峨眉擬單性木蘭雄性不育的細胞形態學及生理生化特性研究

余道平 李策宏 李小杰 陳緒玲 謝孔平

摘 要： ???峨眉擬單性木蘭（Parakmeria omeiensis）是木蘭科（Magnoliaceae）擬單性木蘭屬（Parakmeria）的常綠喬木，屬于國家Ⅰ級保護的極度瀕危植物。為探究峨眉擬單性木蘭兩性花中雄性敗育發生的時期及花藥不同發育時期的生理生化特性，以兩性花中的不育雄蕊和雄花中的可育雄蕊為材料，利用石蠟切片觀察2種雄蕊的花藥發育過程，并測定不同發育時期的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量，分析過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）的活性。結果表明：（1）不育雄蕊與可育雄蕊在減速分裂時期出現明顯差異，不育雄蕊的絨氈層致密、沒有發育，四分體未形成，隨后解體，花粉囊中無花粉；可育雄蕊的絨氈層和小孢子母細胞發育正常，成熟時花粉囊開裂，花粉粒溢出。（2）不育雄蕊的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量，在減數分裂時期、單核期和花粉成熟期都顯著低于可育雄蕊。（3）不育雄蕊POD活性整體呈上升趨勢，在減數分裂時期、單核期和花粉成熟期都顯著高于可育雄蕊；不育雄蕊CAT活性整體呈下降趨勢，顯著低于同時期的可育雄蕊。綜上認為，兩性花中雄性敗育發生在減速分裂時期，其敗育的主要原因是物質能量代謝降低，絨氈層沒有進一步發育，不能給小孢子母細胞提供營養物質；過氧化氫酶及過氧化物酶的活性異常，造成細胞內不能及時清除自由基，使小孢子母細胞的減數分裂受阻，無法形成四分體。該研究結果為深入開展峨眉擬單性木蘭雄性不育的分子機制、性系統演化機制研究奠定了基礎。

關鍵詞： ?峨眉擬單性木蘭， 雄性不育， 花藥發育， 生理生化特性， 形態學

中圖分類號： ??Q944.5

文獻標識碼： ???A

文章編號： ??1000-3142（2024）01-0126-11

Cytomorphology， physiological and biochemical

characteristics of male sterility plant

in Parakmeria omeiensis

YU Daoping1，2，3，4*[KG-*3]， LI Cehong2，3，4， LI Xiaojie2，3，4， CHEN Xuling2，3，4， XIE Kongping1，2，3，4

（ 1. Sichuan Provincial Institute of Natural Resource Science， Chengdu 610041， China; 2. Emeishan Botanical Garden， Emeishan 614200，

Sichuan， China; 3. Wild Plants Sharing and Service Platform of Sichuan Province， Chengdu 610041， China; 4. Emeishan

Biodiversity Observation and Research Station of Sichuan Province， Emeishan 614200， Sichuan， China ）

Abstract： ??Parakmeria omeiensis an evergreen tree belonged to Parakmeria of Magnoliaceae， is listed as a critically endangered plant under the first-grade State protection. Aimed to clarify the abortion period of male sterility in bisexual flowers of P. omeiensis and its physiological and biochemical characteristics， sterile stamens of bisexual flower and fertile stamens of male flower were test materials， the anther development was observed by paraffin section， the contents of soluble sugar， soluble protein， proline were determined， and catalase （CAT） and peroxidase （POD） activities were analyzed. The results were as follows： （1）Significant difference were detected in meiosis stage in anther development between sterile stamens and fertile stamens， the tapetum layer of sterile stamens was dense and undeveloped， the microspore mother cells didnt develop into the tetrad and subsequently disintegrated， so the pollen sac was empty. The tapetum layer and the microspore mother cells of fertile stamens developed normally， most pollen sac were broken and pollen grain were export. （2）The contents of soluble sugar， soluble protein， proline of sterile stamens were significantly lower than fertile stamens during the stages of meiosis， microspore monuclear and pollen mature. （3） POD activity of sterile stamens increased overall and was significantly higher than fertile stamens during the stages of meiosis， microspore monuclear and pollen mature. CAT activity of sterile stamens decreased as a whole and was significantly lower than fertile stamens in the same stage. We conclude that the microspore abortion occurs at the stage of meiosis， the decrease in metabolism of material and energy causes the abortion of male in bisexual flowers， the tapetum layer dont develop further and it doesnt provide nutrients to the microspore mother cells. CAT and POD activities are abnormal which results in the failure of timely scavenging free radicals in cells， and meiosis of microspore mother cells is blocked， so tetrads fail to be formed.

Key words： ?Parakmeria omeiensis， male sterility， anther development， physiological and biochemical characteristics， cytomorphology

植物雄性不育（male sterility，MS）是指植物體不能產生正常有功能的花粉、花藥或雄配子的遺傳現象（范彥君等，2016）。國內外研究者分別從細胞發育、生理生化特性和分子生物學等領域對植物雄性不育材料進行了大量研究，并在禾本科（沈亞琦等，2022）、茄科（呂曉菡等，2015；雷剛等，2022）和十字花科（唐鑫等，2021）等多種作物上取得了一系列新進展，闡明了這些農作物雄性不育發生敗育的時期、細胞學特征及其基因對雄性不育的調控作用。但是，對木本植物的研究相對較少，并且局限在細胞形態學和生理生化等初步研究上（張博等，2015；劉望舒等，2019；周洋等，2020）。目前，有關木蘭科植物的生殖發育研究以觀察大小孢子和雌雄配子體發育的細胞形態為主，探索了小孢子敗育發生的時期和細胞學特征（譚金桂等，2007；王亞玲和張壽洲，2008；趙興峰等，2008；張鳳娟等，2008；潘麗琴等，2021）。對甜瓜（Cucumis melo）、高羊茅（Festuca arundinacea）和紫花苜蓿（Medicago sativa）等雄性不育材料的可溶性糖、蛋白質和脯氨酸等物質含量的研究表明，在不育株材料花器官中，出現物質代謝水平降低、脯氨酸虧損現象（盛云燕等，2016；陳偉等，2017；王瑩等，2018）。小麥（Triticum aestivum）和大豆（Glycine max）等不育材料花器官中過氧化氫酶（catalase， CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性多數低于可育材料，而過氧化物酶（peroxidase， POD）活性高于或低于可育材料，差異較大（劉子涵等，2017； 楊龍樹等，2017）。

峨眉擬單性木蘭（Parakmeria omeiensis）為木蘭科（Magnoliaceae）擬單性木蘭屬的常綠喬木，成樹高為20～25 m。為峨眉山特有種，分布于海拔1 100～1 500 m的常綠闊葉林中，個體數量不到100株，被列為國家一級重點保護野生植物（國家林草局 農業農村部，2021），被世界自然保護聯盟（IUCN）紅色名錄列為極度瀕危物種（IUCN，2022），是我國亟待拯救保護的120種極小種群野生植物之一（國家林業局，2012年）。峨眉擬單性木蘭為雄花兩性花異株（胡先骕和鄭萬鈞，1951；劉玉壺等，1995），是木蘭科植物中兩性花向單性花過渡的中間類型（徐鳳霞，1998，2002）。因此，開展峨眉擬單性木蘭花發育的研究對探討該種的性別分化、木蘭科植物的系統演化具有重要意義。

目前，有關峨眉擬單性木蘭的研究涉及種群特征 （莊平等，1993）、開花物候及繁育系統（余道平和李策宏，2017）、組織培養技術（陳英和馬明東，2008；余道平等，2011）、野外回歸及遷地保育（余道平等，2010；余道平和李策宏，2017；Yu et al.，2020）。在我們前期的初步觀察中，發現峨眉擬單性木蘭兩性花中的花藥不開裂，無花粉，雌蕊發育正常，能受精結實，屬于雄性不育，“兩性花”在生理上實屬單性（雌性），為隱形雌雄異株，繁育系統為專性異交（余道平和李策宏，2017）。然而，關于該種花發育的細胞形態學、雄性不育機制尚不清楚。因此，本研究以兩性花中的不育雄蕊和雄花中的可育雄蕊為材料，采用石蠟切片觀察兩種雄蕊的花藥發育過程，并測定不同發育時期可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量，分析過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）的活性，通過對兩種雄蕊的細胞發育結構、生理生化特性的比較研究，擬探討：（1）兩性花的雄性敗育發生時期；（2）絨氈層發育是否影響小孢子敗育；（3）兩性花的雄性敗育與其物質代謝、過氧化酶活性的關系。旨在探討兩性花雄性不育的時間和原因，為后續深入開展峨眉擬單性木蘭雄性不育的分子機制、性系統演化機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料均采自峨眉山植物園內峨眉擬單性木蘭雄性不育株（功能性雌株）和雄性可育植株（雄株）。植物園內的峨眉擬單性木蘭種群為1989—1993年從峨眉山野外海拔1 200～1 500 m采集的種子培育而成，目前已有25株進入開花期。該植物園位于103°22′ E、29°35′ N，海拔800 m，屬于亞熱帶濕潤季風氣候，年均氣溫為17.3 ℃，絕對最高溫度為34 ℃，絕對最低溫度為-3 ℃，年均降水量為1 555.3 mm，年均相對濕度為85％，年日照時數為1 398 h，無霜期為300 d。

1.2 方法

1.2.1 細胞發育觀察 ?在2020 年11月至2021年4月底， 每7 d取1次峨眉擬單性木蘭花芽3～5個，剝離出雄蕊保存于固定液FAA ［V（70％乙醇）∶V（冰乙酸）∶V（甲醛）＝18∶1∶1］中，并抽真空。采用常規石蠟制片方法，切片厚度 6～8 μm，先用番紅—固綠（Safranin-Fast Green）對染法進行染色、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、樹膠封片，再用Olympus BX251光學顯微鏡觀察，并照相。

1.2.2 生理生化指標測定 ?隨機采集兩性花株和雄株不同發育時期的花蕾，根據花蕾的形態特征，結合鏡檢結果及發育時間將其分為小孢子母細胞時期（花蕾縱徑2.0～2.5 cm）、減數分裂時期（花蕾縱徑2.6～3.6 cm）、單核時期（花蕾縱徑3.7～4.8 cm）、花粉成熟期（花蕾縱徑≥5.0 m）4個發育時期，液氮速凍， -80 ℃冰箱保存待測?？扇苄缘鞍缀?、可溶性糖含量及游離脯氨酸含量的測定方法參照王三根（2017）的植物生理學實驗教程。采用試劑盒測定樣品CAT、POD的含量，試劑盒來自上海索橋生物有限公司，按照試劑盒使用說明書進行測定，每個樣品重復測定3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 雄蕊形態結構

峨眉擬單性木蘭為單花頂生，具佛焰苞1枚，花被片9～12枚，分內、中、外3層，乳白色。 雄花具雄蕊34～42枚，長2.0～2.5 cm，寬2.0～2.5 mm，花絲鮮紅色，花藥飽滿，花粉量多，成熟時內向開裂散粉（圖1：B）；兩性花具雄蕊18～25枚，長1.5～1.8 cm，寬2.0～2.4 mm，較雄花的短小且扁化，花絲紅棕色，花藥隔紫色，不開裂，綠色的雌蕊群呈橢圓狀卵圓形，具短柄（圖1：A，C）。

2.2 花藥不同發育時期的顯微結構

2.2.1 小孢子母細胞時期

可育花藥從外到里依次為表皮1層、藥室內壁2層、中層2層和絨氈層l～2層，絨氈層細胞核大、染色深，單核、雙核或多核；小孢子母細胞呈多邊形，排列緊密，胞質濃厚（圖2：A）。不育花藥與可育花藥的形狀差別不大，從外到里也由表皮1層、藥室內壁2層、中層2層和絨氈層l～2層組成，但絨氈層細胞排列不整齊、體積較可育的絨氈層小、多為單核（圖2：G）。

2.2.2 減數分裂期 ?可育花藥減數分裂前期，中層細胞開始解體， 絨氈層細胞發達， 胞質濃厚， 排列整齊規則，緊貼中層細胞；小孢子母細胞細胞質濃縮，染色質開始凝聚，隨后染色體變短變粗，開始向赤道板移動，細胞質發生縊裂，不伴隨細胞板的形成（圖2：B；圖3：A，B），第2次減數分裂完成后形成4核，并被共同的胼胝質包圍，減數分裂為修飾性同時型。不育花藥的中層細胞此時已呈線性，絨氈層細胞膨大、排列不規整，與位于藥隔部位的花藥壁脫離，此時小孢子母細胞細胞質與細胞核發生收縮，無細胞形態，減數分裂異常（圖2：H），細胞出現多極紡錘體（圖3：F）、染色體橋（圖3：D）、染色體落后（圖3：E）、染色體提前分向兩極（圖3：C）、染色體不均等分裂（圖3：G，H）等現象。

2.2.3 四分體時期 ?可育花藥的小孢子從胼胝質壁中釋放出來時，中層解體成線形，絨氈層開始退化，在四分體后期，整個絨氈層細胞染色較深，細胞形態消失，排列不規則，細胞核與細胞質界限不明顯，最后與藥室內壁脫離；四分體小孢子的排列方式多為四面體形（圖2：C）。不育花藥中層完全解體，絨氈層沒有發育，還是整體在一起，并與藥室內壁緊密粘在一起，小孢子繼續收縮成“骨形”，開始解體，不能形成四分體（圖2：I； 圖3：J）。

2.2.4 小孢子單核時期 ?可育花藥絨氈層開始解體，分泌胼胝質酶，分解圍繞四分體周圍的胼胝質壁，釋放出單核小孢子，常呈球狀或橢圓形，細胞質較濃，細胞核位于中央。隨后細胞質逐漸變淡，液泡化現象逐漸明顯，小液泡匯集成一個大液泡，核及細胞質被擠到細胞的邊緣，成為單核靠邊期（圖2：D）。不育花藥絨氈層細胞致密，染色深，退化異常，小孢子母細胞開始解體（圖2：J； 圖3：I，J）。

2.2.5 雙核及花粉粒成熟時期 ?雙核花粉粒形成時，絨氈層細胞質已基本耗盡，僅留有細胞壁結構，藥室內壁細胞內向壁出現纖維狀加厚（圖2：E），成熟的花粉粒表面有刺突，絨氈層完全降解（圖2：F） 。不育花藥絨氈層薄壁細胞溶解，填充花粉囊，小孢子母細胞繼續解體，逐漸消失（圖2：K），致使整個藥室內無花粉粒的產生，形成空殼（圖2：L； 圖3：K，L）。

2.3 生理生化指標測定結果

2.3.1 花藥不同發育期營養物質含量 ?不育雄蕊和可育雄蕊花藥發育過程中可溶性蛋白含量的變化如圖4：A所示?？扇苄缘鞍缀吭诓挥廴镏谐氏陆第厔?，在可育雄蕊中呈先升后降趨勢。在小孢子母細胞時期，不育雄蕊略低于可育雄蕊，差異不顯著；在減數分裂期、單核時期和花粉成熟期，不育雄蕊顯著低于同時期可育雄蕊。隨著花藥的發育，不育雄蕊和可育雄蕊的可溶性糖含量呈遞增趨勢，且在花藥發育各時期，不育雄蕊的可溶性糖含量都低于可育雄蕊（圖4：B）。在小孢子母細胞時期，不育雄蕊和可育雄蕊的可溶性糖含量差異不顯著；在減數分裂期、單核期、花粉成熟期差異顯著。不育雄蕊和可育雄蕊中的游離脯氨酸含量隨花藥的發育先增加后減少 （圖4：C）。在小孢子母細胞時期，不育雄蕊的游離脯氨酸含量顯著高于可育雄蕊，是可育雄蕊的1.2倍；但在減數分裂期、單核花粉期和花粉成熟期，不育雄蕊顯著低于可育雄蕊。

2.3.2 花藥不同發育期POD和CAT的活性 ?隨著花藥的發育，不育雄蕊中的POD活性總體呈遞增趨勢，而可育雄蕊的POD活性總體呈遞減趨勢（圖5：A）。在減數分裂時期、單核期、花粉成熟期，不育雄蕊的POD活性都顯著高于可育花藥， 分別是可育花藥的1.23倍、1.93倍和2.28倍?；ㄋ幇l育后2個時期不育雄蕊和可育雄蕊的POD活性差距非常大。

不育雄蕊和可育雄蕊的CAT活性均隨花藥發育呈先升后降趨勢（圖5：B）。在小孢子母細胞時期，兩者差距不顯著；在減數分裂時期、單核期、花粉成熟期，不育雄蕊的CAT活性顯著低于可育雄蕊；不育雄蕊CAT活性在減數分裂期升高， 在單核花粉期開始下降?？捎廴顲AT活性在減數分裂期顯著升高， 在單核花粉期和花粉成熟期逐漸下降。

3 討論與結論

3.1 峨眉擬單性木蘭兩性花中雄性敗育的時期及原因

一般認為雙子葉植物花粉敗育高峰多發生在造孢細胞至四分體時期，單子葉植物則多發生在花粉發育的單核期至二核期（朱英國，2000）。在已報道的木蘭科瀕危植物小孢子發育研究中，其花粉敗育時期表現多樣化，可發生在次生造孢細胞、花粉母細胞、減速分裂、四分體、單核等多個時期（譚金桂，2007；王亞玲和張壽洲，2008；趙興峰等，2008；張鳳娟等，2008；潘麗琴等，2021）。本研究發現，峨眉擬單性木蘭雄性敗育發生在小孢子母細胞減數分裂時期，即花粉母細胞到四分體這個階段，這與瀕危植物西疇含笑（Michelia coriacea）和天女木蘭（Magnolia sieboldii）小孢子敗育的時間一致（趙興峰等，2008；張鳳娟等，2008 ）。不同的雄性不育類型具有不同的敗育表現形式，由于敗育發生的早遲，因此把雄性不育性分為5種表現型，即雄蕊退化或變形、花藥異常、孢子囊退化、小孢子退化和花粉功能缺陷（Preuss et al.，1993）。結合峨眉擬單性木蘭兩種雄蕊的形態結構和花藥發育過程的比較，可以得出其雄性不育類型應為孢子囊退化型，即小孢子母細胞不能進行正常的減數分裂，無法形成四分體，致使花藥內沒有花粉。

多數學者認為，絨氈層的異常發育與雄性不育有關，絨氈層作為花粉囊壁的最內層，包圍著花粉母細胞或小孢子，對花粉的發育和形成起著重要作用（范彥君等，2016；雷剛等，2022）。絨氈層的提前或延遲解體均會影響小孢子的發育，郭瑛琪等（2021）發現大白菜不育花藥絨氈層細胞異常膨大，嚴重空泡化，提前降解，小孢子因變形干癟而死亡，花藥不育與絨氈層提前發生細胞程序性死亡有關，從而影響小孢子進一步發育的營養供應。在峨眉擬單性木蘭不育花藥的小孢子母細胞時期，絨氈層細胞排列不規整，多為單核，在隨后的發育過程中，絨氈層細胞膨大、排列緊密，與位于藥隔部位的花藥壁脫離，沒有進一步發育，不能為小孢子母細胞提供所需要的營養，致使小孢子母細胞減速分裂異常。這說明峨眉擬單性木蘭兩性花雄性不育可能是由絨氈層的異常發育引起的，而絨氈層發育異常的原因還需要進一步研究。

小孢子母細胞減數分裂是維持小孢子正常發育的重要過程。前人對杉木（Cunninghamia lanceolata）（李亞鵬等，2023）、厚軸茶（Camellia crassicolumna）（蔣會兵等，2020）、白楊（許重陽，2011）等不育系材料的研究結果表明，花粉母細胞減數分裂過程出現問題會導致花粉敗育。本研究觀察到雄性不育的小孢子母細胞減數分裂過程中存在滯后染色體、染色體橋、不均等分離等較多異?，F象，說明峨眉擬單性木蘭小孢子母細胞減數分裂過程中染色體異?？赡苁菍е滦℃咦訑∮脑蛑?。

3.2 雄性不育與物質代謝、抗氧化酶活性的關系

小孢子在發育過程中需要積累大量的蛋白質、氨基酸、淀粉和糖類物質等營養物質， 這些物質的虧損可能對雄性不育的發生起到誘導作用。大量研究發現雄性不育系與其可育系的含糖量及蛋白質含量存在顯著差異， 多數可育系的營養物質含量高于不育株（陳偉等， 2017；王瑩等，2018；周濤等，2022）。本研究發現，隨著峨眉擬單性木蘭花藥的發育，可溶性糖、可溶性蛋白質、脯氨酸的含量在不育花藥中都低于可育花藥，特別是在單核期、花粉成熟期的含量兩者差距更大，這些生理代謝上的異常與小孢子母細胞敗育關系密切。

植物抗氧化酶的活性與植物雄性不育密切相關。厚軸茶雄性不育株花蕾發育過程中POD活性升高，各發育時期都顯著高于可育株；而不育株SOD和CAT的活性呈降低趨勢（蔣會兵等，2020）。西瓜和玉米的雄性不育株在花蕾發育過程中POD活性顯著升高，CAT活性明顯降低（王永琦等 2016；周國昌等2018）。不育系的POD活性顯著上升會引起吲哚乙酸類物質分解，造成IAA虧損，引起不育系內源激素含量的變化或使激素平衡體系受到破壞，從而使調節功能紊亂，物質合成或調運的不足使雄蕊活性偏低，最終導致雄性器官不育（馮小磊等，2012；劉子涵等，2017；楊龍樹等，2017）。本研究發現，峨眉擬單性木蘭不育花藥的POD 活性在各發育時期都高于可育花藥，整體呈上升趨勢；而CAT活性整體呈遞減趨勢，顯著低于可育花藥，這可能會造成活性氧的積累，因對小孢子母細胞的發育產生毒害而造成敗育，這與以上報道的結果基本一致。

3.3 兩性花中雄性不育的生殖策略

擬單性木蘭屬的花一直被認為是雄花兩性花異株（胡先骕和鄭萬鈞，1951；劉玉壺等，1995），本研究在細胞結構和生理生化基礎上進一步證實了峨眉擬單性木蘭實為隱形雌雄異株，這是比木蘭科中木蓮屬、含笑屬兩性花植物較為進化的特征。一些瀕危植物通過選擇性敗育來提高后代的適合度，可能是生長在資源貧乏的環境下，在長期進化過程中形成的一種生殖保障（徐濤等，2012）。

新疆阿魏（Ferula sinkiangensis）雄性不育植株通過功能性雌花的花藥敗育，減少了對雄蕊的資源投入，而將植株能量用于形成雌蕊、產生更多的雌花，以生產更多的異交后代（何爽和譚敦炎，2022）。從我們的野外調查來看，峨眉擬單性木蘭野外種群分布區域狹窄，生長在懸崖峭壁上，環境資源非常有限。峨眉擬單性木蘭兩性花中的雄性選擇敗育，為雌蕊和胚珠的正常發育提供了充足營養，有利于生殖取得成功。雌株需從雄株上獲取正?；ǚ蹃硗瓿墒诜矍医Y實，這種專性異交的繁育系統促進了居群的雜種優勢作用，可以提高后代對惡劣環境的抵抗力。雄性不育的兩性花植株與雄全異株個體共存的性系統體現了峨眉擬單性木蘭特有的資源配置模式。然而，這種雄性不育是由環境因素引起還是由基因決定，這個問題還有待進一步深入研究。

綜上所述，通過對峨眉擬單性木蘭兩種雄蕊的細胞發育結構、部分生理生化特性的比較研究，發現小孢子母細胞減數分裂的異常是導致兩性花中雄性不育的主要原因。不育雄蕊在不同發育時期的可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量偏低，POD活性升高，CAT活性降低，與可育雄蕊之間存在顯著性差異，說明它們的異?？赡芘c兩性花中的雄性不育存在相關性。今后還有待于從激素、分子等方面對峨眉擬單性木蘭雄性不育機理開展進一步研究。

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（ 責任編輯 蔣巧媛 ）

基金項目： ??四川省重點研發項目（2023YFS0378）； 2022年中央級公益性科研院所基本科研業務費項目； 國際植物園保護聯盟項目（BGCI30414）。

第一作者： ?余道平（1978-），碩士，副研究員，主要從事珍稀瀕危植物的保育研究，（E-mail）550265856@qq.com.