miR-186對HL-60細胞增殖、遷移的調控及機制研究

劉 洋,高長俊

1.河北省保定市第二中心醫院檢驗科,河北保定 072650;2.河北省唐山市婦幼保健院小兒血液科,河北唐山063000

急性髓系白血病發病時原始髓樣細胞出現異常增生,抑制了正常細胞的造血功能,其發病率呈逐年上升趨勢[1]。臨床上通常采用化療的方法來治療急性髓系白血病,但存在藥物的不良反應及藥物耐藥等問題。因此,探索安全、有效的新方法對治療急性髓系白血病的意義重大。

微小RNA(miRNA)是一種小分子RNA,有多項研究在宮頸癌、前列腺癌等多種癌細胞中均發現miRNA家族在細胞增殖和轉移等生物學行為過程中發揮重要調控作用[2-6]。研究表明miRNA能夠影響血液系統腫瘤的發生、發展,在調控人體造血過程中具有非常重要的作用[7-8]?，F已證實miRNA在包括急性髓系白血病在內的血液腫瘤中具有原癌基因或抑癌基因的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通過磷酸化激活絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)進而對下游的多種靶分子的活性產生影響。PI3K/AKT通路參與多種腫瘤細胞的增殖和遷移等過程[9]。關于PI3K/AKT通路介導急性髓系白血病前人也有研究[10]。有文獻報道,在肺腺癌中,miRNA-186(miR-186)參與腫瘤細胞的增殖和遷移是通過介導PI3K/AKT通路完成的[11-12]。但關于miR-186介導PI3K/AKT通路調控人原髓細胞白血病HL-60細胞增殖、遷移等過程的作用機制尚未明確。因此,本研究通過研究miR-186調控PI3K/AKT通路在HL-60細胞增殖、遷移及上皮間質轉化(EMT)過程中的作用,為研究急性髓系白血病提供新的理論依據,現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 HL-60細胞購自北納生物;PI3K/AKT通路抑制劑(LY294002)、PI3K/AKT通路激活劑(SC79)購自上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%,貨號為S43088、S80614;miR-186、陰性對照片段(mimic NC)由上海生工公司進行設計并合成;Lipofectamine 2000陽離子脂質體購自美國Invitrogen公司,貨號為C0075S;5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天公司,貨號為P0013B;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司,貨號為RR820A;鼠抗人磷酸化(p)-PI3K購自上海戶實公司,貨號為HK5745;鼠抗人PI3K貨號為10017175,鼠抗人AKT貨號為10022173,p-AKT貨號為10022023,N-鈣黏蛋白(N-cadherin)貨號為10010628,E-鈣黏蛋白(E-cadherin)貨號為1004426,波形蛋白(Vimentin)貨號為10017978,纖維粘連蛋白(FN)貨號為10016772,肌動蛋白(β-actin)貨號為10021787,辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)貨號為20000425且均購自武漢三鷹生物技術有限公司。 HF151型CO2培養箱購自武漢益普生物科技有限公司;DMI1型光學顯微鏡系統購自德國Leica公司;Multiskan Ascent型酶標儀購自美國Thermo公司;ZF-288型凝膠成像系統購自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1HL-60細胞培養 HL-60細胞株大鼠心肌細胞(H9C2)接種于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基中,并置于濕度為70%～80%,溫度為37 ℃,含5% CO2的環境下進行培養,更換培養液間隔時間為2 d,選取對數期生長細胞用于實驗。

1.2.2分組及細胞轉染 選取對數期生長的HL-60細胞,按照不同干預內容分為5組(對照組,mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組)。對照組不做處理;mimic NC組采用脂質體轉染法將mimic NC轉染于HL-60細胞(轉染后培養24 h);miR-186組將miR-186 轉染于HL-60細胞(轉染后培養24 h);miR-186+抑制劑組和miR-186+激活劑組細胞處理方法為轉染miR-186于HL-60細胞(轉染后培養24 h)后,分別加入LY294002和SC79,使其最終水平均達到10 μmol/L,干預24 h,每組設置3個復孔。

1.2.3檢測miR-186及EMT相關因子相對表達水平 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測HL-60細胞中miR-186相對表達水平及EMT相關因子(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、FN)信使核糖核酸(mRNA)相對表達水平,參照試劑盒的說明書,提取總RNA,并進行反轉錄,隨后進行RT-qPCR檢測。測定miR-186相對表達水平時以U6作為管家基因,測定EMT相關因子mRNA相對表達水平時以GAPDH作為管家基因。采用2-ΔΔCt法對目的基因相對表達水平進行計算。引物序列見表1。

表1 miR-186及EMT相關因子的引物序列

1.2.4EdU法測定HL-60細胞的增殖率 將轉染24 h后的HL-60細胞進行EdU孵育2 h,固定30 min,加入0.3% TritonX-100表面活性劑透化10 min;在每孔中加入100 μL Click反應液避光孵育30 min,再進行常規的Hoechst復染;裝片后,觀察并采集在熒光顯微鏡下的EdU紅色熒光信號和Hoechst 33342藍色熒光信號,采用ImageJ V1.8.0軟件確定細胞數目。細胞增殖率為EdU陽性染色細胞(紅色)占總細胞(藍色)的百分比。

1.2.5Transwell小室法測定HL-60細胞的遷移能力 將轉染后的HL-60細胞接種到24孔板Transwell小室中,加入無血清的細胞懸液,并在下室中加入含10% FBS的RPMI-l640培養基。培養24 h后,收集下室懸液,細胞濃縮計數,然后置于顯微鏡下隨機選取3個視野,用細胞計數板計算細胞數,遷移率=(遷移終點細胞數-遷移起點細胞數)/遷移起點細胞數×100%。

1.2.6蛋白免疫印跡法檢測HL-60細胞中PI3K/AKT信號通路及EMT相關因子及表達水平 轉染HL-60細胞24 h后,采用RIPA裂解液重懸并裂解;在4 ℃條件下,以12 000 r/min離心10 min,然后收集上清液,即總蛋白樣品。將蛋白樣品進行凝膠電泳(80～120 V恒壓法),再采用電泳法(300 mA恒流法)進行蛋白轉膜,利用脫脂牛奶法進行膜封閉,在4 ℃條件下進行一抗孵育過夜;室溫二抗孵育2 h。封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影之間分別用Tris洗膜緩沖液進行3～5次膜洗滌。在凝膠成像系統中進行圖片采集,并用ImageJ V1.8.0軟件進行蛋白灰度分析,內部參考為β-actin,并進行目的蛋白相對表達水平的計算。

2 結 果

2.15組miR-186相對表達水平比較 對照組、mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組的miR-186相對表達水平分別為1.00±0.17、1.01±0.19、1.85±0.14、1.85±0.14、1.82±0.15。5組間miR-186相對表達水平比較,差異有統計學意義(F=24.783,P<0.05);與mimic NC組相比,miR-186組miR-186表達水平升高(t=6.463,P<0.05)。miR-186組與miR-186+抑制劑組和miR-186+激活劑組的miR-186相對表達水平比較,差異均無統計學意義(t=0.023、0.231,P>0.05)。見圖1。

圖1 5組miR-186相對表達水平

2.25組HL-60細胞的增殖率比較 對照組、mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組細胞增殖率分別為(58.63±3.36)%、(59.07±3.69)%、(34.6±2.23)%、(20.53±1.86)%、(57.5±2.91)%。5組HL-60細胞的增殖率比較,差異有統計學意義(F=111.339,P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組細胞增殖率降低(t=10.364,P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組細胞增殖率降低(t=5.959,P<0.05),而miR-186+激活劑組細胞增殖率升高(t=9.699,P<0.05)。見圖2、3。

圖2 5組HL-60細胞增殖情況

圖3 5組HL-60細胞增殖率

2.35組HL-60細胞的遷移率比較 對照組、mimic NC組、miR-186組、miR-186+抑制劑組、miR-186+激活劑組細胞遷移率分別為(21.00±2.09)%、(20.88±2.53)%、(9.73±0.44)%、(6.03±0.45)%、(20.88±2.43)%。5組HL-60細胞的遷移率比較,差異有統計學意義(F=46.332,P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組細胞遷移率降低(t=7.391,P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組細胞遷移率降低(t=2.453,P<0.05),而miR-186+激活劑組細胞遷移率升高(t=7.391,P<0.05)。見圖4。

圖4 5組HL-60細胞遷移率

2.45組HL-60細胞中EMT相關因子及其mRNA相對表達水平比較 5組HL-60細胞中EMT相關因子及其mRNA相對表達水平比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組E-cadherin及其 mRNA表達水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN及其mRNA表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組E-cadherin 及其mRNA表達水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與miR-186組相比,miR-186+激活劑組E-cadherin 及其mRNA表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表2、3。

圖5 HL-60細胞中EMT相關因子的表達

表2 5組HL-60細胞中EMT相關因子相對表達水平比較

表3 5組HL-60細胞中EMT相關因子mRNA相對表達水平比較

2.55組HL-60細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達水平比較 5組HL-60細胞中PI3K/AKT信號通路p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與mimic NC組相比,miR-186組p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與miR-186組相比,miR-186+抑制劑組p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平降低,差異均有統計學意義(P<0.05);miR-186+激活劑組p-PI3K和p-AKT蛋白表達升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖6。

圖6 HL-60細胞PI3K/AKT通路相關蛋白的表達

表4 5組HL-60細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達水平比較

3 討 論

急性髓系白血病屬于髓系增生性腫瘤,具有克隆性髓系祖細胞分化為成熟血細胞過程中受抑制及多系細胞減少的典型特征,特點是高異質性、高病死率。因而研究急性髓系白血病相關分子機制對該疾病治療意義重大[13-14]。miRNA參與多種腫瘤細胞生長、分化和轉移等生物學行為過程。在真核生物中由于miRNA表達水平穩定且易檢測,越來越多的miRNA逐漸成為判斷急性髓系白血病發生、發展和預后等方面的標志物。有研究表明,miRNA家族成員之一的miR-186,參與靶向調控多種基因,在胃癌、非小細胞肺癌和前列腺癌等不同腫瘤中miR-186表達水平均下降,miR-186參與抑制細胞增殖、遷移和侵襲等過程[15-17]。CUI等[18]研究表明,miR-186能夠在非小細胞肺癌的增殖和轉移過程中起到抑制作用。在慢性淋巴細胞白血病、急性髓系白血病患者中miR-186表達水平下降[19]。但具體關于miR-186與急性髓系白血病作用機制的報道較少見。本研究結果顯示,miR-186組HL-60細胞增殖率和遷移率低于mimic NC組,差異均有統計學意義(P<0.05),提示miR-186對HL-60細胞有抑制增殖和遷移的作用,說明miR-186可有效抑制急性髓系白血病的發生、發展,這一結果也與miR-186在前列腺癌中的表達結果相似[20]。

PI3K/AKT通路在腫瘤細胞發生進程中具有重要調控作用,激活PI3K/AKT通路,可以促進細胞的增殖與轉移。DONG等[15]在軟骨細胞中的研究顯示miR-186可以調控PI3K/AKT信號通路,付民等[11]在肺腺癌中的研究也同樣顯示腫瘤細胞的增殖與遷移受miR-186激活PI3K/AKT通路的影響。本研究結果發現,miR-186組p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平低于mimic NC組,差異均有統計學意義(P<0.05),提示miR-186過表達可以顯著降低HL-60細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平,這與高平章等[21]對PI3K/AKT通路與HL-60細胞的研究結果相似。本研究發現,miR-186+抑制劑組HL-60細胞增殖率、遷移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平低于miR-186組,miR-186+激活劑組HL-60細胞增殖率、遷移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平高于miR-186組,差異均有統計學意義(P<0.05),提示隨著PI3K/AKT通路抑制劑的加入,HL-60細胞增殖率、遷移率、p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平降低,而加入PI3K/AKT通路激活劑后,則與抑制劑組有相反的趨勢,表明HL-60細胞進程受抑制的作用機制與miR-186對PI3K/AKT通路的阻遏有關。

腫瘤細胞經過EMT獲得間質表型進而具備轉移能力等參與腫瘤進程[22],EMT的調控是一個復雜的網絡機制,多種信號通路涉及其中,如核轉錄因子-κB(NF-κB)、PI3K/AKT、Janus激酶2(JAK2)/信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)等。miRNA在腫瘤的發生及轉移中起重要作用。李京輝等[23]在對胰腺癌細胞的研究中發現miR-490-3p可以通過抑制EMT進程,進而影響腫瘤細胞的發生、發展。ZHOU等[24]研究表明,miR-148a-3p可以通過調控EMT進而抑制急性髓系白血病的進程。腫瘤細胞惡性增殖及遷移是腫瘤轉移的重要原因,而腫瘤細胞EMT則是腫瘤轉移的早期標志。本研究中,miR-186組E-cadherin及其 mRNA表達水平高于mimic NC組,差異均有統計學意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達水平低于mimic NC組,差異均有統計學意義(P<0.05);miR-186+抑制劑組E-cadherin 及其mRNA表達水平高于miR-186組,差異均有統計學意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達水平低于miR-186組,差異均有統計學意義(P<0.05);miR-186+激活劑組E-cadherin 及其mRNA表達水平低于miR-186組,差異均有統計學意義(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、FN 及其mRNA表達水平高于miR-186組,差異均有統計學意義(P<0.05)。以上結果提示miR-186抑制了HL-60細胞EMT進程,在加入PI3K/AKT信號通路抑制劑后,E-cadherin及其mRNA表達水平進一步升高,N-cadherin、Vimentin、FN及其mRNA表達水平降低,而激活劑組則與抑制劑組有相反的趨勢。這說明miR-186通過阻遏PI3K/AKT信號通路抑制HL-60細胞EMT進程,從而影響HL-60細胞的增殖與遷移,這與付民等[11]在肺腺癌中的研究結果相似,揭示miR-186能夠通過阻遏PI3K/AKT通路來抑制腫瘤細胞的EMT,進而抑制細胞增殖和遷移。

綜上所述,miR-186過表達可通過阻遏PI3K/AKT信號通路,抑制HL-60細胞EMT,進而抑制HL-60細胞增殖和遷移,本研究為以miR-186為靶點開發新藥治療急性髓系白血病提供理論基礎,但miR-186對HL-60細胞的增殖、遷移及EMT進程影響是否與其他機制有關需進一步深入研究。