膠體金免疫層析試驗在梅毒抗體檢測中的價值及適用范圍研究

石杜娟

梅毒作為一種可引起人體皮損和多系統多器官損傷的性傳播疾病，近些年來有逐漸上升的趨勢[1］。2023年1 月的全國法定傳染病疫情概況中顯示報告發病數居前5 位的病種中，梅毒位列第三；當月梅毒發病人數達到28 708 人，為性傳播疾病之首[2］。梅毒早期感染較隱匿，癥狀不明顯，而梅毒的早發現和早干預可有效預防梅毒期的進展。目前臨床常用于梅毒螺旋體抗體篩查實驗多為化學發光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、光激化學發光法（lightinduced chemiluminescence immunoassay，LICA）、酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA）。而梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（treponema pallidum antibody，TPPA）常作為梅毒螺旋體抗體的確認試驗[3］。偏遠和社區基層檢測點多采用膠體金免疫層析試驗（gold immunochromatography assay，GICA）作為初篩方法[4］。本文以TPPA 結果作為金標準，擬通過比較GICA 法與常用的初篩試驗（ELISA、LICA、CLIA）的性能指標、一致性分析、受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積、以及與該3 種方法的不同S/CO 值（樣本吸光值/臨界值）分區范圍的符合率比較，以此探尋膠體金免疫層析法在診斷梅毒中的價值和適用范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2022 年2～5 月合肥市濱湖醫院住院患者、門診就診者以及體檢者共143 人份血清標本，采用5 種不同方法學試劑進行梅毒螺旋體抗體的平行檢測。以TPPA 為金標準，119 例TPPA 陽性作為疑似梅毒組，年齡1～91 歲。24 例TPPA 陰性為非梅毒組，年齡分布1～71 歲。兩組受試者的一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。梅毒診斷標準參照衛生部的《梅毒診斷標準（中華人民共和國衛生行業標準）WS 273-2018》。本研究已通過醫院倫理委員會審批，倫理批文號：[2023（44）］。

表1 兩組患者一般資料分析

1.2 納入與排除標準 納入標準：①流行病學史或臨床表現符合梅毒特征；②既往梅毒實驗室血清學試驗陽性或快速血漿反應素試驗（rapid plasma regain test，RPR）陽性。排除標準：①合并血液高凝狀態的疾??；②合并類風濕性關節炎；③臨床信息不詳。

1.3 方法

1.3.1 儀器與試劑 CLIA 采用由深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司生產的邁瑞CL8000i 全自動化學發光分析儀、原裝配套試劑以及質控品；TPPA 試劑盒為日本富士瑞必歐株式會社產品；LICA 采用由北京科美生物技術有限公司生產的LICA 500 自動光激化學發光檢測儀，其配套試劑盒和質控品由博陽生物科技（上海）有限公司提供；ELISA 采用由上?？迫A生物工程股份有限公司生產的梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（酶聯免疫吸附法）；GICA 采用英科新創（廈門）科技股份有限公司生產的梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒（膠體金法）。

1.3.2 標本采集 被檢標本均為空腹采集肘靜脈血，以4 000 r/min 離心10 min 來分離血清，將血清凍存于-20°C。

1.3.3 結果判定

1.3.3.1 TPPA 檢測法 將血清稀釋液按100 μL、25 μL、25 μL、25μL 依次加入微孔板中的1～4 孔，再取25 μl 血清加至第一孔，然后依次從上一孔吸取25 μL 至下一孔。然后在第3 孔、第4 孔中分別滴入未致敏顆粒、致敏顆粒，混勻后室溫靜置2 h。結果為未致敏粒子（最終稀釋倍數1∶40）的反應圖象判定為梅毒螺旋體抗體陰性，致敏粒子（最終稀釋倍數1∶80 以上）的反應圖象判定為陽性時，最終判定為梅毒螺旋體抗體陽性。

1.3.3.2 GICA 檢測法 取100 μL 血清加入加樣區，18～22 min 內觀察結果：檢測線和對照線同時出現紅色條帶即為梅毒螺旋體抗體陽性，僅對照線出現紅色條帶為陰性。

1.3.3.3 ELISA 檢測法 取100 μL 待測樣本嚴格按照試劑盒說明進行，結果為：待測樣本的OD 值≥（陰性對照平均OD 值+0.1），待測樣本梅毒螺旋體抗體為陽性；待測樣本的OD 值＜（陰性對照平均OD 值+0.1），待測樣本梅毒螺旋體抗體為陰。

1.3.3.4 LICA 檢測法 樣本檢測嚴格按儀器的標準化操作進行，結果按試劑標準化操作規程判定：S/CO＜1.0 即待測樣本梅毒螺旋體抗體陰性，S/CO≥1.0 即待測樣本為梅毒螺旋體抗體陽性。

1.3.3.5 CLIA 檢測法 樣本檢測嚴格按儀器的標準化操作進行，結果按試劑標準化操作規程判定：S/CO＜1.0 即待測樣本梅毒螺旋體抗體陰性；S/CO≥1.0 即待測樣本為梅毒螺旋體抗體陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0 進行數據分析，偏態分布計量資料用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU方法檢驗。計數資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；不同試劑間的一致性分析采用Kappa 分析；采用MedCalc 軟件分析4 種檢測試劑的ROC 曲線對梅毒的診斷效果。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對各篩查試劑的性能評價 GICA 的特異度與ELISA 的特異度相比，差異有統計學意義（差值=0.292，差 值95%CI：5.42%～52.92%，χ2=5.169，P=0.049）；GICA 的特異度與LICA 的特異度相比，差異有統計 學意 義（差 值=0.292，差 值95%CI：5.42%～52.92%，χ2=5.169，P=0.049）；GICA 與CLIA 的特異度比較，差異有統計學意義（差值=0.625，差值95%CI：40.70%～84.30%，χ2=19.048，P＜0.001）；GICA 的陽性預測值（97.54%）與CLIA 陽性預測值（86.76%）比較，差異有統計學意義（差值=0.108，差值95%CI：4.45%～17.10%，χ2=9.988，P=0.002）。見表2。

表2 各篩查試驗性能評價

2.2 不同試劑間的符合率和一致性分析 GICA 和TPPA 的符合率與ELISA 和TPPA 的符合率相比，差異有統計學意義（差值=0.049，差值95%CI：0.10%～9.69%，χ2=3.949，P=0.047）； GICA 和TPPA 的符合率與LICA 和TPPA 的符合率相比，差異有統計學意義（差值=0.049，差值95%CI：0.10%～9.69%，χ2=3.949，P=0.047）；GICA 和TPPA 的符合率與CLIA 和TPPA的符合率相比，差異有統計學意義（差值=0.112，差值95%CI：5.15%～17.23%，χ2=12.606，P＜0.001）。ELISA 和GICA 的符合率與LICA 和GICA 的符合率一致，兩組分別與CLIA 和GICA 的符合率相比，兩組比較差異均有統計學意義（差值=0.077，差值95%CI：1.21%～14.18%，χ2=5.304，P=0.021）。見表3。

表3 不同試劑間的符合率和一致性性分析

2.3 5 種試劑檢測抗TP 抗體陽性結果的交叉示意圖可見CLIA 和LICA 均會出現單一試劑陽性的情況，以CLIA 最多（12 例）。同時TPPA（-）GICA（+）ELISA（+）LICA（+）CLIA（+）共2 例，TPPA（-）GICA（+）ELISA（+）LICA（+）CLIA（-）共1 例。GICA 和ELISA 無單獨陽性例數。CLIA 有1 例漏檢。見圖1。

圖1 5種試劑檢測抗TP抗體結果陽性的示意圖

2.4 GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 種檢測梅毒抗體的ROC 曲線分析 以TPPA 結果為金標準，采用MedCalc軟件繪制GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 種方法的ROC曲線。通過對4 種ROC 曲線的比較分析可見GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 種試劑曲線下面積（area under curve，AUC）差異無統計學意義（P＞0.05）。同過計算得出ELISA、LICA、CLIA 的最大約登指數分別為0.847、0.841、0.849，對應的S/CO 最佳臨界值分別為11.65、10.07、3.76。見圖2、表4。

圖2 以TPPA診斷為標準時4種試劑檢測TP抗體的ROC曲線

表4 四種試劑的ROC曲線比較結果

2.5 3 種梅毒檢測方法S/CO 值不同區間與GICA 的TPPA符合率比較

2.5.1 ELISA 法S/CO 值不同區間與GICA 的TPPA 符合率比較 按ELISA 的S/CO 值最低值（0.001）到最大值（32.78）分為4 個不同的范圍，以TPPA 為標準：S/CO 值在1.00～12.00 時，ELISA 與GICA 的TPPA 符合率比較，差異有統計學意義（差值=0.286，差值95%CI：2.65%～54.49%，χ2=4.200，P=0.040）；其他區間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 ELISA法S/CO值不同區間與GICA的TPPA符合率比較[例（%)］

2.5.2 LICA 法S/CO 值不同區間與GICA 的TPPA 符合率比較 按LICA 法檢測梅毒抗體的S/CO 值最低值（0.08）到最大值（657.83）分為5 個不同區段，以TPPA為標準： S/CO 值在1.00～10.00 時，LICA 與GICA 的TPPA 符合率比較，差異有統計學意義（差值=0.546，差值95%CI：21.43%～87.66%，P=0.024）；其他區段兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

2.5.3 CLIA 法S/CO 值不同區間與GICA 的TPPA 符合率比較 按CLIA 法檢測梅毒抗體的S/CO 值最低值（0.06）到最大值（14.98）分為6 個不同區段： S/CO 值在1.00～4.00 時，CLIA 與GICA 的TPPA 符合率比較，差異有統計學意義（差值=0.517，差值95%CI：31.57%～71.88%，χ2=17.611，P＜0.001）；其他區間兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。見表7。

表7 CLIA法S/CO值不同區間與GICA的TPPA符合率比較[例（%)］

3 討論

ELISA、LICA 和CLIA 是梅毒螺旋體免疫學診斷常用方法，這些方法易自動化和標準化，結果判定客觀。但是上述方法需要采購大型儀器設備，在基層和偏遠地區的應用受限。且隨著近些年來梅毒高居性傳播疾病的榜首，加上感染者由于心理和社會因素在有臨床癥狀時才來就診，易錯過感染早期治療。若疑似梅毒感染者能居家檢測后再到醫院做確認試驗，將有利于梅毒早期的檢出和治療。而GICA 可在血清、血漿、全血的模式下檢測梅毒螺旋體抗體，且可單人份獨立包裝、用血量少、操作簡便、結果判讀簡單。為了確定GICA 法能否達到醫院常規初篩梅毒抗體方法的性能指標，本文對不同試劑的性能指標進行了分析。結果GICA 的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值均優于ELISA、LICA、CLIA 這3 種方法。這可能與GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 種方法檢測原理不同或包被抗原不同有關。早在1996 年Gerber 等利用基因重組表達出不同的梅毒螺旋體抗原，用ELISA 檢測后發現TP47、TP17 和TP44.5 的抗體滴度最高，而且這3 種抗原聯合檢測的靈敏度要比單一任何一種抗原的靈敏度要高[5］。目前ELISA 檢測梅毒抗體多采用雙抗原夾心法，選取TP47、TP17、TP15 和TP45 抗原中的一種、兩種或多種抗原融合包被。而GICA 一般采用膠體金免疫檢測技術和層析原理。早在1998 年Young 等[6］將TP47、TP17、TP15 這3 種重組抗原聯合起來設計出梅毒螺旋體抗體快速診斷試劑盒。Mabey 等在評價4 種不同國家生產的GICA 試劑盒時發現其特異度均超過95.00%[7］。鄒冬梅等[8］采用GICA 對幼兒園從崗人員梅毒檢測時發現GICA 的靈敏度可達100.00%、特異度為96.40%。陳邦銳等[9］也指出GICA 的梅毒檢出率高達91.40%，建議獻血前加做GICA 初篩來降低血液報廢。周振興等[10］也發現了GICA 的靈敏度和特異度均大于ELISA，這與本次研究結果一致。但劉學政[11］在比較ELISA 與GICA 兩種方法時，發現GICA 的靈敏度（89.39%）、陰性預測值（74.07%）低于ELISA；而GICA 的特異度（90.91%）和陽性預測值（96.72%）與ELISA 的差異無統計學意義。這可能與他選擇的ELISA 試劑品牌與本文使用的品牌不一致有關。即使包被抗原相同，但各廠家在各種抗原的配比和工藝上會有差異，在檢測結果上也會有差異，主要體現在低值陽性標本上[12］。

LICA 由TP47、TP17、TP15 抗原分別包被的發光微粒、生物素標記TP47、TP17、TP15 抗原，在均相條件下，采用雙抗原夾心免疫光激化學發光法和免洗免分離技術檢測梅毒螺旋體抗體。有研究顯示梅毒螺旋體抗體LICA 法的靈敏度可達100.00%，特異度為99.35%[13］。官士珍等[14］在對LICA 法檢測梅毒抗體進行性能驗證時，發現LICA 與TPPA 的符合率為95.00%。本次試驗結果LICA 的靈敏度也可達100.00%，但是特異度只有58.33%，與TPPA 的符合率也只有93.00%。這可能與本次試驗中LICA 灰區范圍內的假陽性標本數量較多造成統計數據的不同有關。本試驗使用的CLIA包被的抗原為TP15、TP17、TP47 重組抗原，采用兩步間接化學發光法原理，這與常用于梅毒螺旋體抗體檢測的雙抗原夾心法不同。這可能也是本試驗中CLIA 的敏感度和特異度不如GICA、ELISA、LICA 的重要原因。

同時筆者發現GICA 與TPPA 的一致性和符合率均高與ELISA、LICA、CLIA，且通過交叉示意圖可見GICA 無單獨陽性的情況出現。GICA 出現的假陽性共3 例，都伴有ELISA 和LICA 同時陽性?？赡芨亟M抗原與TPPA 的天然抗原不同有關。彭振亞等[15］在鑒別梅毒血清學假陽性實驗中提出，重組抗原在復性時形成的差錯空間抗原決定簇可能是假陽性反應的原因。按照2023 年《梅毒螺旋體血清學試驗生物學假陽性處理專家共識》中指出特異性抗體陽性而非特異性抗體陰性時，采用另一種不同原理的特異性抗體驗證：驗證特異性抗體陽性即支持梅毒診斷；驗證特異性抗體陰性時，需建議1、2、6 周后再次采樣復查[16］。本試驗中GICA 假陽性樣本由于伴有ELISA 和LICA 均陽性，也是需1、2、6 周后再次采樣復查才能排除是否梅毒感染的。因再采樣屬于就診者自愿再就診過程，后續結果往往難以隨訪。在本次研究可見GICA 與ELISA、LICA、CLIA 均有很高的一致性和符合率，同時其操作簡單、方便、快捷，GICA 作為復檢方法也是一種不錯的選擇，龐彩云等[17］也選擇GICA 作為梅毒螺旋體抗體篩查過程中的復檢方法。本文示意圖中LICA 和CLIA 均有單試劑陽性的情況，且以CLIA 最多（12 例）。賈敏利等[18］指出CLIA 的陽性率最高且容易出現假陽性，但CLIA 的靈敏度和特異度高于GICA 又與本文結果不同。閆朝春等[19］指出CLIA 法S/CO 值在弱陽性時與TPPA 的符合率最低。賈易萌[20］指出CLIA 檢測梅毒抗體的敏感度和特異度比ELISA 高。這些不同之處可能與其選擇的試劑廠家與本研究不同有一定的關系。

通過對GICA、ELISA、LICA、CLIA 4 種試劑的ROC曲線曲線下面積比較，發現無統計學差異（P＞0.05）。為了進一步找出GICA 與ELISA、LICA、CLIA 之間的差異所在范圍，將后3 種方法進行分區可見，ELISA、LICA和CLIA S/CO 值分別在1.00～12.00、1.00～10.00、1.00～4.00 時的TPPA 符合率明顯低于GICA 的TPPA 符合率，存在統計學差異（P＜0.05）。且CLIA S/CO 值為0.80～0.99 時有1 例漏檢。若疑似感染者采用GICA 檢測為陰性或陽性，而就診時出現ELISA、LICA 或CLIA 的S/CO 結果在上述范圍內，均需要繼續采用TPPA 做進一步驗證。當ELISA、LICA、CLIA 3 種方法的S/CO 值分別大于12.00、200.00、4.00 時，GICA與TPPA 符合率為100.00%。若疑似感染者采用GICA 檢測為陽性，而就診時出現ELISA、LICA 或CLIA的S/CO 結果在上述范圍內，則無需采用TPPA 做進一步驗證。當然本試驗所得數據和劃分S/CO 值只能適用于本試驗使用的試劑品牌，并不能單純以方法學來定義S/CO 值的大小。同時夏德菊等[21］在對梅毒螺旋體抗體快速試劑進行性能評價時發現，國內的GICA 試劑評分差距較大，而且不同批次試劑的也存在一定的誤差。本試驗未對試劑的不同批號進行實際誤差計算，可能也會造成本文中所得S/CO 值和區間會與其他研究者略有不同的原因之一。

綜上所述，GICA 的靈敏度、特異度以及與TPPA的一致性和符合率均優于ELISA、LICA、CLIA；差異主要集中在S/CO 為1.00～12.00（ELISA）、1.00～10.00（LICA）、1.00～4.00（CLIA）區間。當ELISA、LICA、CLIA 3 種方法的 S/CO 值分別大于12.00、200.00、4.00 時，GICA 可100%檢出梅毒螺旋體抗體?？梢娫诿范韭菪w抗體的檢測過程中，GICA 既可以作為初篩試驗也可以用于ELISA、LICA、CLIA 初篩陽性后的復檢試驗，為日后患者自行檢測模式的實現增加了可行性依據。