新疆一枝蒿不同部位水提物的體外抗炎效果

邢天驕,彭凌峰,馬丹陽,高雪嫣,趙紅瓊,郝智慧

(1.新疆農業大學動物醫學學院,新疆 烏魯木齊 830052;2.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

新疆一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)為菊科蒿屬植物,廣泛分布于我國新疆天山、阿爾泰山和昆侖山等地,是一味歷史悠久的新疆道地藥材,在新疆民間一直沿用至今[1]。新疆一枝蒿性寒,味辛、苦,具有祛風解表、健胃消積、活血散瘀的功效[2]。臨床上常用來治療風寒感冒、毒蛇咬傷和跌打腫痛等[3],其化學成分主要包括黃酮類、倍半萜類、有機酸、多糖類、揮發油類和生物堿等[4]。新疆一枝蒿作為一種傳統中藥材,其藥理作用受到越來越多人的關注。藥理學研究表明,新疆一枝蒿具有抗病毒、抗過敏、促消化、抗炎和調節免疫功能等藥理作用[5-8]。然而,目前對新疆一枝蒿的開發和利用還存在不足,為了進一步在獸醫臨床上提高對該藥材的綜合利用,本試驗基于體外炎癥模型,對比研究了新疆一枝蒿不同部位(葉、莖、花)水提物抗炎效果的差異,以期提高藥材使用效率,為新疆一枝蒿藥材在獸醫臨床的應用和開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物 新疆一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.),采集于新疆吐魯番市鄯善縣達浪坎鄉喬亞村,室內通風干燥后避光保存。

1.1.2 細胞 小鼠單核巨噬白血病細胞(RAW 264.7),購自美國細胞培養物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)細胞庫。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養基和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),均購自美國默克有限公司;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantification PCR,RT-qPCR)試劑盒和逆轉錄試劑盒,均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline,PBS)、細胞裂解液、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、10×TBST緩沖液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液和10×電泳轉移緩沖液,均購自北京索萊寶科技有限公司;噻唑藍(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT),購自上海麥克林生物科技股份有限公司;BCA蛋白定量試劑盒,購自康為世紀生物科技股份有限公司;PVDF膜,購自密理博中國有限公司(上海)公司;β-actin兔源多克隆抗體、重組Anti-IL-1β抗體、重組Anti-IL-6抗體、重組Anti-TNF-α抗體和山羊抗兔IgG二抗,均購自艾博抗(上海)貿易有限公司;超敏ECL化學發光檢測試劑盒,購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器和設備 KDM電子調溫電熱套,龍口市先科儀器有限公司產品;RE-52AA真空旋轉蒸發儀和SHZ-III循環真空泵,上海亞榮生化儀器廠產品;LRH-250F二氧化碳培養箱,上海一恒公司產品;倒置顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司產品;Infinite M nano酶標儀,帝肯(上海)實驗器材有限公司產品;CFX96 TouchTMReal-time PCR System實時熒光定量PCR儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司產品;Amersham Image Quant 800蛋白印跡成像系統,格來賽生命科技(上海)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備 取新鮮的新疆一枝蒿分離其葉、花和莖,各稱取10 g進行水提液的制備,第1次加10倍量水,室溫浸泡30 min,在100 ℃條件下冷凝回流1 h,濾過,濾渣加8倍量水再次冷凝回流1 h,濾過,合并濾液,用真空旋轉蒸發儀將藥液濃縮至1 g/mL,過0.22 μm濾膜,即得母液。使用FBS和DMEM培養基對母液進行稀釋,得到含10% FBS的新疆一枝蒿葉水提物(YZH-Y)、新疆一枝蒿莖水提物(YZH-J)和新疆一枝蒿花水提物(YZH-H)藥液。

1.2.2 細胞培養 RAW264.7接種于含有10% FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基中,并置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養。

1.2.3 MTT檢測細胞活力度 取對數生長期的RAW264.7,用完全培養基(含10%FBS的DMEM培養基)吹打成細胞懸液。以5×104個/mL的密度均勻接種至96孔板,培養24 h后棄去培養液,分別加入終濃度為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156和0.078 mg/mL的YZH-Y、YZH-J和YZH-H藥液的完全培養基作為試驗組,細胞加完全培養基作為對照組,不含細胞只加入完全培養基作為空白組,每孔100 μL。于細胞培養箱中培養24 h后,每孔加入10 μL MTT溶液孵育4 h,隨后每孔加入150 μL DMSO,10 min后用酶標儀在490 nm下檢測吸光度(Optical density,OD)值,按照公式(1)計算細胞活力度。

細胞活力度(%)=(試驗孔OD值-空白孔OD值)÷(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%

(1)

本試驗在體外用LPS誘導RAW264.7構建炎癥模型,取對數生長期的RAW264.7,同上進行處理,分為對照組、試驗組和LPS模型組。對照組加入完全培養基100 μL,LPS模型組加入含LPS(1 μg/mL)的完全培養基100 μL,試驗組加入含LPS(1 μg/mL)和相應濃度藥物的完全培養基100 μL,培養24 h后,同上使用MTT法檢測每孔的OD值,根據公式(2)計算細胞活力度。

細胞活力度(%)=(試驗孔OD值-對照孔OD值)÷(LPS模型孔OD值-對照孔OD值)×100%

(2)

1.2.4 RT-qPCR檢測炎癥相關基因表達 根據MTT試驗結果,選定藥物濃度為0.625和1.250 mg/mL進行后續試驗。取對數生長期的RAW264.7,以5×105個/mL的密度接種至6孔板,待細胞貼壁后,對照組和LPS模型組加入2 mL完全培養基,0.625 mg/mL藥物濃度組、1.250 mg/mL藥物濃度組、LPS+0.625 mg/mL藥物濃度組和LPS+1.250 mg/mL藥物濃度組分別加入0.625和1.250 mg/mL 的YZH-Y、YZH-J和YZH-H藥液預處理1 h,之后將每孔內液體棄去。不同分組細胞分別加入2 mL對應液體,完全培養基(對照組)、含1 μg/mL LPS的完全培養基(LPS模型組)、含0.625(0.625 mg/mL藥物濃度組)和1.250 mg/mL(1.250 mg/mL藥物濃度組)藥液的培養基和含1 μg/mL LPS和0.625(LPS+0.625 mg/mL藥物濃度組)、1.250 mg/mL藥液(LPS+1.250 mg/mL藥物濃度組)的培養基,培養24 h。采用TRIzol法從細胞樣品中提取總RNA,用逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。按RT-qPCR試劑盒說明書,應用RT-qPCR儀進行炎癥相關基因表達檢測。循環擴增條件:95 ℃預變性2 min,95 ℃持續變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,采集熒光。完成40個PCR擴增周期后,進行熔解曲線分析。以β-actin為內參,檢測TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA差異性表達,引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.5 Western blot法檢測炎癥相關蛋白表達 細胞分組和處理同1.2.4,藥物作用24 h后,棄去液體用 PBS 洗 2 次,加入裂解液 100 μL,在 4 ℃條件下裂解 1 h。將裂解液收集到 1.5 mL離心管中,12 000 r/min離心 10 min,提取細胞蛋白,用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。在蛋白樣品中加5×蛋白上樣緩沖液,100 ℃加熱10 min,使蛋白完全變性,保存于-20 ℃冰箱備用。將蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離后,通過電轉將蛋白轉移至0.45 μm PVDF膜上,用含0.2%明膠的TBST于室溫封閉2 h;4 ℃孵育一抗(β-actin、IL-1β、IL-6和TNF-α)過夜;使用TBST洗3次,每次15 min;二抗孵育2 h;TBST清洗3次,每次15 min;用超敏ECL化學發光液顯影。

1.2.6 統計學分析 所有試驗均進行3次重復,使用SPSS 25統計學軟件進行統計分析,并用GraphPad Prism 8.0進行作圖,采用單因素方差法(Analysis of Variance,ANOVA)分析進行計算統計。在分析結果中,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 新疆一枝蒿葉、莖、花水提物對RAW264.7細胞活力度的影響 如圖1所示,與對照組相比(細胞活力度為100%),YZH-Y濃度介于0.078～1.250 mg/mL時,細胞活力度介于85.73%～88.62%,表明該濃度范圍內YZH-Y對細胞活性無顯著影響;當YZH-Y濃度大于2.500 mg/mL時,細胞活力度極顯著下降(P<0.01),在YZH-Y濃度為2.500、5.000和10.000 mg/mL時,細胞活力度分別為78.64%、58.76%和4.63%;YZH-J濃度介于0.078～5.000 mg/mL時,細胞活力度介于89.02%～109.73%,表明該濃度范圍內YZH-J對細胞活性無顯著影響;YZH-J濃度為10.0 mg/mL時,細胞活力度極顯著下降(P<0.01),細胞活力度僅為20.47%;YZH-H濃度介于0.078～1.250 mg/mL時,細胞活力度介于86.07%～106.85%,表明該濃度范圍內YZH-H對細胞活性無顯著影響;YZH-H濃度為2.500 mg/mL時,細胞活力度顯著下降(P<0.05),為77.88%;YZH-H濃度為5.000和10.000 mg/mL時,細胞活力度極顯著下降(P<0.01),分別為60.24%和5.48%。

圖1 新疆一枝蒿不同部位水提物對RAW264.7細胞活力度的影響(n=3)

2.2 新疆一枝蒿葉、莖、花水提物對LPS誘導下RAW264.7細胞活力度的影響 如圖2所示,與對照組相比,葉、莖、花水提物試驗中LPS模型組細胞活力度下降了7.09%～11.78%。與LPS模型組相比,當YZH-Y在0.313～1.250 mg/mL濃度范圍時,細胞活力度極顯著升高(P<0.01),提高了23.12%～28.14%;當YZH-Y的濃度大于5.000 mg/mL時,細胞活力度極顯著下降(P<0.01);當YZH-J在0.625～2.500 mg/mL濃度范圍時,細胞活力度極顯著升高(P<0.01),提高了10.88%～18.62%;當YZH-J的濃度大于5.000 mg/mL時,細胞活力度極顯著下降(P<0.01);當YZH-H的濃度為0.625和1.250 mg/mL,細胞活力度分別提高了16.13%和16.76%(P<0.05);當YZH-H的濃度大于5.00 mg/mL時,細胞活力度極顯著下降(P<0.01)。

圖2 新疆一枝蒿不同部位水提物對LPS誘導RAW264.7細胞活力度的影響(n=3)

2.3 新疆一枝蒿葉、莖、花水提物對LPS誘導下RAW264.7炎癥相關基因表達的影響 如圖3所示,與對照組相比,葉、莖、花水提物試驗中LPS模型組炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表達極顯著增加(P<0.01)。與LPS模型組相比,0.625和1.250 mg/mL濃度的YZH-Y、YZH-J和YZH-H處理均極顯著降低了IL-1β的mRNA表達(P<0.01);0.625和1.250 mg/mL濃度的YZH-Y和YZH-J處理均極顯著降低了IL-6的mRNA表達(P<0.01),0.625 mg/mL濃度的YZH-H處理極顯著降低了IL-6的mRNA表達(P<0.01);0.625 和1.250 mg/mL濃度的YZH-J處理極顯著降低了TNF-α的mRNA表達(P<0.01),1.250 mg/mL濃度的YZH-Y處理極顯著降低了TNF-αmRNA的表達(P<0.01),1.250 mg/mL濃度的YZH-H處理極顯著升高了TNF-α的mRNA表達(P<0.01)。

圖3 新疆一枝蒿不同部位水提物對LPS誘導RAW264.7中IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA相對表達的影響(n=3)

2.4 新疆一枝蒿葉、莖、花水提物對LPS誘導下RAW264.7炎癥相關蛋白表達的影響 結果如圖4所示,與對照組相比,葉、莖、花水提物試驗中LPS模型組的IL-1β和IL-6的蛋白表達極顯著增加(P<0.01)。與LPS模型組相比,0.625和1.250 mg/mL濃度的YZH-Y、YZH-J和YZH-H處理均極顯著降低了IL-1β的蛋白表達(P<0.01);0.625和1.250 mg/mL濃度的YZH-H處理極顯著降低了IL-6的蛋白表達(P<0.01);1.250 mg/mL濃度的YZH-Y處理極顯著降低了IL-6和TNF-α的蛋白表達(P<0.01);0.625 mg/mL濃度的YZH-H極顯著增加了TNF-α的蛋白表達(P<0.01)。

圖4 新疆一枝蒿不同部位水提物對LPS誘導RAW264.7中IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白相對表達的影響(n=3)

3 討論

MTT法是利用MTT被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成甲臜并經DMSO溶解,通過檢測其OD值來反映細胞活性變化的一種方法,具備快速、簡便等優點。本試驗首先通過MTT法檢測YZH-Y、YZH-J和YZH-H對RAW264.7細胞活力度的影響,結果顯示,YZH-Y、YZH-J和YZH-H在0.078～1.250 mg/mL濃度范圍內對RAW264.7細胞活力度均無顯著影響。隨后進一步探究了3種水提物對LPS誘導RAW264.7細胞活力度的影響,結果顯示,同LPS模型組相比,YZH-Y、ZYH-J和ZYH-H分別在0.313～1.250、0.625～2.500和0.625～1.250 mg/mL濃度范圍進行處理時,細胞活力度顯著提升。根據以上試驗結果,選擇藥物濃度為0.625和1.250 mg/mL進行后續試驗,考察其不同部位的抗炎活性差異。

LPS誘導巨噬細胞釋放炎性介質的模型被廣泛應用于藥物抗炎、抗氧化應激的藥效評價和機制研究。LPS為革蘭陰性細菌細胞壁成分,可刺激巨噬細胞產生炎癥介質,引起炎癥反應[9]。巨噬細胞作為免疫細胞,在炎癥發生過程中會分泌很多細胞因子,參與炎性疾病過程。TNF-α、IL-1β和IL-6三個促炎性細胞因子為炎性疾病過程所關注的重點[10]。IL-1β作為炎癥早期指標,可以誘導和促進其他炎癥因子的分泌,引起炎癥級聯反應和組織損傷,嚴重時可引起全身炎癥反應綜合征、多器官功能衰竭甚至死亡[11]。IL-1β可以促進IL-6的表達,當IL-6與重組人白介素6受體α(Recombinant human interleukin-6 receptor subunit alpha,IL-6Rα)結合時,會增強炎癥反應。在炎癥發生過程中,TNF-α作為炎癥初期的炎癥介質可以同IL-1β和IL-6因子一起發生級聯反應,引起炎癥反應加劇[12]。本試驗中濃度為1 μg/mL的LPS刺激巨噬細胞可以使促炎因子顯著升高,這與張藝等[13]和李玉鳳等[14]的研究結果一致。

本試驗利用RT-qPCR和Western blot試驗進一步檢測TNF-α、IL-1β和IL-6三個炎癥因子的mRNA和蛋白表達,通過表達水平的差異來反映新疆一枝蒿不同部位水提物抗炎效果的差異。結果顯示,與對照組相比,LPS模型組TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達均顯著增加。濃度為1.250 mg/mL的YZH-Y在mRNA和蛋白水平上都極顯著降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。一些研究表明,中藥水提物可通過抑制炎癥介質進而抑制NF-κB通路的激活,以減輕炎癥效果。例如,阿爾泰瑞香水提物可抑制IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子的釋放,發揮抗炎活性[15];翼莖羊耳菊水提物可顯著抑制炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表達,從而發揮較好的抗炎活性[16]。本試驗結果與上述結果類似,表明YZH-Y具有類似的抗炎效果。濃度為0.625 mg/mL的YZH-H可顯著降低IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白表達,但對TNF-α無抑制作用,這與金骨蓮提取物發揮抗炎效果的炎癥因子分泌趨勢類似[17],因此推測YZH-H通過抑制IL-1β和IL-6細胞因子分泌以減輕炎癥狀態。YZH-J則僅通過減少IL-1β的表達發揮抗炎作用。

研究表明,新疆一枝蒿含有豐富的活性成分,其中與抗炎活性有關的化合物多為黃酮和倍半萜類化合物,如一枝蒿酮酸、木犀草素、槲皮素、蘆丁、蒙花苷和芹菜素等均可以發揮抗炎作用[18]。新疆一枝蒿不同部位的活性成分含量也不相同,蘆丁和綠原酸在葉中的含量明顯高于莖和花,木犀草素在葉中含量較高,一枝蒿酮酸和蒙花苷在葉和花中的含量遠高于莖中含量,黃酮和倍半萜類化合物多累積在花和葉中[19-21]。本試驗基于體外RAW264.7炎癥反應,首次對比分析了新疆一枝蒿不同部位(葉、莖、花)水提物的抗炎效果差異。結果表明,新疆一枝蒿不同部位(葉、莖、花)水提物均可通過抑制炎癥因子,發揮抗炎作用,其中濃度為1.250 mg/mL的新疆一枝蒿葉水提物可以抑制炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α的mRNA轉錄和蛋白表達,濃度為0.625和1.250 mg/mL的莖水提物可以抑制炎癥因子IL-1β的mRNA轉錄和蛋白表達,濃度為0.625 mg/mL的花水提物可以抑制炎癥因子IL-6和IL-1β的mRNA轉錄和蛋白表達,該結果可為新疆一枝蒿藥材的獸藥開發和臨床應用提供參考依據。然而,本試驗僅在細胞分子水平上比較了其抗炎差異,相較于動物而言,其機體內環境更加復雜,因此后續還需要通過進一步的動物試驗明確抗炎相關作用機制。