不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉的體外發酵特性研究

王書軍，王 乾，王紹康

（天津科技大學 食品營養與安全國家重點實驗室 天津 300457）

人類胃腸道中定植著數量龐大、種類繁多的微生物，這些微生物統稱為“腸道菌群”[1]。腸道菌群與宿主的營養吸收、代謝和免疫等功能密切相關[2]。菌群失調會增加肥胖、糖尿病及炎癥性腸病等很多慢性疾病的患病風險[3]。除受宿主遺傳和環境因素等影響外，飲食也是影響腸道菌群的重要因素[4]。在上消化道不被消化的碳水化合物可以到達結腸而被腸道菌群發酵，產生包括氣體、短鏈脂肪酸等在內的一系列代謝產物。其中，大約95%的短鏈脂肪酸可以被結腸細胞快速吸收，而未被吸收的部分則通過糞便排出體外[5]。研究表明，短鏈脂肪酸，尤其是丁酸，不僅是結腸上皮細胞的主要能量來源，還與結腸炎癥和結腸癌的發生和發展密切相關[6]，在維持結腸健康方面發揮著重要的作用。

淀粉作為人們日常生活中的主要碳水化合物來源，其在腸道中的消化和發酵特性對人體健康至關重要。在人體小腸中未被消化的淀粉（又稱為抗性淀粉）會進入結腸，被腸道菌群利用，進而改善菌群結構并產生諸如短鏈脂肪酸等代謝產物。馬鈴薯淀粉作為一種典型的2 型抗性淀粉，其在腸道中的發酵特性已被研究。例如，體外發酵試驗發現，相比于普通玉米淀粉和蠟質玉米淀粉，馬鈴薯淀粉具有較慢的體外發酵速率及高丁酸產量[7]。動物實驗表明，相比玉米、小麥和大米淀粉，馬鈴薯淀粉能夠顯著增加小鼠糞便中阿克曼菌屬（Akkermansia）、理研菌科（Rikenellaceae）的相對豐度[8]，以及改善高脂飲食誘導大鼠的腸道菌群失調及炎癥的發生[9]。大多數淀粉在食用前都要經過一定程度的熱加工，導致其酶抗性降低，到達結腸的抗性淀粉量減少。然而，在一些情況下，如淀粉被親水膠等物質包裹后，很多可消化的淀粉能夠逃脫小腸的消化而到達結腸，成為腸道菌群的發酵底物[10]。然而，關于可消化性淀粉在結腸中的發酵特性還鮮有報道。

本文以馬鈴薯淀粉為研究對象，通過精準控制水分含量和加熱溫度，制備出一系列不同凝膠化程度的淀粉樣品，利用體外糞便發酵模型探究其發酵特性，測定其在不同發酵時間的產氣量、短鏈脂肪酸產量，并探究不同凝膠化程度的馬鈴薯淀粉在發酵結束時對腸道菌群組成影響的異同。試驗結果對于明確可消化淀粉到達結腸對腸道健康的影響，以及設計開發靶向改善結腸健康的淀粉類食品具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設備

1.1.1 材料與試劑 馬鈴薯淀粉、低聚果糖（Fructooligosaccharide，FOS）、半胱氨酸鹽酸鹽，美國Sigma 公司；硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈷等無機鹽，國藥集團化學試劑公司；4-甲基戊酸，上海麥克林生化科技公司。

1.1.2 儀器與設備 HJ-M6 數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，江蘇新春蘭科技公司；FE20/EL20 pH 計，上海梅特勒-托利多公司；TG16-WS 臺式高速離心機，湘儀離心機儀器公司；Scientz-10N 真空冷凍干燥器，寧波新芝生物科技公司；DSC200 F3 示差掃描量熱儀，德國Netzch 公司；GC-2010 Plus 熱脫附氣相色譜，日本Shimadzu（島津）公司；ZBFFAP 熔融石英毛細管柱，美國Scientific 公司；SU3800 掃描電子顯微鏡，日本日立公司；HV-85高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技公司；FE20/EL20 冷凍研磨儀，上海梅特勒-托利多公司；YQX-Ⅱ厭氧培養箱，上海新苗公司；SW-CJ-2G 超凈工作臺，蘇州凈化設備公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉樣品的制備不同凝膠化程度的馬鈴薯淀粉的制備方法參考Wang 等[11]的報道并略作修改。準確稱取10 g 馬鈴薯淀粉（水分含量為16.0%）于聚丙烯袋中，加入適量蒸餾水制成不同水分含量（50%，45%，40%，50%，60%，濕基）的淀粉樣品。將淀粉與水充分混合后，分別于特定的對應溫度（56，64，66，66，71℃）下加熱10 min。加熱完成后立即放入液氮速凍10 min，凍干，研磨成粉。

準確稱取3 mg 上述加熱淀粉于40 μL 的鋁盤中，向其中加入9 μL 蒸餾水，將制備好的樣品在室溫下平衡12 h，然后進行示差掃描量熱分析。以空鋁盤坩堝為參比，測定溫度范圍為20～100℃，掃描速度為10 ℃/min。所有樣品的測定至少重復3 次。淀粉的凝膠化程度（Degree of gelatinization，DG）計算公式[12]如下：

式中，ΔH熱處理淀粉——加熱淀粉的焓值，J/g；ΔH天然淀粉——天然淀粉的焓值，J/g。

1.2.2 體外發酵試驗 以天然馬鈴薯淀粉和上述不同凝膠化程度的馬鈴薯淀粉為底物，根據略作修改后的Lebet 等[13]的方法進行體外發酵試驗。將配制好的碳酸-磷酸緩沖液于121 ℃下高溫滅菌20 min，趁熱加入半胱氨酸鹽酸鹽，隨即沖入CO2，待溶液從藍色變成粉色，轉入厭氧箱中放置過夜，待其變為無色后使用。

新鮮糞便樣本取自天津科技大學食品科學與工程學院招募的3 名健康供體（1 男2 女，18.5 kg/m2＜BMI ＜24.9 kg/m2）[14]。供體的選擇標準主要包括：1）無飲食限制和任何消化疾病史；2）過去至少3 個月內未服用任何抗生素；3）過去兩周內未服用任何益生菌產品。等量收集3 名供體的新鮮糞便并立即轉入厭氧箱中，使用預還原的碳酸-磷酸緩沖液對糞便樣品進行稀釋（m糞便∶V緩沖液=1∶4），隨后用4 層紗布過濾后收集糞便菌液。準確稱量50 mg 淀粉于預先滅菌好的西林瓶中，然后分別加入1 mL 菌液和4 mL 緩沖液，充分混勻后立即用橡膠塞和鋁蓋密封，并移至37 ℃恒溫水浴鍋中進行孵育培養。以上所有工作均在糞便收集之后的2 h 內完成。在發酵不同時間點（0，4，8，12 h和24 h）測定其氣體產量和pH 值，將不同發酵時間點的發酵液等分至2 mL Eppendorf 管，于-80℃下冷凍保存，用于后續的SCFA 和16S rRNA 測序。同時將不同時間點收集的發酵殘渣進行冷凍干燥，掃描電子顯微鏡觀察。將添加低聚果糖（FOS）和未添加任何碳水化合物的發酵液分別作為陽性對照和陰性對照。

1.2.3 淀粉樣品的結構觀察 將不同凝膠化程度的馬鈴薯淀粉及在不同發酵時間收集的發酵殘渣用雙面導電膠固定于樣品臺上，噴金處理，用掃描電子顯微鏡（SU3800）在5 kV 電壓下觀察淀粉樣品的形貌、結構。

1.2.4 短鏈脂肪酸（SCFAs）的測定 采用Wang等[15]的方法測定不同時間點發酵液中短鏈脂肪酸含量。首先，將-80 ℃下的冷凍樣品解凍并離心（13 000 r/min，10 min）。取400 μL 上清液與100 μL 含有1.56 mg/mL 硫酸銅、5%偏磷酸和4-甲基戊酸的溶液混合，使用0.45 μm 濾膜過濾后，準確吸取0.2 μL 濾液注入配備熔融石英毛細管柱的氣相色譜儀中進行測定。初始柱箱溫度設定為80℃，注入器和檢測器溫度均設置為230 ℃，柱溫以8 ℃/min 的速率升至192 ℃后保持3 min。以氮氣為載氣，流速為1 mL/min。

1.2.5 糞便樣本細菌16S rRNA 基因測序

1.2.5.1 樣本DNA 提取及V3-V4 區擴增 使用TGuide S96 DNA 試劑盒對解凍樣品進行核酸提取，使用Qubit dsDNA HS 試劑盒和Qubit 4.0 熒光儀對樣品DNA 濃度進行檢測。分別使用引物338F ：5′ -ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3′ 和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′對 樣本中提取的DNA 進行16S rRNA 基因V3-V4 區域的擴增。擴增完成后，使用Illumina novaseq 6000 對其進行雙端測序。

1.2.5.2 生物信息學及多變量統計學分析 測序生成的序列使用QIIME2 中的DADA2 方法去噪[16-17]，雙端序列拼接并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。以SILVA 為參考數據庫，使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學注釋，可得到每個特征對應的物種分類信息，進而在門（Phylum）和屬（Genus）水平上統計、比較并可視化為直方圖。為探究微生物的群落變化，采用Shannon、Simpson、Chao 1 和ACE 等指標研究其α-多樣性。為進一步明確短鏈脂肪酸與腸道菌群的相關性，對發酵結束時屬水平豐度前15 位的微生物及相應樣品的乙酸、丙酸和丁酸濃度進行皮爾遜（Pearson）相關分析并構建相關性熱圖。

1.2.6 數據處理 試驗數據用至少兩組平行試驗的平均值±方差表示，采用SPSS 統計軟件（美國SPSS 公司）進行數據的單因素方差分析（ANOVA），鄧肯檢驗（P<0.05）差異分析。產氣及產酸曲線均由GraphPad Prism 軟件（Version 7.0，美國GraphPad software 公司）繪制而成。

2 結果與分析

2.1 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉的制備

不同加熱條件處理得到的馬鈴薯淀粉的熱力學參數及其對應的凝膠化程度如表1 所示?？梢钥闯?，通過控制加熱條件制備出凝膠化程度從16%至100%的凝膠化馬鈴薯淀粉。在隨后的試驗中，不同凝膠化淀粉樣品采用DGn 的形式表示，n代表凝膠化程度。

表1 馬鈴薯淀粉樣品的熱力學參數及其凝膠化程度Table 1 Thermal transition parameters and degree of gelatinization of potato starch samples

2.2 產氣量

體外發酵過程中的產氣量通常被認為是膳食纖維發酵速率的粗略指標[18]。不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉在不同發酵時間點的產氣曲線如圖1 所示。低聚果糖（FOS）在整個發酵過程中產氣量最高，表明其發酵速率最快。與FOS 相比，天然馬鈴薯淀粉（NPS）的產氣量明顯下降，發酵24 h 后，其產氣量（～10 mL）僅為FOS 的2/3。在發酵前半段（0～12 h），凝膠化馬鈴薯淀粉的產氣量均高于天然馬鈴薯淀粉，且隨著凝膠化程度的增加，其產氣量呈現增加趨勢。在發酵后半段（12～24 h），天然馬鈴薯淀粉（NPS）和低凝膠化淀粉樣品（DG16）產氣量仍然有顯著的增加，其它樣品的產氣量則不再發生明顯的變化，且沒有顯著性差異。這可能是由于中、高凝膠化程度的淀粉樣品在發酵前半段已被快速利用，而天然淀粉（NPS）和低凝膠化程度淀粉（DG16）被利用的相對較慢，導致產氣量增加緩慢。前期研究發現，在結腸快速發酵的食物會導致其在結腸近端產生較多的氣體，進而引起脹氣等腸胃不適應癥等不良反應[19]。

圖1 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉樣品在發酵不同時間點的產氣曲線Fig. 1 Gas production curves of potato starch samples with different gelatinization degrees at different fermentation time points

2.3 形貌變化

不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉及其在不同發酵時間點樣品的掃描電鏡圖如圖2 所示。由于天然淀粉（NPS）和部分凝膠化淀粉樣品（DG16、DG49、DG65 和DG76）發酵24 h 后收集不到淀粉殘渣，因此僅展示發酵前12 h 的淀粉形貌變化；而對于完全凝膠化的淀粉樣品（DG100），發酵8 h 后就收集不到淀粉殘渣，僅展示發酵4 h 的形貌變化。不同淀粉樣品隨著發酵時間的延長表現出不同的形貌變化。天然和低凝膠化程度的馬鈴薯淀粉樣品（DG16）經4 h 發酵，淀粉顆粒表面變得粗糙，少量淀粉顆粒表面出現裂紋，發酵12 h 后仍能觀察到相對完整的淀粉顆粒結構。中、高凝膠化程度淀粉樣品（DG49、DG65 和DG76）經4 h 發酵，絕大多數淀粉顆粒遭到嚴重破壞，經12 h 發酵，只剩余淀粉碎片和少數帶有孔洞的淀粉殘渣。所有淀粉樣品在發酵24 h 后無剩余淀粉殘渣，表明其幾乎被微生物完全降解。對于完全凝膠化淀粉樣品，發酵4 h 后只能觀察到少量的微小碎片，表明其被微生物嚴重降解。淀粉發酵過程中微觀形貌的變化與其產氣量的變化相吻合。

圖2 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉體外發酵前及發酵中的SEM 圖Fig. 2 SEM images of potato starches with different DG before and during in vitro fecal fermentation

2.4 pH 值及短鏈脂肪酸測定

不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉樣品在不同發酵時間點的pH 值變化曲線如圖3 所示。在發酵前4 h，陽性對照FOS 組和完全凝膠化淀粉組（DG100）pH 值下降最大，而隨后的發酵沒有顯著改變發酵液的pH 值。中、高凝膠化程度的淀粉樣品（DG49、DG65 和DG76）在前4 h 的發酵過程中溶液的pH 值也快速下降，隨后呈現非常緩慢的下降過程。相比之下，天然馬鈴薯淀粉（NPS）和低凝膠化程度的淀粉樣品（DG16）在前12 h 的發酵過程中，溶液的pH 值雖然出現顯著的下降，但是其pH 值均高于其它樣品。在隨后的12～24 h 發酵過程中，DG16 溶液的pH 值不再發生顯著的變化。

圖3 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉在發酵不同時間點的pH 值變化曲線Fig. 3 pH value change curves of potato starches with different DG during in vitro fecal fermentation course

為了更好地了解不同凝膠化程度的淀粉在發酵過程中產短鏈脂肪酸的差異，測定發酵液中乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的含量（圖4）。低聚果糖在發酵前8 h 快速產生了最高含量的短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸及總短鏈脂肪酸），而在8～24 h，短鏈脂肪酸的產量幾乎沒有增加。相比之下，中、高凝膠化程度的淀粉樣品（DG49、DG65 和DG76）和完全凝膠化淀粉樣品（DG100）在發酵前12 h 產生較高含量的短鏈脂肪酸，且隨著凝膠化程度的增加呈現逐漸增加的趨勢，隨后的發酵階段（12～24 h）幾乎沒有發生明顯的變化。天然馬鈴薯淀粉和低凝膠化程度淀粉（DG16）在整個發酵過程中，短鏈脂肪酸的含量都在緩慢增加，發酵24 h 后，其產生的短鏈脂肪酸量（除丁酸外）均低于其它底物。發酵結束時，除完全凝膠化的淀粉樣品（DG100），所有淀粉樣品的丁酸產量均高于低聚果糖，表明部分凝膠化后的馬鈴薯淀粉，尤其是中、低凝膠化程度的淀粉（DG16 和DG49）是良好的丁酸來源底物。

圖4 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉樣品在不同發酵時間的乙酸（a）、丙酸（b）、丁酸（c）和總短鏈脂肪酸（d）的產量圖Fig. 4 Acetate（a），propionate（b），butyrate（c）and total SCFA（d）production of potato starch samples with different DG at different fermentation time

2.5 腸道菌群分析結果

2.5.1 α-多樣性分析 為了評估體外發酵24 h后不同底物的細菌群落生態特征，對細菌的α-多樣性指數進行測定。其中，Chao 1 指數和ACE 指數主要用于衡量物種的豐富度，Shannon 指數和Simpson 指數用于反映物種的多樣性[20]。不同樣品發酵后菌群的α-多樣性指數如表2 所示。與空白組相比，所有樣品的菌落豐富度指數（ACE 指數和Chao 1 指數）和群落多樣性指數（Simpson 指數和Shannon 指數）均有所增加；相較于陽性對照FOS，天然馬鈴薯淀粉及不同凝膠化程度的馬鈴薯淀粉（DG65 除外）樣品組表現出更高的豐富度指數（ACE 指數和Chao 1 指數）和更高的群落多樣性指數（Simpson 指數和Shannon 指數），盡管這些數據之間的統計學差異不是很明顯。這些結果表明，不同凝膠化程度的淀粉發酵后均能一定程度地提高菌群的豐富度和多樣性。

表2 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉體外發酵24 h 后的α-多樣性指數Table 2 α-diversity indices of potato starch with different DG after 24 h of in vitro fermentation

2.5.2 門水平及屬水平的物種豐度變化 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉發酵對腸道菌群在門水平相對豐度的影響如圖5 所示。由圖可知，厚壁菌門和擬桿菌門是腸道菌落的主導菌群，其相對豐度占據總細菌群落的90%以上。除此之外，變形菌門、放線菌門及脫硫桿菌門的豐度也相對較高。與空白組相比，FOS 組的厚壁菌門的相對豐度呈略微下降趨勢；天然馬鈴薯淀粉和低凝膠化程度的馬鈴薯淀粉樣品（DG16）組的擬桿菌門豐度增加，而厚壁菌門豐度減少。中、高凝膠化程度的馬鈴薯淀粉組（DG49、DG65 和DG76）和完全凝膠化淀粉組（DG100）在門水平的菌群變化要小于天然淀粉和低凝膠化淀粉組，與FOS 組類似。與空白對照相比，所有樣品組的變形菌門的豐度均有所下降。

圖5 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉體外發酵24 h 后對腸道菌群門水平物種豐度的影響Fig. 5 Changes in microbiota composition at phylum level after 24 h of in vitro fermentation of potato starches with different DG

為了進一步明晰不同凝膠化程度導致的細菌群落差異，選取發酵24 h 后相對豐度前15 的屬進行比較（圖6）。與空白組相比，FOS 發酵雖明顯促進巨單胞菌屬（Megamonas）的生長，但降低了糞桿菌屬（Faecalibacterium）和瓊脂桿菌屬（Agathobacter）的豐度。與FOS 組相比，天然馬鈴薯淀粉發酵增加了擬桿菌屬（Bacteroides）及毛螺菌科（unclassified Lachnospiraceae）的相對豐度，降低了巨單胞菌屬的相對豐度；低凝膠化程度的馬鈴薯淀粉（DG16）發酵對菌群具有類似的影響，增加了羅斯氏菌屬（Roseburia）的相對豐度。中、高凝膠化淀粉組（DG49、DG65 和DG76）和完全凝膠化淀粉（DG100）發酵對菌群的影響與FOS 類似，且隨凝膠化程度的增加，巨單胞菌屬的相對豐度逐漸增加。此外，凝膠化程度為49%的淀粉樣品（DG49）在發酵過程中顯著增加了丁酸產生菌布勞特氏菌屬（Blautia）的相對豐度。

圖6 不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉體外發酵24 h 后屬水平微生物群物種豐度變化Fig. 6 Changes in microbiota composition at genus level after 24 h of in vitro fermentation of potato starches with different DG

2.5.3 菌群變化與短鏈脂肪酸的相關性分析 為進一步明晰菌群變化與短鏈脂肪酸生成的關系，選取屬水平相對豐度前15 的微生物與乙酸、丙酸和丁酸的生成量做相關性分析（圖7）。巨單胞菌屬的相對豐度與乙酸（P<0.001）和丙酸（P<0.01）的生成量呈現顯著的正相關關系，這一結果與之前報道巨單胞菌屬可以葡萄糖為發酵底物生成乙酸和丙酸的結果相一致[21]，這也很好地解釋了FOS 和中、高凝膠化程度淀粉組（DG49、DG65 和DG76）在發酵結束時產生高乙酸和丙酸的原因。毛螺菌科和羅斯氏菌屬的相對豐度與丁酸產量呈顯著的正相關關系（P ＜0.001），表明這兩種細菌是重要的產丁酸菌，與之前的報道類似[15，22-24]。低凝膠化程度的淀粉樣品（DG16）發酵后羅斯氏菌屬和毛螺菌科的相對豐度均增加，與其高丁酸產量結果一致（圖4c）。由于天然馬鈴薯淀粉（NPS）發酵使得毛螺菌科的相對豐度增加更多，而其丁酸產量卻低于低凝膠化程度的淀粉樣品（DG16），這些表明羅斯氏菌屬是更為重要的丁酸生成菌。

圖7 體外發酵24 h 后腸道菌群（屬水平）相對豐度與乙酸、丙酸和丁酸生成量的相關性熱圖Fig. 7 Heatmap of the relationships between relative abundance of microbiota（genus level）and levels of acetate，propionate and butyrate after 24 h in vitro fermentation

3 結論

本試驗研究了不同凝膠化程度馬鈴薯淀粉的體外發酵特性，觀察了其在發酵過程中的形貌變化。結果表明，產氣量、乙酸和丙酸產量在發酵前半段（0～12 h）均隨凝膠化程度的增加而逐漸上升，而在發酵后半段（12～24 h）不再發生顯著的變化。天然淀粉和低凝膠化程度淀粉則在整個發酵過程中緩慢產生氣體和短鏈脂肪酸。低凝膠化程度馬鈴薯淀粉（DG16）和中等凝膠化程度馬鈴薯淀粉（DG49）發酵分別促進了丁酸產生菌羅斯氏菌屬、毛螺菌科和布勞特氏菌屬的生長，導致其在發酵結束時具有最高的丁酸產量。中、高凝膠化程度淀粉組（DG49、DG65 和DG76）更好地促進了巨單胞菌屬的增值，導致在發酵結束時產生較高的乙酸和丙酸。綜上，中、低凝膠化淀粉馬鈴薯淀粉（DG16、DG49）可以通過促進產丁酸菌的微生物生長及丁酸的產生來改善結腸健康，是潛在調控腸道健康功能性食品的優良底物選擇。