MED8表達與肝癌臨床病理特征及其預后的相關性分析

吳 爽 張濤元 李 俏 曹三成 王增國 祝擷英

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第六大最常見的癌癥,也是癌癥相關死亡的第四大原因[1]。肝癌的分子機制還不完全清楚。由于缺乏有效的早期診斷和靶向治療,5年生存率僅為11%[2]。主流的檢測方法包括計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)和糖蛋白生物標志物(如甲胎蛋白)[3]。然而,這些方法有各種限制:CT和MRI昂貴且難以廣泛應用,而糖蛋白生物標記物因缺乏對腫瘤區域特異性而受到限制。鑒于早期腫瘤檢測可顯著提高HCC患者生存率,探索新的標志物非常重要。

Mediator是一種進化上保守的多蛋白復合物,在人類中由33個亞基組成,是轉錄過程中不可或缺的調節因子[4]。研究表明,某些Mediator亞家族成員的表達在腫瘤中發生了較顯著的變化,例如中介體復合物亞基8(mediator complex subunit 8,MED8)在結直腸癌細胞系中發生突變[5];此外,MED8在腎透明細胞癌中的表達與存活時間短、TNM分期相關,且MED8在轉移性腫瘤中的表達高于原發腫瘤[6]。然而,MED8與HCC之間的相關性尚未得到評估。

本研究基于TCGA數據分析了MED8在HCC中的表達及預后價值。我們證實,在HCC樣本中,MED8表達升高,并與較差的總生存率相關,我們的研究為HCC提供了一種新的診斷和預后指標。

1 材料與方法

1.1 MED8在泛癌及HCC中的表達差異驗證

利用UCSC XENA(https://xenabrowser.net/datapages/)下載經Toil流程統一處理的TCGA和GTEx的TPM(transcripts per million reads)格式的RNAseq數據,Wilcoxon rank sum test法比較MED8在GTEx聯合TCGA的癌旁組織樣本和TCGA對應的腫瘤樣本中的表達情況。同時,從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) 下載HCC項目中level 3 HTSeq-FPKM(Fregments Per Kilobase per Million)格式的RNAseq數據以及臨床數據。將FPKM格式的RNAseq數據轉換成TPM格式后進行HCC癌旁組織及其配對的癌組織樣本間的表達比較。

1.2 Western blot驗證MED8在正常肝細胞QSG-7701及肝癌細胞HepG2中的表達差異

將QSG-7701及HepG2分別接種于10 cm含牛血清的培養基中培養48 h,RIPA裂解后提取總蛋白并檢測蛋白濃度,經過電泳、轉膜,兔抗人MED8抗體(購買于Invitrogen Ebioscienc公司)孵育及二抗孵育后,以GAPDH為內參比較MED8在兩種細胞中的表達情況。

1.3 MED8在HCC中的共表達分析、可視化顯示及共表達基因的富集分析

按照MED8表達量的中位值將HCC患者分為高表達組和低表達組,通過DESeq2包對HTSeq-Counts數據分析表達差異基因,火山圖用于展示差異分析的結果(參數設置如下:|logFC|>2,padj<0.05)。clusterProfiler包用于分析基因的本體論(gene ontology,GO)富集分析,包括生物過程(biological process,BP),細胞組分(cellular components,CC)和分子功能(molecular function,MF)),以及京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。

1.4 HCC患者樣本MED8和C1qc蛋白表達水平

通過Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)分析HCC組織和正常肝組織中MED8和C1qc蛋白表達水平,以免疫組化結果進行呈現。

1.5 MED8與HCC臨床病理的相關性及預后分析

通過Kruskal-Wallis rank sum test統計方法分別比較MED8表達與HCCT分期、病理分期、組織學分級的關系。按照MED8表達值的中位數,將LIHC數據分為MED8高表達組及低表達組,利用survminer包繪制Kaplan-Meier 圖,用于評估MED8對HCC總生存期(overall survival,OS)及疾病相關生存率(Disease-Specific Survival)的預測價值;同時對MED8進行亞組分析,比較在HCCT分期的T1&T2&T3&T4亞群、病理分期的Stage I&Stage II&Stage III&Stage IV亞群、組織學分級G1&G2&G3&G4亞群中MED8對其OS的預測價值。最后通過ROC曲線,分析MED8對HCC的診斷效能。ROC曲線橫坐標為假陽性率(false positive rate,FPR),縱坐標為真陽性率(true positive rate,TPR)。

1.6 統計學方法

應用R語言對數據進行分析處理,各數據的比較采用Wilcoxon signed rank test或Kruskal-Wallis rank sum test,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MED8在16種腫瘤組織中差異表達

Wilcoxon rank sum test法,比較MED8在GTEx聯合TCGA的正常樣本和TCGA對應的腫瘤樣本中的表達情況。結果顯示,與正常樣本相比,MED8在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形成性膠質細胞瘤(GBM)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、腎透明細胞癌(KIRC)、肝細胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、胃癌(STAD)、子宮內膜癌(UCEC)組織中呈高表達,在腎嫌色細胞癌(KICH)和甲狀腺癌(THCA)組織中呈低表達,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 MED8在HCC組織中的表達情況

Wilcoxon signed rank test法比較50例HCC樣本以及配對的HCC癌旁樣本中的MED8的表達情況。結果發現,MED8在HCC樣本中呈高表達,差異具有統計學意義(P<0.001,圖1A)。進一步實驗驗證結果表明,與正常肝細胞QSG-7701相比,MED8在肝癌細胞HepG2中呈高表達(圖1B)。免疫組化實驗也表明,與正常人肝組織相比,MED8在肝癌組織中呈高表達(圖1C)。

注:A為MED8在HCC及配對癌旁樣本中表達情況;B為Western blot檢測MED8蛋白表達水平;C為MED8在正常肝組織和HCC組織中的表達。

2.3 MED8在HCC中的共表達及富集分析

根據MED8在HCC中表達情況,以中位數為截點將患者分成高表達組和低表達組。差異分析結果顯示,兩組共有582個差異表達基因,其中536個基因顯著上調,46個基因顯著下調(圖2A)。GO富集分析及KEGG通路富集分析結果顯示,差異表達基因主要參與補體的激活,離子反應等生物過程,如圖2B所示。免疫組化實驗表明,補體激活明星分子C1qc蛋白表達水平在HCC 標本中升高(圖2C)。GEPIA數據庫分析顯示,在肝癌中,MED8與C1qc的表達呈正相關(R=0.47,P<0.001,見圖2D)。

注:A為火山圖分析差異表達基因;B為富集分析;C為C1qc在正常肝組織和HCC組織中的表達;D為MED8與C1qc相關性檢測。

2.4 MED8表達與HCC腫瘤分期、病理分期及組織學分級的關系

MED8表達與TCGA肝細胞肝癌的T分期(圖3A)、病理分期(圖3B)、組織學分型(圖3C)呈顯著正相關。

注:A為MED8與HCCT分期的相關性;B為MED8與HCC病理分期的相關性;C為MED8與HCC組織學分型的相關性。

2.5 MED8表達對HCC患者OS及疾病相關存活率的預測價值

以MED8表達值的中位數為截點,將HCC患者分為高表達組和低表達組。KM曲線結果顯示:MED8高表達患者OS短[HR=2.49(1.74～3.58),P<0.001,圖4A]及疾病相關存活率低[HR=2.57(1.62～4.07),P<0.001,圖4B]。

注：A為KM曲線預測兩組HCC患者總生存期;B為KM曲線預測兩組HCC患者疾病相關生存率;C為MED8在HCC的T分期中的亞組分析;D為MED8在HCC的病理分期中的亞組分析;E為MED8在HCC的組織學分級中的亞組分析。

2.6 MED8的亞組預后分析

對HCC的T分期、病理分期、組織學分級進行亞組分析,結果顯示:高表達MED8與T分期的T1&T2&T3&T4亞群[HR=2.46(1.72～3.54),P<0.001,圖4C]、病理分期的Stage Ⅰ&Stage Ⅱ&Stage Ⅲ&Stage Ⅳ亞群[HR=2.47(1.69～3.62),P<0.001,圖4D]、組織學分級的G1&G2&G3&G4亞群[HR=2.49(1.73～3.60),P<0.001,圖5E]呈顯著相關性。

圖5 ROC曲線

2.7 ROC曲線評價MED8在HCC中的診斷價值

ROC分析結果顯示:曲線下面積為0.817(95%CI 0.778～0.857),提示MED8對肝癌有一定的診斷準確性(圖5)。

3 討論

介體復合物是基因轉錄的關鍵調節因子。Mediator分為四個不同的子模塊:頭、中、尾和激酶[7]。MED的頭部和中間模塊可以直接與RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,POLⅡ)相互作用,作為轉錄因子和上游調控元件結合機制之間的橋梁。MED8、MED18和MED20表示中介頭域的子模塊。MED頭模塊主要由SRB編碼的蛋白質組成[8]。研究表明,MED19[9],MED15[10],MED23[11]在HCC中升高,且與HCC預后相關。但很少有研究評估MED8和癌癥之間的關系。MED8被認為是一種多結構域蛋白,由一個n端螺旋結構域、一個靈活的配體和一個與Med18(25)16相互作用的c端螺旋結構域組成。MED8在所有真核生物的轉錄中起著重要的作用,其功能和/或組成的改變可能會產生重要的功能后果,導致包括癌癥在內的各種疾病。免疫組化檢測到MED8在腎透明細胞癌中表達高水平,沉默MED8會降低腎透明細胞癌細胞的增殖和運動能力。其他研究表明,MED8在結腸癌中會發生突變[5,12-13]。然而,MED8表達與HCC發生和預后的關系尚未見報道。

為了明確MED8在HCC中的作用,我們分析了來自TCGA的完整臨床信息的371例HCC患者的數據。結果表明,HCC組織中MED8表達水平高于正常組織。此外,MED8高表達與T分期、病理分期、組織學分級等病理參數密切相關,提示MED8高表達參與了HCC的侵襲轉移。結合MED8高表達組HCC患者總生存率低于MED8低表達組,提示MED8可能作為HCC新的診斷和預后標志物。本文根據MED8在HCC中表達的中位數將其分為高表達組和低表達組,并進行差異分析及GO分析。結果顯示,與MED8共表達的基因主要參與補體激活,細胞對銅離子反應等生物過程。補體激活是先天免疫的組成部分,能夠抵御入侵病原體。肝臟是合成補體成分的主要來源(>80%),并表達多種補體受體。HCC與先天性及適應性免疫失調密切相關,而免疫網絡的核心是補體級聯,這是肝臟固有的基本防御系統[14]。研究表明,腫瘤微環境中的補體激活增強了腫瘤生長并增加了轉移,可以幫助腫瘤逃避免疫消除[15-16]。HCC是一種以慢性炎癥、纖維化和肝硬化為特征的免疫原性癌癥。由于HCC幾乎僅在慢性炎癥環境中出現[17],因此過早的補體激活可能是腫瘤炎癥過程的潛在驅動因素。因而,我們猜測MED8通過調控補體激活通路從而影響HCC患者預后。免疫組化分析結果表明,補體激活經典通路分子C1qc在肝癌患者癌組織升高,這與Lee等[18]的報道一致。同時,MED8與C1qc表達水平正相關性。這些結果表明,MED8可能通過上調C1qc水平調控HCC進展。在后續實驗中,我們將通過細胞實驗和動物學實驗驗證MED8通過C1qc調控HCC進展的分子機制。

綜上所述,MED8高表達與HCC的T分期、病理分期、組織學分級等病理參數密切相關,MED8可能是HCC診斷和預后的有效生物標志物。同時,我們對MED8調控HCC的分子機制進行了初步研究,從而為開發HCC抗癌藥物提供了新的思路。