靈芝miRNA對人皮膚成纖維細胞衰老的作用研究

余雯斌,徐曉淵,盛 清

(浙江理工大學生命科學與醫藥學院,杭州 310018)

0 引 言

靈芝(Ganodermalucidum)是一種大型藥用真菌,擔子菌綱多孔菌科靈芝屬[1]。靈芝作為藥食同源的傳統中藥已有兩千多年的歷史,具有滋補強壯、延年益壽等功效,對多種不同疾病都有有益作用[2]。目前,對靈芝發揮藥效的物質基礎和作用機理研究主要集中在靈芝多糖、靈芝三萜及部分甾醇類物質等領域[3-5],而對其核酸、蛋白質等初級代謝產物尤其是各種RNA的活性研究相對較少[6-10]。microRNA(miRNA)是一類含有18～25個核苷酸的非編碼小RNA(Non-coding small RNA),在動植物和微生物中普遍存在,能夠調控特定基因的轉錄后表達,在細胞增殖、分化和衰老等過程中起著重要的作用[11]。研究發現,miRNA參與不同細胞類型和環境老化過程,可作為重要的衰老生物學標志物[12];miR-126等25種外泌體miRNA對血管細胞增殖、遷移、凋亡、炎癥和分化等衰老相關功能具有調控作用[13]。miRNA通過p53/p21/Rb通路、p16-pRb通路、PI3K/AKT/mTOR通路和SIRT1通路等多個與細胞衰老相關的信號通路參與細胞衰老的生物過程[14-15]。在衰老過程中,miRNA的表達改變與包括癌癥和心血管疾病在內的衰老性疾病有關,使用miRNA的治療方法將促進衰老相關疾病的治療或預防[16-17]。

2012年,Zhang等[18]首次發現,植物miRNA可以通過口服攝入調控人體內的基因表達;自此以來,越來越多的證據表明,外源miRNA可以調控動物體內相關基因的表達,發揮重要的生物學作用[19]。通過連續灌胃可顯著增加小鼠外周血和肺中金銀花miR2911的表達量,且合成的 miR2911 模擬物能顯著抑制H1N1 病毒的復制[20];紅景天煎煮液中的miRNA在體內和體外實驗中均表現出較強的抗纖維化作用等[21]。Huang等[22]在對10種草藥的研究中發現,每種草藥中有大量小RNA能夠進入哺乳動物的血液和肺部,能以序列特異性的方式對哺乳動物基因進行跨界調控。

靈芝具有極高的藥用價值,是延緩衰老的珍品[23];《神農本草經》記載,靈芝“久服輕身不老,延年神仙”[24]?，F代藥理研究表明,靈芝多種活性成分具有延緩衰老的作用[25],但其延緩衰老的分子機制尚有待進一步闡明。中藥miRNA可以發揮跨界調控作用,那么靈芝中的miRNA對衰老會有怎樣的作用和影響?Li等[26]首次報道了靈芝miRNA的鑒定研究,從靈芝子實體中分離并確證了132個已知miRNA和34個靈芝特有的miRNA;靶基因預測發現,靈芝中的miRNA針對人生命過程的靶基因多達111個,多數miRNA具有不止一個靶基因,或一個靶基因可以受多個miRNA調控,而豐度較高的靈芝特有miRNA Glu-miR-01、Glu-miR-03能夠靶向與衰老相關信號通路中的關鍵基因。

本文研究靈芝特有miRNA Glu-miR-01,Glu-miR-03對細胞衰老的作用。通過探究靈芝miRNA模擬物(miRNA mimics)對過氧化氫(H2O2)誘導的人皮膚成纖維細胞衰老的作用,檢測其對細胞衰老相關指標的變化、衰老相關通路關鍵蛋白的表達水平的影響等,探明靈芝miRNA作為靈芝新活性成分對延緩細胞衰老的作用及機制,為闡明靈芝miRNA跨界調控的分子機制奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材 料

1.1.1 細 胞

人皮膚成纖維HSF細胞(美國模式培養物集存庫,ATCC)。

1.1.2 miRNA模擬物

Glu-miR-01模擬物(Glu-miR-01 mimics)、Glu-miR-03模擬物(Glu-miR-03 mimics)和陰性對照(Negative control)(上海吉瑪制藥技術有限公司)按表1中序列制備。

表1 靈芝miRNA 序列

1.1.3 試 劑

3%過氧化氫(H2O2)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和胰酶(Trypsin)(美國Sigma公司),DMEM高糖培養基、雙抗(青霉素、鏈霉素)和PBS(維森特生物技術(南京)有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒和總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所),胎牛血清(美國Gibco公司),細胞衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色試劑盒、線粒體膜電位(JC-1)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),ECL顯色液(美國Advansta公司),LipofectamineTM3000轉染試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司),SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(上海雅酶生物醫藥科技有限公司)。

1.1.4 抗 體

p53(DO-1)抗體(1∶500)、p16INK4a(JC8)抗體(美國Santa Cruz公司,1∶500),p21Waf1/Cip1(DCS60)抗體(1∶2000)、Rb(4H1)抗體(美國Cell Signaling Technology公司,1∶2000),α-tubulin抗體(1∶5000)和羊抗兔IgG(HRP標記,美國Proteintech公司,1∶5000)。

1.2 HSF細胞衰老模型的構建

采用H2O2誘導HSF細胞的方法構建氧化應激導致的HSF細胞衰老模型,具體參見文獻[27]。將HSF細胞鋪板過夜,設置H2O2濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L和1.2 mmol/L,H2O2誘導的時間梯度為3、6、12 h和24 h,對 HSF 細胞進行 H2O2誘導;經不同濃度、不同時間誘導后,觀察細胞形態的改變,采用MTT實驗檢測細胞活力的變化,以確定H2O2最適濃度與誘導時間;收集細胞后檢測SOD、MDA和T-AOC等氧化應激指標的變化,以確定HSF細胞衰老模型的成功構建。

1.3 細胞中靈芝miRNA表達量的檢測

將靈芝miRNA mimics轉染HSF細胞后,收集細胞,提取細胞總RNA,以總RNA為模板,使用特異性莖環引物,將RNA 逆轉錄成cDNA?？焖賳油ㄓ肧YBR Green Master的RT-qPCR程序,程序設置為:95 ℃處理10 min,然后95 ℃處理15 s,隨后轉為60 ℃處理15 s,最后72 ℃處理30 s,共40個循環,以人源5.8 S 為內參檢測miRNA的相對表達量。莖環引物和反轉錄引物序列見表2。使用ABI 7500 Software(V2.3)軟件進行數據分析。

表2 RT-qPCR引物設計

1.4 靈芝miRNA對衰老細胞活力影響的檢測

采用MTT法評價Glu-miR-01和Glu-miR-03對H2O2誘導的HSF衰老細胞的活力影響。將HSF細胞接種于96孔板中,細胞密度為2.5×104/孔。用質量濃度為0.75、3.5 μg/mL和7.5 μg/mL的Glu-miR-01 mimics、Glu-miR-03 mimics和對應陰性對照,分別轉染HSF細胞,每個濃度6個復孔。參照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書操作:取HSF細胞,棄去舊培養基,每孔加入2 mL無血清DMEM培養基。將轉染試劑、Glu-miR-01 mimics、Glu-miR-03 mimics以及陰性對照分別用無血清DMEM培養液按說明書比例稀釋混勻。將稀釋后的轉染試劑分別與已稀釋的Glu-miR-01 mimics/Glu-miR-03 mimics/陰性對照按照1∶1比例混勻。室溫靜置孵育15～20 min。將孵育充分的混合物分別加入設定孔中,繼續培養24 h后更換培養基,每孔加入200 μL含有0.8 mmol/L H2O2的培養基;誘導3 h后吸去培養基,再加入濃度為5 mg/mL的20 μL MTT溶液,在CO2培養箱中于37 ℃孵育4 h后加入150 μL DMSO溶液,搖勻,待結晶充分溶解后,使用酶標儀于波長570 nm處測定每個孔的吸光度值(OD)。細胞活力(Cell viability,CV)計算如式(1)所示:

(1)

其中:CV為細胞存活率,%;OD實驗為實驗組在570 nm處的吸光度;OD對照為對照組570 nm處的吸光度。

1.5 衰老相關氧化應激指標和細胞SA-β-gal的檢測

氧化應激相關細胞衰老的特征性指標主要包括SOD、MDA和T-AOC等[28]。SOD是生物體內清除超氧陰離子自由基的一種重要的抗氧化酶,可以保護機體免受氧自由基的損害;MDA是脂質與氧自由基形成的產物之一,其含量代表脂質過氧化的程度;T-AOC是指各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平,用于評價生物活性物質的抗氧化能力。選擇培養的HSF細胞接種于6孔板,使每孔細胞密度為 1×106個,分為0.8 mmol/L H2O2誘導的模型組、實驗組即0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染Glu-miR-01 mimics(Glu-miR-03 mimics)的Glu-miR-01組(Glu-miR-03組)、0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染陰性對照的陰性對照組,在轉染miRNA mimics 24 h后,吸去舊培養基,每組都分別加入1 mL含有0.8 mmol/L H2O2的DMEM培養基,培養3 h后收集細胞,進行SOD、MDA和T-AOC等氧化應激相關指標檢測。

細胞衰老相關β-半乳糖苷酶是檢測細胞衰老的常用指標,利用衰老細胞中SA-β-gal活性水平上升進行細胞染色[29]。正常細胞中僅觀察到零星的SA-β-gal陽性細胞;研究發現,長時間暴露于H2O2可導致細胞過早衰老,表現為細胞增殖受到抑制,SA-β-gal染色增強[30]。細胞衰老相關SA-β-gal的檢測參照以上分組并按照試劑說明書進行。

1.6 細胞線粒體膜電位的檢測

線粒體膜電位(ΔΨm)用于評估線粒體的活力,ΔΨm的變化反映細胞衰老變化。熒光探針JC-1可用于檢測ΔΨm,細胞活力強時,ΔΨm較高,呈現紅色熒光,而ΔΨm較低時呈綠色熒光,提示細胞衰老凋亡[29]。選擇培養的HSF細胞接種于6孔板,使每孔細胞密度為 1×106個,分為正常細胞的正常組、0.8 mmol/L H2O2誘導的模型組、實驗組即0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染Glu-miR-01 mimics(Glu-miR-03 mimics)的Glu-miR-01(Glu-miR-03)組、0.8 mmol/L H2O2誘導+轉染陰性對照的陰性對照組,在轉染miRNA mimics 24 h后,棄去舊培養基,除正常組外分別加入含有0.8 mmol/L濃度H2O2的DMEM培養基,培養3 h后使用線粒體膜電位試劑盒檢測每組細胞的ΔΨm變化。

1.7 細胞中蛋白質表達量的檢測(Western blotting)

細胞衰老的作用機制包括p53、p21Cip1/Waf1、p16INK4a等衰老相關分子標志物的調控,以及Rb蛋白的磷酸化狀態(pRb /tRb)等[31]。p53受到DNA損傷和端粒侵蝕的刺激,導致P21表達增加,Rb蛋白去磷酸化,最終導致細胞復制性衰老[32]。P53的失活則促進衰老細胞的增殖,而P21缺乏則延緩衰老過程,提示p53/p21/Rb通路可能是調控細胞衰老的主要途徑之一。選擇在培養的HSF細胞,將Glu-miR-01 mimics和Glu-miR-03 mimics轉染至細胞中,24 h后加入0.8 mmol/L H2O2誘導細胞,3 h后收集細胞。用細胞裂解液提取總蛋白。采用 SDS-PAGE分離總蛋白,用免疫印跡法將總蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶與吐溫(pH 7.4)在室溫下封閉2 h后,用p53抗體、p16INK4A抗體、p21Waf1/Cip1抗體、Rb抗體在4 ℃過夜孵育,以羊抗兔IgG(HRP標記)作為二抗,使用ECL顯色液檢測蛋白表達。

1.8 統計分析

所有數據都是以平均值±SD表示3個獨立實驗的平均值,采用GraphPad Prism 6.0軟件進行單因素方差A檢驗和LSD檢驗。當p值<0.05時,差異顯著。

2 結果與討論

2.1 H2O2誘導HSF細胞衰老模型的細胞活力變化

細胞衰老是由細胞內氧自由基堆積產生導致[33],正常有氧代謝產生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)對生物分子造成損害,并最終導致組織功能下降和衰老[34]。氧化應激導致的細胞衰老一直被視為衰老研究中經典的體外模型,H2O2是產生ROS的主要成分,H2O2誘導產生的氧化應激可引起人體皮膚成纖維細胞氧化損傷[35]。圖1為不同濃度H2O2誘導下HSF細胞的活力變化。圖1表明:當H2O2的濃度大于等于1.0 mmol/L時,經3 h誘導后CV約為50%,但經6 h以上誘導后,CV逐漸降低至20%以下,細胞大多數已經死亡。通過比較,最終選擇0.8 mmol/L為最適濃度,3 h為最適作用時間,確定為H2O2誘導氧化應激構建細胞衰老模型的最適條件。

圖1 H2O2誘導下HSF細胞活力變化直方圖

2.2 HSF細胞衰老模型中氧化應激指標的變化

圖2為H2O2刺激下HSF細胞內各氧化應激指標含量的變化。由圖2可知,相比于正常細胞組,在0.8 mmol/L H2O2誘導3 h的模型組中,SOD和T-AOC的水平顯著降低(p<0.01),而MDA含量相對于正常組顯著增加(p<0.05)。這些氧化應激指標的顯著改變,表明采用0.8 mmol/L H2O2、處理3 h的條件進行誘導的HSF細胞衰老模型構建成功,可用于后續實驗。

圖2 H2O2誘導下HSF細胞衰老模型的氧化應激指標變化直方圖

2.3 靈芝miRNA在HSF細胞中的轉染效率

因為陰性對照組帶有熒光標記(FAM),并且其核酸結構與合成的miRNA mimics相似,所以其熒光強度可以近似反映出Glu-miRNA的轉染效率,圖3為轉染miRNA mimics 后細胞熒光強度,以及Glu-miR-01和Glu-miR-03在HSF細胞中的相對表達水平,由圖3(a)—(b)可知,Glu-miRNA的轉染效率相對較高;如圖3(c)—(d) 相對表達水平檢測實驗結果顯示,相比于對照組,實驗組中Glu-miR-01 和Glu-miR-03表達水平都有顯著升高,表明HSF細胞中Gas-miR-01 和Glu-miR-03都有較高的轉染效率。

圖3 轉染miRNA mimics 細胞熒光強度顯微圖及Glu-miR-01和Glu-miR-03在HSF細胞中的相對表達水平直方圖

2.4 靈芝miRNA對HSF衰老細胞活力的影響

為了探究轉染靈芝miRNA對HSF細胞模型的影響是否具有劑量依賴性,在轉染不同濃度miRNA mimics后,對H2O2誘導的HSF細胞模型細胞活力的變化進行檢測。結果如圖4所示。由圖4可知,相比于只有正常細胞的正常組,模型組的HSF細胞由于一定濃度H2O2的誘導CV明顯下降至正常組的50%～60%;而轉染靈芝miRNA mimics實驗組相比于模型組的細胞存活率明顯升高,并且不同濃度的Glu-miR-01 mimics組CV顯著高于陰性對照組(p<0.01);Glu-miR-03組具有相似的作用效果(p<0.05),說明轉染的靈芝miRNA mimics可以逆轉HSF的細胞活力,而跟劑量無關。

圖4 靈芝miRNA轉染后HSF衰老細胞活力變化直方圖

2.5 靈芝miRNA對HSF衰老細胞中氧化應激指標和衰老細胞SA-β-gal生成的影響

圖5和圖6分別為Glu-miR-01、 Glu-miR-03對H2O2誘導的HSF細胞模型各個氧化應激指標的影響結果。圖5表明:相較于H2O2誘導后HSF細胞的SOD和T-AOC活性降低,MDA含量升高,轉染了靈芝miRNA mimics的HSF衰老細胞相應氧化應激指標發生了逆轉。轉染Glu-miR-01 mimics組SOD活力相對于只加入H2O2誘導的模型組顯著升高(p<0.01),而MDA含量顯著降低(p<0.01),T-AOC則明顯上升(p<0.05)。由圖6可知:Glu-miR-03 與 Glu-miR-01 具有一致的作用效果,SOD、MDA和 T-AOC 的變化亦呈顯著性差異(p<0.05)。

圖5 Glu-miR-01轉染后HSF衰老細胞的氧化應激指標變化直方圖

圖6 Glu-miR-03轉染后 HSF衰老細胞的氧化應激指標變化直方圖

SA-β-gal活性變化結果如圖7所示。由圖7可知:H2O2誘導的模型組中SA-β-gal染色陽性細胞顯著增加,而轉染Glu-miR-01 mimics和轉染Glu-miR-03 mimics的HSF衰老細胞中SA-β-gal陽性占比均明顯低于模型組。這說明靈芝特異miRNA對緩解HSF細胞衰老具有一定作用。

圖7 靈芝miRNA轉染后HSF衰老細胞的SA-β-gal變化直方圖

2.6 靈芝miRNA對HSF衰老細胞中ΔΨm的影響

圖8為靈芝miRNA對HSF細胞衰老模型中ΔΨm的影響結果。圖8表明,正常細胞中,紅色占比較高,而經H2O2處理的HSF中綠色熒光占比增加,表明衰老細胞增加,活力減弱,而經Glu-miR-01 mimics和Glu-miR-03 mimics分別處理HSF衰老細胞后,紅色熒光增加,相比于模型組具有顯著差異(p<0.05),表明靈芝miRNA mimics 逆轉了HSF衰老細胞的線粒體活力。

圖8 靈芝miRNA轉染后 HSF細胞衰老的ΔΨm變化示意圖

2.7 靈芝miRNA對HSF衰老細胞中p53/p21/Rb信號通路的作用

越來越多的研究[14]證實,miRNAs可以參與衰老相關的信號通路如p53/p21/Rb通路的調節。因此,本文探究了靈芝miRNA對HSF衰老細胞中p53/p21/Rb信號通路相關蛋白的作用影響。圖9為靈芝miRNA對H2O2誘導的HSF細胞衰老模型中p53/p21/Rb信號通路上相關蛋白表達水平的影響結果。圖9表明:通過H2O2誘導的HSF衰老細胞所在模型相比于正常細胞組,P53、P21以及P16蛋白水平升高,Rb蛋白水平降低;轉染靈芝Glu-miR-01后,各蛋白表達水平發生了改變;相比于模型組,P53、P21和P16蛋白水平明顯下降,Rb蛋白水平顯著上升,結果由圖9(a)—(b)所示。轉染Glu-miR-03的結果與之一致,結果如圖9(c)—(d)所示。以上結果表明,靈芝miRNA mimics對衰老相關p53/p21/Rb信號通路的關鍵蛋白具有調控作用,提示靈芝特異miRNA可能通過調控p53/p21/Rb信號通路延緩HSF細胞衰老。

圖9 靈芝miRNA轉染后HSF衰老細胞相關蛋白表達變化示意圖

3 結 論

本文探究了中藥靈芝中特異miRNA對細胞衰老的作用及影響,主要結論如下:

a)靈芝特異Glu-miR-01和Glu-miR-03能夠使HSF衰老細胞的SOD和T-AOC水平上升,MDA含量下降,并且能減少SA-β-gal陽性細胞的生成,提高衰老細胞的線粒體膜電位,從而增強細胞的抗氧化能力,對衰老細胞具有積極的修復作用。

b)靈芝Glu-miR-01和Glu-miR-03都能下調HSF衰老細胞中p53/p21/Rb信號通路上的關鍵蛋白P53、P21、P16表達,上調Rb蛋白的表達,證明靈芝Glu-miR-01和Glu-miR-03對衰老細胞的p53/p21/Rb信號通路具有調控作用。本文為闡明靈芝特異miRNA對延緩衰老的作用機制提供了理論依據,為進一步研究靈芝miRNA跨界調控的分子機制奠定了基礎。