4 骨形態計量學檢測染色后的切片進行骨形態計量學檢測，按照國際通用的Frost標準骨組織形態計量學檢測方法對骨轉運的動態參數進行測量，以骨礦化沉積率（mineral apposition rate，MAR）反映新骨礦化速度，以骨形成率/骨體積（bone formation rate/bone volume，BFR/BV）反映骨轉換率。

1.2.5 大鼠血清代謝組學檢測通過UHPLC-MS聯用技術檢測兩組大鼠血清代謝產物。色譜條件：使用Vanquish （Thermo Fisher Scientific）超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm）液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L 氨水，B 相為乙腈。樣品盤溫度：4 ℃，進樣體積：2 μL。質譜條件：采用Orbitrap Exploris 120 質譜儀進行一級、二級質譜數據采集。相關參數設定如下：毛細管電壓正、負離子條件下分別設定為3.8 kV 和-3.4 kV。鞘氣流速：50 Arb。輔助氣流速：50 Arb。毛細管溫度：320 ℃。分辨率為6 000進行全掃描。

1.3 統計學方法生化指標及骨形態計量學參數使用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，計量資料使用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05視為差異有統計學意義。質譜數據使用SIMCA軟件進行統計分析：如主成分分析 （principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA）。利用京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫對差異代謝產物進行代謝通路分析。

2 結果

2.1 各組大鼠血清生化指標變化與NC 組大鼠相比，CKD-BD 組大鼠表現出肌酐升高、低血鈣、高血磷、高PTH的特點（P＜0.01）。見表1。

表1 造模后兩組大鼠血清生化指標比較/

表1 造模后兩組大鼠血清生化指標比較/

注：NC 為健康對照，CKD-BD 為慢性腎臟病骨代謝異常，PTH 為甲狀旁腺激素。

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2.2 各組大鼠骨組織形態變化通過四環素-鈣黃綠素活體熒光雙標記對各組大鼠的骨組織形態進行觀察，見圖1。黃色熒光為大鼠處死前第15 天和第14天注射四環素標記的礦化帶，綠色熒光為大鼠處死前第3 天和第2 天注射鈣黃綠素標記的礦化帶，黃色和綠色標記間的區域，即該段時間的新生骨礦化區域（白色箭頭處為明顯的新骨礦化區域）。NC 組大鼠可見正常的成骨礦化帶，CKD-BD 組可見骨礦化帶增寬、礦化區域增多。骨形態計量學檢測發現NC 組大鼠MAR 為（1.90±0.61）μm/d，CKD-BD組大鼠MAR 為（2.80±0.73）μm/d，差異有統計學意義（t=2.97，P=0.010）。NC 組大鼠BFR/BV 為（0.41±0.20）%/d，CKD-BD組大鼠BFR/BV為（1.25±0.41）%/d，差異有統計學意義（t=5.20，P＜0.001）。提示CKD-BD組大鼠骨轉換水平高于NC 組，呈現高骨轉換率、高新骨礦化速度的特點，與CKD-BD形態特征相符。

圖1 兩組大鼠骨組織形態變化（四環素-鈣黃綠素熒光染色×200）：A為正常對照（NC）組大鼠，可見正常的成骨礦化帶；B為慢性腎臟病骨代謝異常（CKD-BD）組，可見骨礦化帶增寬，礦化區域增多

2.3 各組大鼠血清代謝譜PCA比較兩組大鼠血清樣本在正負離子下的總離子流，發現在負離子模式下，可獲得較強的化合物響應和更為豐富的化合物信息，故后續采用負離子模式進行檢測。PCA 圖中的每一個符號點代表1 個血清樣品，各組樣品在空間分布位置不同，代表了不同組別樣本的代謝狀況不同。NC 組與CKD-BD 組的組間分離趨勢明顯，同組的樣本呈現聚集趨勢，提示樣本代謝產物在組間有明顯差異，同時組內的穩定性良好，見圖2。

2.4 OPLS-DA為進一步比較組間差異變量，通過OPLS-DA分析方法對大鼠血清樣品進行差異分析。圖中NC 組與CKD-BD 組分離顯著，提示CKD-BD 狀態下大鼠血清代謝產物發生變化，見圖3。

2.5 兩組大鼠血清差異代謝物功能分析以P＜0.05，變量投影重要度大于1 為過濾標準對各組間差異代謝物進行篩選，在NC組與CKD-BD組大鼠間篩選到37 種差異代謝物。將差異產物的定量值進行比較，以log2（fold change）表示差異的倍數關系，變化上調倍數前5名的物質為：姜醇、丙酮酸、甲酚、硫酸甲酚、苯乙酰，變化下調倍數前5 名的物質為：硬脂酸、辛葵烯酸、膽汁酸、α-亞麻酸、羥基吲哚乙酸。借助KEGG數據庫對以上差異代謝產物進行功能分析和通路富集。根據差異代謝物在KEGG代謝通路中的富集結果，計算Rich Factor（某一通路中注釋到的差異代謝物數量與該通路中所有代謝物數量的比值），該值越大表示富集程度越大。結果表明，兩組間差異代謝產物涉及甘油磷脂代謝、神經傳導、自噬、糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成、膽汁分泌等生理過程。差異豐度得分可以反映出某一通路中所有差異代謝物的總體變化趨勢。結果表明，與NC 組相比，CKD-BD 組糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成等通路上調。自噬、膽汁酸合成分泌、膽固醇代謝、?；撬岷痛渭壟；撬岽x、甘油磷脂代謝等通路下調（P＜0.05）。這其中，參與自噬通路的兩組間差異代謝產物為磷脂酰乙醇胺。

3 討論

CKD 病人隨著腎小球濾過率逐漸下降，尿毒癥毒素在體內蓄積，由此產生一系列臨床癥狀及并發癥［6］。研究發現尿毒癥毒素與CKD 病人食欲下降、惡心嘔吐等消化道癥狀相關［5］。另有研究證實，尿毒癥毒素參與了CKD病人血管并發癥的發生［7］。此外還有研究發現尿毒癥毒素影響了CKD 病人全身炎癥狀態［8］。CKD-BD 是CKD 常見的并發癥之一，目前發病機制尚不明確。CKD-BD 早期臨床表現較為不典型，隨著疾病進展逐漸出現骨痛、骨骼變形等晚期癥狀［9-10］。已有研究發現，腸道來源的尿毒癥毒素硫酸吲哚酚可通過抑制成骨細胞活性、誘導骨骼對PTH的抵抗等機制參與CKD-BD發生［11］。我們的研究中，發現CKD-BD 大鼠與NC 大鼠相比，血清代謝產物譜發生明顯變化。經過功能分析，發現異常的代謝產物涉及甘油磷脂代謝、神經傳導、自噬、糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成等生理過程。

糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白是真核生物細胞膜表面蛋白質與細胞膜錨定的重要結構，參與了細胞與外界信號傳導等過程［12-14］。本研究發現，CKD-BD 組糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成通路上調，提示在慢性腎衰竭的環境下，細胞與外界信息傳遞更為復雜。

此外，本研究發現與NC 組大鼠相比，CKD-BD組大鼠血清中與自噬相關的代謝產物發生變化。自噬是真核細胞在基因調控下利用溶酶體降解自身細胞質蛋白和受損細胞器的過程，可防止細胞損傷，促進細胞在營養缺乏的情況下存活，并對細胞毒性刺激作出反應［15-17］。研究證實在低氧、炎癥等病理條件下，影響骨代謝水平的重要細胞骨髓間充質干細胞可通過增強自噬作用改善骨代謝狀態［18］。本研究發現CKD-BD 組與自噬相關的代謝產物磷脂酰乙醇胺表達低于NC 組，研究證實磷脂酰乙醇胺低表達可影響自噬溶酶體的形成，引起自噬相關通路下調［19］，這提示自噬水平下降是CKD 環境下骨代謝異常的機制之一。此外既往研究發現，?；撬峥赏ㄟ^ERK1/2 信號途徑刺激成骨細胞的增殖和分化，且?；撬峥赏ㄟ^激活自噬減少骨量丟失，起到骨保護作用［20-21］。本研究中，?；撬岽x途徑在CKD-BD 組下調，提示CKD 病人?；撬岽x異?？赡軈⑴c了CKD-BD 的發展，進一步研究可關注外源性補充食物或藥物等物質對CKD骨骼的保護作用。

綜上所述，通過UHPLC-MS 技術比較CKD-BD大鼠與正常大鼠血清代謝產物，發現兩者發生明顯變化。CKD-BD 組大鼠血清中與細胞間信號傳遞的信號通路上調，提示CKD 狀態下細胞信息傳遞更為復雜。同時與自噬相關的代謝通路下調，可能是影響機體骨代謝水平、導致CKD-BD發生的機制之一。

（本文圖1見插圖3-5）