一測多評法同時測定參芪二皮冬茶顆粒中6 種成分的含量

冉錚婷，李 希，?，馮建安，王 玉，黃 嫣，樓冠華，陳詩韻，王佳佳

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137； 2.四川省中醫藥科學院中醫研究所，四川 成都 610031）

參芪二皮冬茶顆粒系四川省第二中醫院臨床經驗方所開發成的顆粒制劑，由黃芪、夏枯草、陳皮等8 味中藥組成，具有補氣健脾、化痰散結功效，臨床上用于腫瘤相關性厭食癥［1］、惡病質［2-3］的輔助治療。方中黃芪特有成分［4］毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有調節免疫［5］、調節腸道菌群［6-7］作用； 夏枯草有效成分迷迭香酸具有抗炎、抑制腫瘤作用［8-10］； 陳皮、青皮中的黃酮類成分具有增強胃腸動力、抗腫瘤作用［11-13］，其中橙皮苷、橘皮素、川陳皮素對胃液量、胃蛋白酶含量及活性共同發揮促進作用［14-15］； 阿魏酸作為當歸、陳皮、青皮、山慈菇共有成分，具有抗癌作用［16］，并且與川陳皮素共同發揮抗炎、抗氧化、促胃動力作用［17］。

由于中藥復方制劑療效發揮需多種成分共同作用，故多成分含量測定可為其質量整體控制提供依據［18-19］。一測多評法可在明確內標與其他成分之間相對校正因子的前提下，通過測定前者含量來得到后者含量，具有高效、便捷的優點，故本實驗采用該方法同時測定參芪二皮冬茶顆粒中阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素的含量，以期為該制劑質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 BT-125D 型電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； KQ-300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； e2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）。

1.2 試劑與藥物 橙皮苷（批號110721-202019，純度95.3%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷 （批號111920-201907，純度96.1%）、川陳皮素（112055-202001，純度99.6%）、阿魏酸 （批號110773-201915，純度99.4%）、迷迭香酸 （批號11871-202007，純度98.1%）、橘皮素 （批號112054-202001，純度99.8%） 對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。參芪二皮冬茶顆粒 （批號20210401、20210402、20210403） 由四川省第二中醫醫院所提供。黃芪（批號210608）、黨參（批號210526）、茯苓 （批號210611）、夏枯草 （批號201229）、陳皮 （批號201012）、當歸 （批號220209）、青皮 （批號210122）、山慈菇 （批號210608） 均由四川省中藥飲片有限公司提供，經四川省中醫藥科學院中醫研究所謝守德主任中藥師鑒定為正品。分析純甲醇（成都市科龍化學品有限公司）； 色譜純磷酸（上海凜恩科技發展有限公司）； 色譜純甲醇、乙腈（美國賽默飛世爾科技公司）； 水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橘皮素、川陳皮素對照品適量，甲醇溶解，置于25 mL 量瓶中，制成質量濃度分別為 1.856、0.84、0.748、0.784、0.736 mg/mL的貯備液，分別吸取適量，置于25 mL 量瓶中，加入橙皮苷對照品適量，甲醇稀釋溶解，即得（含阿魏酸37.12 μg/mL、毛蕊異黃酮苷葡萄糖苷134.4 μg/mL、迷迭香酸119.68 μg/mL、橘皮素14.72 μg/mL、川陳皮素29.92 μg/mL、橙皮苷884 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液 取研細的本品約2.0 g，精密稱定，10 mL 70% 甲醇溶于錐形瓶中，稱定質量，超聲提取30 min，溶液冷卻后加入70%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按照處方和工藝，分別制成缺黃芪，缺陳皮和青皮，缺夏枯草，缺當歸、陳皮、青皮和山慈菇的陰性樣品，按“2.1.2” 項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～12 min，10% ～13%A； 12 ～40 min，13% ～16% A； 40 ～72 min，16% ～23% A； 72 ～82 min，23% ～45% A； 82 ～97 min，45% ～48% A； 97 ～100 min，48% ～10% A；100～105 min，10%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測波長330 nm （0 ～32 min，阿魏酸；60 ～105 min，迷迭香酸、川陳皮素、橘皮素）、260 nm （32～60 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷）； 進樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗 吸取“2.1” 項下對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1，可知，各成分色譜峰分離度理想，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 甲醇稀釋“2.1.1” 項下對照品溶液至刻度，制成相應質量濃度，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.1.1” 項下對照品溶液適量，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素峰面積RSD 分別為0.36%、0.21%、0.11%、0.21%、1.09%、0.60%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取“2.1.2” 項下供試品溶液適量，于0、4、8、12、24 h 在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，測得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素峰面積RSD 分別 0.82%、0.48%、0.63%、0.28%、0.33%、0.27%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一份本品，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，測得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素含量RSD 分別為1.73%、1.07%、0.54%、0.98%、1.61%、1.42%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品（批號202104111） 9 份，每份約1.0 g，精密稱定，分成3 組，每組3 份，分別按高、中、低比例加入對照品，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、川陳皮素、橘皮素平均加樣回收率分別為100.23%、99.82%、100.32%、100.17%、100.23%、101.18%，RSD 分別為1.94%、2.06%、1.37%、2.25%、1.26%、1.36%。

2.9 相對校正因子計算 參考文獻［20-21］ 報道，采用多點校正法，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，以橙皮苷為內標，計算其他5 種成分的相對校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標含量，As為內標峰面積，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.10 耐用性試驗

2.10.1 儀器、色譜柱 取“2.1.1” 項下對照品溶液適量，分別考察Waters e2998、Agilent 1260 色譜儀及Eclise Plus C18、Eclise XDB C18、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 對各成分相對校正因子的影響，結果見表3，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.10.2 柱溫、體積流量 取“2.1.1” 項下對照品溶液適量，分別考察不同柱溫、體積流量對相對校正因子的影響，結果見表4～5，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表5 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.11 色譜峰定位 取“2.1.1” 項下對照品溶液適量，分別在“2.10.1” 項儀器、色譜柱上測定保留時間，計算相對保留時間tRi/s，公式為tRi/s＝tRi/tRs，其中tRi為待測成分保留時間，tRs為內標保留時間，結果見表6，可知均無明顯變化（RSD＜5%）。

表6 各成分相對保留時間Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.12 樣品含量測定 取3 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備3 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、一測多評法計算含量，結果見表7，可知2 種方法所得結果接近（RSD＜5%）。

表7 各成分含量測定結果（μg/g，n＝3）Tab.7 Results for content determination of various constituents （μg/g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實驗先對各成分進行190～400 nm 全波長掃描，發現阿魏酸最大吸收波長為316 nm，迷迭香酸、川陳皮素、橘皮素最大吸收波長均為330 nm，由于橘皮素含量較低，峰面積較小，故選擇330 nm 作為上述4 種成分的檢測波長； 橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷分別在283、260 nm 處吸收較大，由于后者在283 nm 處峰高較低，而前者在2 種波長處峰高無明顯變化，故選擇260 nm 作為上述2 種成分的檢測波長。再考察了洗脫系統，結合文獻選擇0.1%磷酸作為水相，同時分別考察了甲醇、甲醇-乙腈（1 ∶1）、乙腈作為有機相時目標峰與雜質峰的分離情況，發現乙腈可更高效地將兩者分開。

3.2 提取溶劑選擇 本實驗分別考察了50% 甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇，發現70%甲醇提取效果最佳，故選擇其作為提取溶劑。

3.3 內標選擇 由于橙皮苷含量高，性質穩定，無毒，對照品廉價易得，色譜峰峰形最優，故本實驗選擇其作為內標。

4 結論

本實驗采用一測多評法同時測定參芪二皮冬茶顆粒中阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素的含量，該方法簡便可靠，可為該制劑質量控制提供參考。