長鏈非編碼RNA LINC02321在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義

姚寶林,張蓓蕾,岳 娟,徐妮妮,姚君誠,榮偉程,楊 瀟△

1.空軍軍醫大學第二附屬醫院婦產科,陜西西安710038;2.甘肅省通渭縣中醫醫院普通外科,甘肅定西 743399;3.空軍軍醫大學第二附屬醫院放射科,陜西西安710038

子宮內膜癌(UCEC)作為最嚴重的婦科惡性腫瘤之一,占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1]。UCEC起源于子宮內膜上皮,主要受雌激素的影響[2]。由于肥胖和老齡化人口的增加,UCEC的發病率和病死率逐年升高[3-4]。盡管近年來醫療技術不斷進步,但由于UCEC早期診斷困難和較高的復發率,晚期UCEC患者的總體預后并無明顯改善[5-6],因此,迫切需要闡明UCEC發生與發展的分子機制,進而開發用于UCEC早期診斷、預后判斷的生物標志物及治療靶點。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類缺乏蛋白編碼活性的RNA分子,轉錄本長度均在200個核苷酸以上,可在轉錄、轉錄后及表觀遺傳學層面調控基因表達[7-8]。有研究表明,lncRNA作為關鍵調控因子可廣泛參與包括UCEC在內的各類腫瘤的發生與發展[9-10]。近年來,大量lncRNAs被鑒定出在UCEC中異常表達且與患者的不良預后密切相關,其可通過影響細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成及耐藥等生物學過程進而參與UCEC發生與發展[11-15],有成為診斷和預后判斷生物標志物及治療靶點的潛力。

LINC02321是一條轉錄于編碼基因TTC7B和RPS6KA5之間的lncRNA,位于人類染色體14q32.11區域。最近一項有關膀胱癌的研究發現,LINC02321作為血管新生相關lncRNA,在膀胱癌中上調表達,是膀胱癌患者預后的影響因素,并可通過激活VEGFA通路促進膀胱癌細胞增殖、侵襲、遷移和順鉑耐藥[16],提示LINC02321在腫瘤進展中可能發揮促癌作用。而LINC02321在UCEC中的表達是否異常及有何臨床意義目前尚不清楚。因此,本研究基于生物信息學技術解析LINC02321在UCEC組織中的表達情況及其臨床意義,以期為LINC02321用于UCEC早期診斷、預后判斷等基礎及臨床轉化研究提供參考依據,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中552例UCEC組織和35例癌旁組織(其中23例樣本為配對組織)樣本的基因表達譜數據及對應的臨床資料作為研究對象(552例UCEC樣本中部分資料不全)。其中表達譜數據通過R語言軟件包“EdgeR”進行過濾和標準化處理進而獲得每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的轉錄本(TPM)數據,并經log2轉換后用于后續分析。552例UCEC患者中年齡≤60歲207例,>60歲344例;臨床分期:Ⅰ和Ⅱ期393例,Ⅲ和Ⅳ期159例;初始治療結局:疾病進展和疾病穩定26例,部分緩解和完全緩解456例;組織學類型:子宮內膜樣411例,混合性和漿液性141例;組織學分級:G1期99例,G2和G3期444例;殘瘤分級:R0級377例,R1和R2級38例;腫瘤浸潤程度:<50% 261例,≥50% 215例;絕經狀態:絕經前期35例,圍絕經期和絕經后期472例;激素治療:無299例,有47例。

1.2方法 (1)分析LINC02321在UCEC組織中的表達及比較其臨床病理特征。采用R語言軟件包“EdgeR”分析LINC02321在552例UCEC組織和35例癌旁組織及23例配對UCEC組織中的表達情況;基于表達水平中位值分為高表達組和低表達組,比較兩組年齡、臨床分期、初始治療結局、組織學類型、組織學分級、殘瘤分級、腫瘤浸潤程度、絕經狀態、激素治療等臨床參數的相關性。(2)分析LINC02321與UCEC患者預后相關性?；诒磉_水平中位值分為高表達組和低表達組,分析LINC02321表達水平與總生存期(OS)、疾病相關生存期(DSS)及無進展間隔期(PFI)的相關性并評估生存差異。(3)分析LINC02321與UCEC免疫細胞浸潤的相關性。分析LINC02321表達水平與腫瘤組織免疫細胞浸潤豐度的相關性。(4)分析LINC02321對UCEC的診斷價值。(5)LINC02321在UCEC組織中的表達驗證。收集20例2019年1月至2022年10月在空軍軍醫大學第二附屬醫院(以下簡稱本院)進行手術切除的UCEC患者的腫瘤組織和癌旁組織標本,所有標本均經組織RNA保護液(德國QIAGEN)處理后于—80 ℃保存。采用TRIzol試劑(美國Thermo)提取組織總RNA,并使用UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit(康為世紀生物科技股份有限公司)進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析LINC02321在UCEC組織中的表達水平。qRT-PCR采用β-Actin作為內參并通過2—ΔΔCt法計算相對表達量。引物由上海生工生物工程公司合成,序列如下:LINC02321(上游引物:5′-GGAGATGAGGACTGGGAGGT-3′和下游引物:5′-GGACAGCTGGGAAAGGAGTC-3′);β-Actin(上游引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′和下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′)。本研究所收集樣本均經患者或家屬同意,并簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會審核批準(批號:202108-01)。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件和R4.2.1進行數據處理與統計分析。使用R語言軟件包“rms”構建Nomogram預測模型和校準曲線用于預測UCEC患者1、3和5年的OS。使用R語言包“Survival”通過 Kaplan-Meier法分析LINC02321表達水平與OS、DSS及PFI的相關性并執行log-Rank檢驗以評估生存差異;構建Cox比例風險回歸模型分析影響OS的危險因素;通過“GSVA”R語言包利用ssGSEA算法解析LINC02321表達水平與腫瘤組織免疫細胞浸潤豐度的相關性,并采用Spearman相關對LINC02321表達水平與UCEC免疫細胞浸潤的相關性進行評估。采用R語言軟件包“pROC”繪制受試者工作特征(ROC)曲線,通過計算曲線下面積(AUC)評價LINC02321對UCEC的診斷效能。不符合正態分布的計量資料以M(P25,P75)表示,非參數兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LINC02321在UCEC組織和癌旁組織表達情況比較 對552例UCEC組織和35例癌旁組織的表達譜數據分析發現,UCEC組織LINC02321表達水平[0.491(0.276,0.812)]高于癌旁組織[0.059(0.000,0.134)],差異有統計學意義(P<0.001)。進一步對23例配對UCEC組織的表達譜數據進行分析發現,與癌旁組織[0.053(0.000,0.148)]比較,LINC02321在腫瘤組織[0.667(0.456,0.831)]中的表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.001)。

2.2不同臨床病理特征UCEC患者LINC02321低表達與高表達情況比較 UCEC患者不同年齡、臨床分期、組織學類型、組織學分級、腫瘤浸潤程度及激素治療的LINC02321低表達及高表達情況比較,差異均有統計學意義(P<0.05),而初始治療結局、殘瘤分級及絕經狀態比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征UCEC患者LINC02321低表達與高表達情況比較[n(%)]

2.3LINC02321表達與UCEC患者生存期的相關性及OS影響因素的Cox回歸分析 單因素Cox回歸分析顯示,UCEC患者不同年齡、臨床分期、初始治療結局、組織學類型、組織學分級、殘瘤分級、腫瘤浸潤程度及LINC02321表達水平是影響UCEC患者OS的因素(P<0.05)。見表2。LINC02321高表達患者的OS、DSS和PFI均明顯短于低表達患者,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。以生存狀態為因變量(死亡=0,存活=1),將表2中差異有統計學意義且與OS相關的臨床參數作為自變量,納入多因素Cox回歸分析(賦值見表3),結果顯示,LINC02321高表達水平(HR=1.848,P=0.036)、臨床分期Ⅲ和Ⅳ(HR=3.206,P<0.001)、疾病進展和疾病穩定(HR=0.260,P<0.001)是影響UCEC患者OS的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

圖1 UCEC患者的不同LINC02321表達的OS、DSS和PFI比較

表2 不同病理特征UCEC患者中位OS情況比較

表3 自變量賦值

表4 影響UCEC患者OS的多因素Cox分析

綜合LINC02321表達水平、年齡、臨床分期、初始治療結局、組織學分型、組織學分級及腫瘤浸潤程度等影響OS的危險因素構建Nomogram預測模型,對UCEC患者1、3和5年的OS進行預測,并利用校準曲線對模型的預測效能進行評估,結果顯示,LINC02321表達水平對預測UCEC患者生存的貢獻率達40%,校準曲線顯示該Nomogram模型具有良好的預測效能。見圖2。

注：A為構建的Nomogram預測模型;B為預測模型的校準曲線。

2.4LINC02321對UCEC的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示,LINC02321表達水平對于評估UCEC(AUC=0.877)、臨床分期Ⅰ(AUC=0.862)、組織學分級G1期(AUC=0.772)和腫瘤浸潤(AUC=0.915)均具有一定的診斷價值。此外,LINC02321表達水平對于評估1、3、5年OS(AUC分別為0.659、0.629和0.623)、DSS(AUC分別為0.690、0.645和0.608)和PFI(AUC分別為0.633、0.602和0.612)同樣具有診斷價值。

2.5LINC02321表達水平與UCEC免疫細胞浸潤的關系 LINC02321表達水平與4種免疫細胞在UCEC腫瘤微環境中的浸潤明顯相關,其中與輔助性T淋巴細胞2(Th2)的浸潤呈正相關(r=0.231,P<0.001),而與CD56bright NK細胞(r=—0.342,P<0.001)、未成熟樹突狀細胞(r=—0.239,P<0.001)、嗜酸粒細胞(r=—0.204,P<0.001)的浸潤均呈負相關。

2.6LINC02321在UCEC組織中的表達驗證 為進一步明確LINC02321在UCEC組織中的表達趨勢,通過qRT-PCR分析20例UCEC患者腫瘤組織及癌旁組織中LINC02321的表達情況發現,LINC02321在UCEC組織[3.230(1.910,5.492)]中的表達水平明顯高于癌旁組織[6.220(2.702,9.023)],差異有統計學意義(P<0.05),其結果與生物信息學分析結果一致。

3 討 論

LncRNA作為重要的調控分子類型之一,因其數量龐大且在不同生理和病理狀態下具有明顯的組織特異性與時空特異性,已成為腫瘤診斷和預后評估新型生物標志物研發的熱點分子類型[17-18]。最近有研究發現一個由6條與細胞焦亡相關的lncRNAs組成的分子標簽與UCEC患者預后、免疫細胞浸潤、T淋巴細胞耗竭及免疫治療和化療反應密切相關,對UCEC具有良好的預測能力且有望成為提高免疫治療效果的治療靶點[19]。

LINC02321作為一條促癌lncRNA被發現在膀胱癌中上調表達并參與腫瘤進展,且作為血管生成和基底膜相關lncRNA與其他若干lncRNA組成的分子標簽可有效預測膀胱癌患者的預后和腫瘤轉移[16,20],提示LINC02321在腫瘤進展中發揮著重要作用。目前,LINC02321在UCEC中的表達狀況及是否參與UCEC進展還不清楚。故本研究基于TCGA數據庫中UCEC的基因表達數據及臨床資料,通過生物信息學分析對LINC02321在UCEC中的表達情況及臨床意義進行了探討,發現LINC02321在配對和非配對UCEC組織中的表達水平均明顯高于正常組織,提示LINC02321具有作為UCEC診斷分子標志物的潛力。其次,本研究發現,LINC02321的高表達對預測UCEC患者生存期具有較大貢獻,且對評估UCEC、組織學G1期、臨床分期Ⅰ以及1、3、5年生存期(OS、DSS和PFI)均具有良好的預測效果,表明LINC02321的高表達與UCEC患者不良臨床病理特征和預后密切相關,進一步提示LINC02321在UCEC中可能發揮促癌作用,是潛在的UCEC早期診斷和預后判斷的新型分子標志物。在膀胱癌中,同樣發現,LINC02321在腫瘤組織中上調表達與膀胱癌患者不良預后密切相關,并可促進膀胱癌細胞的增殖和轉移[16]。本研究發現,LINC02321的高表達與多種具有抗腫瘤活性的免疫細胞(包括CD56bright NK細胞、未成熟樹突狀細胞和嗜酸粒細胞)在UCEC組織中的浸潤豐度呈負相關,而與具有腫瘤免疫抑制功能的Th2細胞呈正相關,提示LINC02321的高表達可能與UCEC免疫抑制性腫瘤微環境的形成密切相關。最近一項在膀胱癌中的研究發現,由高表達的LINC02321與AC004034.1、AL662797.1、NR2F1-AS1、SETBP1-DT、AC011503.2、AC093010.2、 LINC00649一并組成的lncRNA分子標簽,與B淋巴細胞、濾泡Th(TFH)、調節性T淋巴細胞及活化型樹突狀細胞(aDC)的浸潤均呈負相關,而與NK細胞的浸潤呈正相關[20],提示在不同腫瘤中LINC02321可能通過影響不同類型免疫細胞的浸潤進而參與特定免疫微環境的形成。最后,本研究通過qRT-PCR驗證了LINC02321在UCEC組織中的上調表達,后續可進一步對UCEC患者血清和血漿樣本中LINC02321的表達及其臨床相關性和臨床意義進行研究,為臨床應用轉化提供理論依據。

綜上所述,本研究基于公共數據通過生物信息學分析揭示了lncRNA LINC02321在UCEC中異常高表達且可作為潛在的UCEC診斷、預后判斷的生物標志物以及免疫治療靶點,同時為進一步開展LINC02321的基礎與臨床轉化研究奠定基礎。