細菌纖維素-明膠/絲素蛋白雙層支架的制備及其性能

孫衛華,陳馳昊,李 喆,呂向國,王秀華

(1.浙江理工大學材料科學與工程學院,杭州 310018;2.嘉興學院材料與紡織工程學院,浙江嘉興 314001;3.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院泌尿科,上海 200127)

0 引 言

長段尿道狹窄是泌尿外科一種常見的疾病,組織工程技術有望成為治愈該疾病的有效方法。支架材料可以為細胞生長提供空間結構與力學支撐,并通過模擬體內微環境促進組織重建與再生,因此在組織工程研究中具有重要作用[1-3]。研究表明,高度模擬細胞外基質(Extracellularmatrix,ECM)的納米三維網絡結構會影響細胞行為,進而提高細胞黏附、增殖及蛋白表達,促進組織重建[4-7]。

天然可降解的生物材料已廣泛用于制備尿道組織工程支架。明膠(Gelatin, Gel)和絲素蛋白(Silk fibroin, SF)是尿道組織工程中常用的兩種天然生物材料。Gel具有良好的生物相容性及可降解性,且降解產物毒性較低;SF具有良好的力學強度及可塑性。以明膠和絲素蛋白為原料制備的疏松多孔支架,兼具兩者的優良性能。BC具有良好的持水性能、機械性能及生物相容性,且其三維納米網絡結構能夠完美模擬天然ECM[8-10]。因此,BC三維納米網絡結構與Gel/SF多孔支架進行結合,有望應用于尿道組織修復。

本文將Gel與SF水溶液進行混合,通過冷凍干燥法制備Gel/SF管狀多孔支架,探究了不同預凍溫度對支架多孔結構的影響,選擇與尿道組織多孔結構相近的Gel/SF支架,并以其為模板,采用原位發酵法使BC與Gel/SF支架復合,最終得到具有多尺度結構的雙層支架Gel/SF/BC。對Gel/SF/BC雙層支架的結構及性能進行測試表征,分析其微觀形貌、化學結構、力學性能及生物相容性。本文的研究結果可為尿道、血管、皮膚等組織工程支架的設計與構筑提供新的思路與方法。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

主要材料:木葡糖酸醋桿菌1.1812,購自中國科學院微生物研究所;酵母膏、魚粉蛋白胨和戊二醛(生物試劑),購自國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀、無水乙醇和明膠(分析純),購自國藥集團化學試劑有限公司;曲拉通 X-100(化學純),購自上海源葉生物科技有限公司;最低限量基本培養基(MEM,AH29917357),購自上海橋星貿易有限公司;L-929細胞(購自中科院上海細胞庫);胎牛血清(FBS,NYN0769),購自上海橋星貿易有限公司;二苯基四氮唑溴鹽(MTT,J17GS15117),購自上海源葉生物科技有限公司;青霉素鏈霉素(J210042),購自上海橋星貿易有限公司;高糖液體培養基(DMEM,PM150210),購自武漢普諾賽生命科技有限公司;苯酚和溴化鋰(分析純),購自上海麥克林生化科技有限公司;2,4-二硝基氯苯(分析純),購自上海博飛美科化學科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(色譜純),購自上海麥克林生化科技有限公司;高密度聚乙烯薄膜(海門市揚子醫療器械有限公司);雄性豚鼠(普通級),購自邳州市東方養殖有限公司;道康寧硅膠及其固化劑(DC184),購自北京瑞德佑業科技有限公司;蠶繭(浙江嘉欣絲綢股份有限公司)。

主要儀器:超聲診斷儀(東芝Aplio 500),購自日本東芝醫療系統株式會社;冷凍干燥機(SCIENTZ-18 N),購自上海雙旭電子有限公司;3D打印機(Creater Pro),購自浙江閃鑄三維科技有限公司;電熱恒溫培養箱(DHP-9082),購自濟源千司生物技術有限公司;立式高壓蒸汽滅菌鍋(申安LDZX-50KBS),購自上海習仁科學儀器有限公司;掃描電鏡(Apreo S),購自美國賽默飛公司;傅里葉變換紅外光譜儀(VERTEX 70),購自德國布魯克公司;X射線薄膜衍射儀(D8 ADVANCE型),購自德國布魯克公司;萬能試驗機(Instron 5982),購自美國英斯特朗公司。

1.2 Gel/SF管狀多孔支架的制備

圖1為Gel/SF管狀多孔支架的制備流程圖。通過超聲掃描獲取尿道組織二維斷層圖片(圖1(a)),對二維斷層圖片做數據識別處理,利用imaris軟件對處理后的系列二維斷層圖片進行三維重建及擬合(圖1(b)),再經3DMax軟件平滑處理后得到尿道三維數字模型(圖1(c)),3D打印得到ABS材質的尿道節段性三維實體模型(圖1(d))。硅膠和固化劑按照質量比100∶5進行混合,將3D打印模型放入方形透明塑料器皿中并注入上述混合試劑,固化后的硅膠進行倒模處理,得到具有尿道組織宏觀形貌的硅膠模具(圖1(e))。將Gel/SF混合倒入硅膠模具,冷凍干燥后得到Gel/SF管狀多孔支架(圖1(f))。

圖1 Gel/SF管狀多孔支架的制備流程圖

將10 g脫膠處理后的蠶繭在質量分數60%的溴化鋰溶液中60 ℃條件下溶解5 h,多層紗布過濾,然后用去離子水透析3 d,每隔12 h換水;透析完成后的SF溶液冷凍干燥,制得純SF。取純SF溶于去離子水中,配制質量分數5%的SF水溶液,將Gel溶于45 ℃去離子水中,配制質量分數5%的明膠溶液,將兩種溶液等體積混合后注入硅膠模具中,分別在-20、-80 ℃以及液氮(-196 ℃)中冷凍12 h,然后進行冷凍干燥,得到Gel/SF管狀多孔支架。

1.3 Gel/SF/BC雙層支架的制備

配制發酵培養液(5 g/L酵母膏、5 g/L魚粉蛋白胨、50 g/L葡萄糖、2 g/L磷酸氫二鈉、1 g/L檸檬酸、1 g/L磷酸二氫鉀),待上述物質充分溶解后,放入立式高壓蒸汽滅菌鍋中進行滅菌,并在121 ℃、0.1 MPa下滅菌30 min。

采用質量分數0.5%的戊二醛無水乙醇溶液交聯Gel/SF管狀多孔支架10 min,用發酵培養液清洗3次,置換出多余的戊二醛溶液。將處理后的Gel/SF管狀多孔支架重新放置于硅膠模具中,配制菌種密度為107個/mL的木葡糖酸醋桿菌發酵培養液,并將其注入模具內。待發酵培養液充分浸潤Gel/SF管狀多孔支架后,放入恒溫培養箱中,35 ℃發酵培養7 d,獲得Gel/SF/BC雙層支架。將雙層支架浸入醫用酒精消毒處理24 h,用質量分數1%的曲拉通 X-100浸泡處理24 h,并用超純水清洗3次,除去多余的試劑。

1.4 樣品表征

1.4.1 形貌及結構分析

采用掃描電鏡對管狀樣品內表面及橫截面結構進行觀察,采用Image J軟件進行測量,并用Origin軟件統計進行分析(n=200,n為統計數量),利用傅里葉變換紅外光譜儀及X射線薄膜衍射儀對雙層支架進行化學結構測試。

1.4.2 孔隙率測試

采用乙醇置換法測量支架孔隙率。取凍干后的支架稱重為m1,將其完全浸沒在無水乙醇中,用濾紙輕蘸去表面多余液體后稱重為m2;將多孔支架放入20 mL量筒中,緩慢倒入乙醇至10 mL,添加乙醇的體積為V;計算樣品的孔隙率,每組支架測試3個樣品?？紫堵蔖用式(1)計算:

(1)

其中:m1為支架凍干后的質量,g;m2為浸泡無水乙醇2 h后的質量,g;V為添加的乙醇的體積,mL;ρc為無水乙醇密度,g/mL。

1.4.3 吸水量測試

將支架置于去離子水中浸泡24 h,支架取出后用濾紙將支架表面多余的水分擦拭干凈,用電子天平稱重得到濕態質量Ws,然后將支架進行冷凍干燥,稱重得到干態質量Wd。計算出支架的吸水量,每組支架測試3個樣品。吸水量通過式(2)計算:

(2)

其中:Sr為吸水量;Ws為支架在去離子水中浸泡24 h后的質量,g;Wd為冷凍干燥后干態質量,g。

1.4.4 力學性能測試

采用萬能試驗機對材料進行力學性能測試。將樣品統一裁剪為25×4×2 mm3的樣條進行拉伸力學性能的測試,拉伸速率為5 mm/min。

循環壓縮力學性能測試:濕態下的Gel/SF多孔支架以及Gel/SF/BC雙層支架進行壓縮循環測試。將樣品采用相同的工藝條件,統一制備為直徑15 mm,高16 mm的圓柱狀樣品,壓縮至樣品發生60%形變,然后恢復至0%,壓縮速率為10 mm/min,重復10次循環。

1.4.5 細胞毒性試驗

體外細胞毒性試驗按照《醫療器械生物學評價 第5部分:體外細胞毒性試驗》(GB/T 16886.5—2017)進行測試。將L-929細胞在含10%胎牛血清和抗生素(青霉素100 μg/mL,鏈霉素100 μg/mL)的MEM培養液進行培養后,分別加入100 μL Gel/SF/BC試驗樣品浸提液(100%)、陽性對照(含0.5%苯酚的DMEM培養液)和陰性對照液(高密度聚乙烯薄膜的浸提液),37 ℃、5% CO2培養24 h,每組做6個平行;培養24 h后,做細胞形態學觀察及吸光度的測定。

1.4.6 皮膚致敏和皮膚刺激試驗

皮膚致敏試驗和皮膚刺激試驗按照《醫療器械生物學評價 第10部分:刺激與皮膚致敏試驗》(GB/T 16886.10—2017)進行測試。

皮膚致敏試驗過程:選取15只雄性豚鼠將其分為2組:其中陰性對照組為5只動物/組,試驗組為10只動物/組。試驗前24 h將實驗動物背部左側去毛,去毛范圍約為4～6 cm2。無菌條件下制備Gel/SF/BC樣品與陰性對照組,樣品規格為2.5 cm×2.5 cm,將試驗組(Gel/SF/BC)及對照組(醫用紗布)樣品在動物背部去毛區域進行貼敷并誘導激發致敏反應。在24 h與48 h后觀察動物激發部位皮膚反應,并按照Magnusson and Kligman分級表評分。

皮膚刺激試驗過程:在給藥前24 h內,將動物背部兩側去毛,去毛面積約為10 cm×15 cm。將試驗組(Gel/SF/BC)及對照組(醫用紗布)樣品在兩側去毛區域進行貼敷并做包扎處理,貼敷持續4 h后,移除樣品。移除樣品后分別于1、24、48 h和72 h觀察動物皮膚紅斑和水腫反應并按照皮膚反應記分表進行記分。

2 結果與討論

2.1 Gel/SF管狀多孔支架在不同預凍溫度下的多孔結構

圖2為不同預凍溫度下制備的Gel/SF管狀多孔支架截面SEM圖像及孔徑分布。圖2顯示:預凍溫度為-20 ℃的Gel/SF管狀多孔支架為大孔結構,孔洞之間連通性較好,孔徑為(141±78)μm(圖2(a));隨著預凍溫度降低至-80 ℃,Gel/SF多孔結構的孔徑變小,且孔洞周圍分布有閉合的凹陷結構,孔洞之間的連通性較差,孔徑為(23±18)μm(圖2(b));在-20 ℃和-80 ℃下,Gel/SF管狀多孔支架孔徑大小以及結構變化,發現在恒定溫度場下,冰晶顆粒生長至最終定型時的尺寸隨著溫度降低而變小,冷凍干燥升華從而形成具有不同孔徑的多孔結構;-196 ℃的Gel/SF支架的多孔結構類似于一種取向結構,孔徑為(88±23)μm(圖2(c))。研究發現,-196 ℃下的多孔結構孔徑并沒有隨著溫度的下降而減小。這是因為硅膠模具自身的低導熱性,在冷凍時一維方向上存在溫度場(即-196 ℃到室溫35 ℃),冰晶沿著一維方向的溫度場而生長,導致冷凍干燥所形成的多孔結構會存在取向結構,且不同位置處截面的多孔結構及孔徑大小存在差異[10-11]。由于人尿道脫細胞基質海綿體層孔徑大小為100～300 μm,因此,在-20 ℃的冷凍條件制備的Gel/SF管狀多孔支架更適合作為尿道組織修復支架。

圖2 不同溫度下Gel/SF支架的SEM圖及孔徑分布圖

2.2 Gel/SF/BC雙層支架微觀形貌分析

圖3為-20 ℃預凍溫度下所制備的Gel/SF/BC雙層支架SEM圖像。Gel/SF/BC內側是單純BC形成的致密層,外側是以Gel/SF管狀多孔支架為骨架復合BC納米纖維的多孔疏松層,多孔疏松層是由微米級的多孔結構組成,孔與孔之間相互連通,孔徑的大小為(143±40)μm(圖3(a)),與同條件下制備的Gel/SF管狀多孔支架孔徑一致。

圖3 Gel/SF/BC雙層支架多級結構SEM圖及孔徑、納米纖維分布圖

進一步對多孔結構內壁同一位置進行分級觀察,在微米級多孔結構內壁存在BC三維納米網絡纖維,納米級纖維直徑為(78±24)nm(圖3(b))。

觀察Gel/SF/BC雙層支架的致密層,其內表面擁有致密的細菌纖維素層,厚度為(29±4)μm,納米纖維相互交錯形成的蛛網結構,構成蛛網結構的納米纖維直徑在(44±8)nm(見圖3(c))。納米纖維的分布呈現蛛網結構,是由于Gel/SF管狀多孔支架與木醋桿菌在培養液中的靜電作用力,改變了木醋桿菌的聚集狀態,進而影響到納米纖維的自組裝過程,最后呈現出不同形貌結構的納米纖維網絡[12]。靜態培養的細菌纖維素為三維無序納米纖維網絡結構,而通過靜電作用力的控制可得到特殊的蛛網結構或樹枝狀結構[13]。在雙層支架的多尺度結構中,納米級纖維占比為87.5%,亞微米級纖維占比12.5%。因此,BC的納米纖維貫穿于Gel/SF管狀多孔支架的內壁及其內表面。

對比原位發酵法所制備的Gel/SF/BC雙層支架與人尿道脫細胞基質的多尺度結構,結果如表1所示。由表1可知,Gel/SF/BC雙層支架與尿道脫細胞基質的厚度近乎一致,雙層支架的疏松多孔層平均孔徑(143±40)μm,其內壁納米纖維直徑為(78±24)nm,致密層納米纖維直徑(44±8)nm。而人尿道的脫細胞基質海綿體層孔徑(146±39)μm,納米纖維直徑(30±7)nm,致密層納米纖維直徑(25±5)nm。因此,Gel/SF/BC雙層支架的多尺度結構接近于人體尿道脫細胞基質。

表1 Gel/SF/BC雙層支架和尿道脫細胞基質的多級結構

2.3 Gel/SF/BC雙層支架化學結構分析

圖4 不同樣品的FT-IR和XRD圖譜

2.4 Gel/SF/BC雙層支架孔隙率及吸水量

組織工程支架應具有較高的孔隙率及相互連通的多孔結構,這對細胞的生長、遷移以及新陳代謝等有著重要的影響[18]。對不同樣品孔隙率及吸水量進行對比,結果如圖5所示。由圖5可知Gel/SF支架和Gel/SF/BC雙層支架的孔隙率都在80%以上,對于尿道組織工程而言已基本滿足[19]。Gel/SF多孔支架孔隙率為85.8%,Gel/SF/BC雙層支架的孔隙率為81.3%,雙層支架的孔隙率相對Gel/SF較低,是因為Gel/SF多孔結構的孔壁上原位生長的BC對其孔隙率有一定的影響。Gel/SF/BC雙層支架的吸水量為16.1,是Gel/SF的1.1倍,兩者由于其多孔結構存在,均具有較強的吸水性能。但Gel/SF/BC雙層支架的多孔結構里原位生長了納米級BC,并具有更小孔徑的三維網絡結構,使得該雙層支架的吸水性能較Gel/SF具有明顯的提升。

圖5 不同樣品孔隙率及吸水量

2.5 Gel/SF/BC雙層支架力學性能分析

天然BC本身具有良好的力學性能,其應用于支架材料的制備可使材料的力學性能得到改善[20]。對不同樣品的拉伸性能進行對比,結果如圖6所示。Gel/SF/BC雙層支架在72.5 kPa處發生材料的斷裂(見圖6(a)),其斷裂強度與斷裂伸長率分別是Gel/SF的1.3倍和1.1倍(見圖6(b)),這表明Gel/SF/BC雙層支架具有更好的抵抗外力拉伸形變能力,原位發酵生長的BC為Gel/SF支架帶來力學性能上的提升。

圖6 不同樣品的拉伸性能

新生的組織需要適當的壓縮力學性能提供支撐,以提供和維護細胞生長所必需的空間環境,并維持一定時間直至新生組織具有一定的自身生物力學特性[21-22]。對不同樣品進行壓縮性能的比較,結果如圖7所示。Gel/SF/BC雙層支架第一次循環壓縮的應力-應變曲線所對應的最大應力為88.2 kPa,楊氏模量為127.7 kPa,在經過第十次循環壓縮后其最大壓縮應力降低為83.1 kPa,楊氏模量降低為90.9 kPa,其第一次循環壓縮對應的最大壓縮應力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.6倍,經過第十次循環壓縮對應的最大壓縮應力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.7倍(見圖7(c)—(d))。這表明Gel/SF/BC雙層支架具有更好的耐壓縮性能,Gel/SF/BC雙層支架上原位生長的BC含有大量羥基,與Gel/SF形成氫鍵,提高了雙層支架的力學性能。

圖7 不同樣品的壓縮性能

2.6 雙層支架細胞毒性測試

采用二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法,用各實驗組的浸提液培養L-929細胞,并對其增殖情況進行評價。細胞經過24 h的培養后,對比不同實驗組的吸光度,結果如圖8所示。陽性對照組對比其他組的吸光度較低,顯微鏡觀察L-929細胞幾乎沒有增長,這表明在含0.5%苯酚的DMEM培養液中細胞無法正常增殖生長。對比陽性組,空白樣品、陰性對照組及Gel/SF/BC浸提液(100%),實驗組的吸光度相對較強,說明細胞生長狀況較好。對比實驗組的吸光度(OD值),發現Gel/SF/BC實驗組樣品浸提液OD值(0.218±0.002)稍低于空白對照組(0.324±0.012)。按照標準設定空白對照組對應的存活率為100%,則實驗組Gel/SF/BC的存活率為86.7%。對實驗組進行細胞形態學的觀察,僅觀察到輕微的細胞生長抑制現象,推測Gel/SF/BC雙層支架在采用曲拉通 X-100浸泡處理去除內毒素后,存在微量的殘留,從而影響了細胞生長。實驗樣品的細胞存活率為86.7%,高于標準中細胞存活率應不小于70%的要求,說明實驗樣品Gel/SF/BC對L-929無明顯細胞毒性。

圖8 24 h后不同樣品的吸光度

2.7 雙層支架皮膚致敏性與皮膚刺激性測試

皮膚致敏性實驗結果:Gel/SF/BC樣品與陰性對照組樣品評分均為0(無明顯改變),陽性對照組評分為2(致敏物為2,4-二硝基氯苯,中度融合性紅斑),說明Gel/SF/BC樣品無皮膚致敏性。

皮膚刺激性實驗結果:Gel/SF/BC樣品實驗組與陰性對照組原發性刺激指數均為0(極輕微刺激性),陽性組(20%十二烷基硫酸鈉)原發性刺激指數均為4.1(中等微刺激性),說明Gel/SF/BC樣品無皮膚刺激性。

3 結 論

本文采用原位發酵法將BC與Gel/SF管狀多孔支架復合,得到具有模擬尿道組織多尺度結構的Gel/SF/BC雙層支架。Gel/SF/BC雙層支架表現出良好的力學性能、吸水性能及生物相容性,在尿道組織工程材料具有一定的應用前景。主要結論如下:

a)制備的Gel/SF/BC雙層支架,實現了對尿道組織宏觀形貌、微米級多孔、納米級纖維的結構模擬。Gel/SF/BC雙層支架宏觀形貌長度為9.3 mm,平均孔隙率為83.1%,其中:內側致密層由直徑為(44±8)nm的單純BC構成,外側多孔疏松層以孔徑為(143±40)μm的Gel/SF多孔支架為骨架,直徑為(78±24)nm的BC納米纖維在其孔壁表面分布。

b)Gel/SF/BC雙層支架其力學強度相比于Gel/SF多孔支架有所提升,Gel/SF/BC斷裂強度為72.5 kPa,是Gel/SF的1.3倍。Gel/SF/BC經過10次循環壓縮對應的最大壓縮應力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.7倍。Gel/SF/BC雙層支架相比于Gel/SF多孔支架吸水量有所提升,為Gel/SF的1.1倍。

c)Gel/SF/BC雙層支架無細胞毒性、無皮膚致敏與皮膚刺激反應,具有較好的生物相容性,能夠應用于尿道組織工程。