雙氫鏈霉素未知雜質的結構確證與限值設定

趙建強 賈欣秒

摘?要：

為了科學制定雙氫鏈霉素產品中未知雜質的限度標準，從分子結構、來源和質量穩定性等3個方面開展研究。首先，采用制備色譜儀從雙氫鏈霉素產品中制得雜質純品，借助液相色譜-高分辨質譜（LC-HRMS）和核磁共振譜（NMR）進行波譜分析、研究雜質分子結構；其次，采用高效液相色譜法（HPLC），結合雙氫鏈霉素生產過程開展雜質來源考察；最后，設計了多條件的影響因素實驗，考證雜質的穩定性。結果表明：雜質分子結構與雙氫鏈霉素的分子結構類似，同屬氨基糖苷類物質；雜質來源于雙氫鏈霉素發酵階段產生的鏈霉素類似物，類似物在氫化過程被同步還原成為產品中的雜質；雜質對酸、堿、高溫、氧化、光照等因素不敏感，具有較好的穩定性。由鏈霉素發酵代謝產生的相關性雜質穩定性較好，設定其限度標準為≤1.0%（峰面積分數）是安全、合理的，可為臨床用藥提供重要參考。

關鍵詞：

色譜分析；雙氫鏈霉素；結構確證；雜質限度；臨床用藥

中圖分類號：

R917

文獻標識碼：A

DOI： 10.7535/hbgykj.2024yx01008

Structure elucidation and limit setting of unknown impurity of dihydrostreptomycin

ZHAO Jianqiang1， JIA Xinmiao2

（1North China Pharmaceutical Huasheng Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 0521602， China; 2North China Pharmaceutical Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 050015， China）

[HQK]Abstract：

In order to scientifically establish the limit standard of unknown impurity in dihydrostreptomycin products， the study was conducted from three aspects： molecular structure， source and quality stability. Firstly，preparative chromatography was used to prepare pure impurity from dihydrostreptomycin， and LC-HRMS and NMR techniques were used for chromatographic analysis to study the molecular structure of impurities. Secondly， the impurity source was investigated by HPLC method combined with the dihydrostreptomycin production process. Finally， experiments of various influencing factors were designed to verify the quality stability of the impurity. The results show that the molecular structure of the impurity was similar to that of dihydrostreptomycin and belonged to aminoglycoside. The impurity was derived from the streptomycin analogue produced in the fermentation stage of dihydrostreptomycin， which becomes the unknown impurity of dihydrostreptomycin product through hydrogenation reduction. The impurity is not sensitive to acid， alkali， high temperature， oxidation， light and other factors， and has good stability. The related impurity produced by streptomycin fermentation metabolism has good stability， and it is safe and reasonable to set the limit standard that the peak area fraction is less than or equal to 1.0%， which provides important reference value for clinical medication.

Keywords：

chromatography analysis; dihydrostreptomycin; structure elucidation; limit of impurity; clinical medication

雙氫鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素，對結核桿菌和多種革蘭氏陰性桿菌有抗菌作用，在全球范圍內廣泛用于治療家畜細菌性疾病。雙氫鏈霉素是鏈霉素經過氫化得到的衍生物，而鏈霉素又是由傳統微生物發酵法生產獲得，即在特定的發酵培養條件下，鏈霉素生產菌株通過次級代謝合成鏈霉素，此代謝過程會同步合成少量與鏈霉素結構近似的雜質，雜質與鏈霉素結構相似度越高，越難于去除，因此鏈霉素發酵液雖經過多個工序提取純化，但仍有少量雜質殘留于產品中。華北制藥華勝有限公司提供的雙氫鏈霉素樣品，經高效液相色譜法（HPLC）檢測發現主峰后有一未知雜質，其殘留水平約為0.6%（峰面積分數，下同），HPLC譜圖見圖1。

2013年6月，歐盟EMA發布了《制訂抗生素有關物質標準的指導原則》[1]（以下簡稱歐盟EMA抗生素雜質指南）。該指南在國際上首次闡述了抗生素類藥品雜質控制策略和要求：針對發酵類獸用抗生素，應對超過0.5%的未知雜質開展結構確證研究，并結合雜質分子結構信息制定合理的限度標準。

歐洲藥典中，已收載的雙氫鏈霉素已知雜質包括鏈霉胍、雙氫鏈霉素B、雜質C等，其他未知雜質尚未載明分子結構及限度標準[2]。近年來，國內外對雙氫鏈霉素未知雜質多有研究，諸多學者借助現代色譜技術對多種藥品開展了雜質研究[3-13]，并提出了控制思路與策略，但未見對該雜質的研究和報道。用藥安全性是評價藥品的首要指標，而未知雜質又是影響用藥安全性的關鍵因素，這已成為當前藥品上市前審評和藥政監管的共識。為了科學制定雜質限度標準，須對其開展系統的質量研究，徹底明晰雜質的分子結構、來源途徑和質量穩定性等情況，以便醫生臨床用藥時參考。本研究借助LC-HRMS、NMR等波譜技術，分析確證該雜質的分子結構，采用HPLC考察其來源，并設計多種影響因素實驗來評價它的質量穩定性。

1?材料和儀器

1.1?樣品與試劑

雙氫鏈霉素產品及各步中間體樣品，由華北制藥華勝有限公司提供；乙腈、甲醇、三氟乙酸、辛烷硫酸鈉，均為色譜純試劑，由賽默飛世爾科技公司提供；磷酸二氫鉀、磷酸、無水硫酸鈉，均為分析純試劑，由天津永大化學試劑有限公司提供。

1.2?儀器設備

制備色譜儀NU300-NP7000，由江蘇漢邦科技有限公司提供；Thermo Vanquish-Q Exactive液相色譜質譜聯用儀，由賽默飛世爾科技公司提供；Agilent 400 MR 超導脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀，由安捷倫科技有限公司提供；Waters 2695高效液相色譜儀，由沃特世科技（上海）有限公司提供；分析天平AG285、酸度計SevenEasy，由梅特勒-托利多科技（中國）有限公司提供。

2?方法和結果

2.1?雜質的制備與結構確證

2.1.1?雜質的制備

取雙氫鏈霉素適量，加水配制成質量濃度約為50 mg/mL的水溶液，用0.45 μm濾膜過濾，后采用制備色譜儀NU300-NP7000分離制備。色譜條件：色譜柱為Unisil 10-120 PFP（50 mm×250 mm，10 μm）；流動相為0.2%（體積分數）三氟乙酸水溶液；流速為100 mL/min；柱溫為常溫；檢驗波長為205 nm；進樣體積為2 mL；運行時間為15 min。目標峰保留時間約為10.8 min（色譜分析結果見圖2），按照出峰時間收集雜質組分，凍干即得到峰面積分數（純度）為93.6%的雜質品。

2.1.2?液相色譜-高分辨質譜（LC-HRMS）分析

將“2.1.1”項所得的雜質品采用電噴霧電離（ESI）進行質譜分析，在正離子模式下進行一級質譜全掃描，獲得譜圖數據如圖3所示。

通過LC-HRMS測試，獲得雜質游離態準分子離子峰[M+H]+的m/z為598.302 73，高分辨質譜計算其分子式為C22H43N7O12；[M+H]+的m/z為598.302 73，通過ddMS2模式進行二級質譜分析，得到的主要碎片離子m/z為263.145 29、190.106 78等，推測其裂解途徑見圖4。

2.1.3?核磁共振譜（NMR）分析

對雜質品進行一維和二維NMR測試，獲得的1H-NMR譜中共給出了27組氫信號，無活潑氫；13C-NMR譜中共給出了22組碳信號，代表22個碳原子，將碳氫數據進行歸屬，結果見表1。

2.2?雜質來源與影響因素

2.2.1?HPLC色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液，其制備方法：稱取無水硫酸鈉4.6 g、辛烷磺酸鈉1.5 g，用848 mL水溶解，加入色譜純乙腈102 mL、質量濃度27.2 g/L的磷酸二氫鉀溶液50 mL，混合均勻后備用；流速為1.0 mL/min；柱溫為45 ℃；進樣體積為20 μL；檢測波長為205 nm；運行時間為80 min。

2.2.2?雜質流程考察

以鏈霉素發酵液為起始點，經預處理得到中間體1，再經樹脂提取、提純分別得到中間體2和中間體3，鏈霉素被氫化還原為雙氫鏈霉素得到中間體4，再經精制得到中間體5，最后干燥得到產品。用HPLC檢測發酵液、5種中間體和成品，所得數據繪制未知雜質來源與變化趨勢圖，見圖5。

2.3?影響因素實驗

取適量雙氫鏈霉素樣品3份：1份溶于5 mL、0.5 mol/L的鹽酸溶液，放置30 min；1份溶于5 mL、0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，放置30 min；1份溶于5 mL水中，加入2.0 mL、60％（質量分數）的雙氧水，放置30 min；分別考察雜質在酸、堿和氧化條件下的穩定性。另取2份雙氫鏈霉素樣品：1份置于光照箱內，照度為（4 500±500）lx，放置10 d；另1份置于密封容器中，恒溫60 ℃，放置10 d；分別考察雜質對高溫和光照的穩定性。待實驗結束，樣品經HPLC檢測，其數據匯總于表2。

3?討?論

3.1?未知雜質的分子結構

通過LC-HRMS測試，獲得未知雜質游離態準分子離子峰[M+H]+的m/z為598.302 73，高分辨質譜計算其分子式為C22H43N7O12；通過一維和二維NMR測試，對1H-1HCOSY、HSQC、HMBC核磁數據進行綜合分析，結合降解機理推斷出雜質的分子結構，見圖6。

從雜質的分子結構可知，它同屬于氨基糖苷類，雙氫鏈霉素分子結構中含有N-甲基-L-葡萄糖胺，而雜質分子結構中含有N，N-二甲基-L-葡萄糖胺，即N位上一個氫基被甲基取代，可以推斷該雜質是一種工藝雜質，非降解雜質。

3.2?雜質的來源

雜質在生產過程的變化趨勢表明，雜質在發酵液中含量最高，之后逐步減少，可見該雜質來源于微生物發酵階段，是與主組分鏈霉素具有近似結構微生物的代謝物。鏈霉素的生物合成機制已經很清晰[14-15]，其分子結構由鏈霉胍、鏈霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺3個部分組成。在N-甲基-L-葡萄糖胺的生物合成過程中，首先L-葡萄糖胺在S-腺甘酰甲硫氨酸條件下發生甲基化反應，生成N-甲基-L-葡萄糖胺，該反應進一步甲基化，可生成副產物N，N-二甲基-L-葡萄糖胺，副產物進一步與鏈霉胍、鏈霉糖結合可得到一種特定雜質，其分子結構如圖7所示。

該特定雜質與雙氫鏈霉素未知雜質相比，可發現：特定雜質分子結構中的鏈霉糖上有一個醛基，而雙氫鏈霉素未知雜質的分子結構中是一個羥基。由此可推斷，鏈霉素氫化成雙氫鏈霉素時（化學反應式見圖8），該特定雜質分子結構上的醛基同步被氫化還原為羥基，生成雙氫鏈霉素產品中的雜質。

3.3?雜質的穩定性

通過影響因素實驗研究發現，雜質在60 ℃高溫條件下長時間放置，含量略有降低，比原樣降低了0.04個百分點；在酸、堿、氧化等其他條件下，雜質含量基本無變化。主組分雙氫鏈霉素在酸、堿和氧化條件下，與雜質相比其含量呈現出一定的降低趨勢，這也佐證了該雜質屬于工藝雜質，而非降解雜質，這與雜質在生產過程中的變化趨勢一致。另外，從雜質分子結構看，N-甲基-L-葡萄糖胺N位上的氫基被甲基取代后，形成的二甲基結構是穩定的，對酸、堿和氧化等條件具有更強的耐受性。

3.4?雜質的限度設定

經結構確證可知，雜質是與主體化合物雙氫鏈霉素結構相關的雜質，即雙氫鏈霉素的一個氫原子被甲基取代。從分子結構看，雜質無基因毒性警示結構，不存在基因毒性風險[16-17]?？紤]到產品中雜質的實際殘留水平未超出藥典規定的其他已知雜質≤1.0%的限度標準，又鑒于雜質分子結構已明確、無基因毒性且化學性質穩定，可設定其限度標準為≤1.0%，這既能保證用藥的安全性，又能滿足歐盟EMA抗生素雜質指南的控制要求。

4?結?語

本文借助HPLC、LC-HRMS和NMR等波譜技術，研究獲得了雙氫鏈霉素產品中超標雜質的分子結構、來源和影響因素等信息，為制定雜質限度標準提供了客觀依據。

從分子結構確證結果看，雜質與雙氫鏈霉素同屬于氨基糖苷類，沒有基因毒性警示結構及用藥風險。雜質來源考察證實，鏈霉素微生物發酵階段產生一種鏈霉素類似物，類似物經氫化得到產品中的雜質，屬于典型的工藝雜質。在影響因素實驗條件下，雜質含量基本無變化，具有較好的穩定性，在藥品貯存或臨床用藥時，不易受外部因素影響而降解?；诖?，可將該雜質作為一個已知雜質來控制，其限度標準設定為≤1.0%。

未來還需進一步研究鏈霉素發酵工藝，改善微生物代謝過程，從源頭上減少雜質的生成，不斷提高雙氫鏈霉素產品的純度。

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收稿日期：2023-09-08;修回日期：2023-12-06；責任編輯：王海云

第一作者簡介：

趙建強（1976—），男，河北蠡縣人，高級工程師，主要從事抗生素質量控制與管理方面的研究。

通信作者：

賈欣秒高級工程師。E-mail：3265804@qq.com

趙建強，賈欣秒.

雙氫鏈霉素未知雜質的結構確證與限值設定

［J］.河北工業科技，2024，41（1）：63-68.

ZHAO Jianqiang，JIA Xinmiao.

Structure elucidation and limit setting of unknown impurity of dihydrostreptomycin

［J］. Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2024，41（1）：63-68.