ABO正反定型不符的白血病患者血型鑒定與臨床分析

李 茜,張智慧,高力立,彭沫溱,陳 璐,趙梓昕,寸 偉,羅 臻,蘇品璨

云南昆明血液中心輸血研究室,云南昆明 650106

輸血作為一種臨床救治患者的常用治療手段,既可提高患者攜氧功能,又能改善其凝血功能障礙,因此,輸血前的ABO血型鑒定對保障臨床輸血安全尤為重要。ABO血型是由ABO基因編碼決定的,一般情況下人體ABO血型不會發生改變。白血病是起源于造血干細胞或祖細胞的惡性克隆性疾病[1-2],白血病患者處于疾病狀態可能引起自身體內血細胞或血漿成分發生改變,導致ABO抗原減弱或ABO抗體效價降低,出現ABO血型鑒定正反定型不相符的情況,極易引起血型誤判,直接關系臨床輸血安全[3-4]。多種因素均可導致患者ABO抗原減弱,近年來,有研究發現,ABO基因啟動子區甲基化程度與ABO抗原表達異常有關[5-8],但相關文獻報道較少見。本研究通過血清學、聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)檢測和ABO基因啟動子區甲基化狀態檢測等檢測手段對1例白血病患者的ABO血型鑒定檢測異常結果、原因及處理方法進行了分析,初步探討了白血病中ABO基因甲基化狀態異常導致ABO抗原表達減弱在輸血相容性檢測中的臨床意義,以期為臨床診療提供參考依據,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 血液標本來源于云南省腫瘤醫院,患者,女,24歲,患惡性血液病,有2次輸血史,患者知情同意本研究并簽署知情同意書?；颊哂?022年2月3日初次診斷為白血病,目前患者白細胞計數(WBC)為206×109/L,血紅蛋白(Hb)為51 g/L,血小板計數(PLT)為38×109/L,同時伴有脾臟腫大?；颊邍乐刎氀?急需輸血,因其ABO血型鑒定正/反定型不一致(正定型結果為O型,反定型結果為A 型),醫院將患者血液標本送檢至血液中心進行ABO血型鑒定和疑難交叉配血實驗。

1.2儀器 ABO血型定型檢測卡配套孵育器和離心機(長春博迅生物技術有限責任公司),KA2200 型血型血清學專用離心機(日本久保田公司),電熱恒溫水浴箱(上海博迅實業有限公司),冰箱(海爾集團海爾電冰箱有限公司),MagCore HF16 自動核酸提取儀(中國臺灣RBC Bioscience公司),T100 PCR反應擴增儀(美國Bio-Rad Laboratories公司),PowerPac TM 基礎電泳儀(美國Bio-Rad Laboratories公司),ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(美國Bio-Rad Laboratories公司),3730測序列分析儀( 美國ABI公司),SW-CJ-1D潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設備廠),DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司),DYY-8型穩壓穩流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司),YXJ-2離心機(湘儀離心機儀器有限公司),H6-1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠),U-3010紫外-可見分光光度計(Hitachi公司),移液器(范圍100～1 000 μL,20～200 μL,0.5～10 μL,德國艾本德EPPENDORF公司)。

1.3試劑 抗-A、抗-B血型定型試劑-單克隆抗體(上海血液生物醫藥有限責任公司,批號20220101),ABO血型卡正/反定型和RhD血型檢測卡-微柱凝膠法(DiaMed GmbH/Bio-Rad低離子抗人球蛋白卡,批號50093.11.28),抗-A1凝集素(上海血液生物醫藥有限責任公司,批號20221019),抗-H單克隆抗體(上海血液生物醫藥有限責任公司,批號20221110),抗-AB抗體(DIAGAST,批號464000),抗人球蛋白[抗免疫球蛋白G(抗-IgG),抗-C3d]檢測試劑盒(上海血液生物醫藥有限責任公司,批號20225001),抗-IgG檢測試劑盒(上海血液生物醫藥有限責任公司,批號20215102),抗C3d檢測試劑盒(上海血液生物醫藥有限責任公司,批號20225201),人ABO血型反定型用紅細胞試劑盒(上海血液生物醫藥有限責任公司,批號20235313),低離子抗人球蛋白卡-微柱凝膠法(DiaMed GmbH/Bio-Rad,批號50531.76.10),不規則抗體檢測試劑(人血紅細胞,長春博迅生物技術有限責任公司,批號20221208),紅細胞血型抗體篩選細胞(微柱凝膠法)Serascan Diana 3(Diagnostic Grifols,S.A.西班牙基立福公司,批號23007.01);核酸提取試劑盒(中國臺灣RBC Bioscience 公司,批號 P4101- 17230);人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒PCR-SSP法 (天津秀鵬生物技術開發有限公司,批號202004001),MethylEdgeTMBisulfite Conversion System(Promega,批號0000470334),焦碳酸二乙酯處理水(碧云天 Beyotime,批號111122230306),TaKaRa EpiTaqTMHS (TaKaRa,批號AM20984A),加樣緩沖液(Takara,批號ALG988A),BigDye測序反應試劑盒(ABI 公司,批號91235489),POP 7測序膠(ABI 公司,批號2211711),10×電泳緩沖液(ABI 公司,批號2208378)。

1.4檢測方法

1.4.1血型血清學檢測 采集患者肘部靜脈血進行檢測,ABO血型正/反定型鑒定、間接抗人球蛋白試驗、不規則抗體篩查采用微柱凝膠卡法和試管法;直接抗人球蛋白試驗(DAT)采用試管法;將抗-A、抗-B分別與經鹽水洗滌3次的受檢者濃縮紅細胞等量混合進行吸收放散試驗。所有試驗操作均按照標準操作規范[9-10]和試劑盒說明書進行。

1.4.2PCR-SSP檢測 取患者乙二胺四乙酸外周抗凝全血400 μL,使用自動核酸提取儀提取基因組DNA,采用微量紫外分光光度計檢測 DNA 濃度和純度。按照人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒說明書進行PCR-SSP 法基因分型PCR擴增試驗。配制2.0%的瓊脂糖凝膠,將5 μL擴增PCR產物進行電泳檢測,于120 V恒定電壓條件下電泳40 min后使用凝膠成像系統成像,記錄試驗結果并根據試劑盒說明書結果分型表判定基因型。

1.4.3ABO基因啟動子區甲基化檢測 采用亞硫酸氫鹽測序法(BSP)檢測標本ABO基因啟動子區CpG島甲基化狀態。根據MethylEdgeTMBisulfite Conversion System試劑盒說明書,對患者基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾,使檢測標本基因組DNA中未發生甲基化的胞嘧啶通過亞硫酸氫鹽處理后轉化為尿嘧啶,甲基化的CpG胞嘧啶則不變。在NCBI數據庫下載ABO基因序列,應用Methyl primer express software v1.0和MethPrimer軟件選取ABO基因啟動子區富含CpG位點的區域,并設計擴增引物,檢測片段分別為175、160 bp,共包含13個CpG位點,分別編號為1～13,擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,上游引物序列1:ATGTTGTTTAGGTTGGAGTGTAGTG,下游引物序列1:ACCAACATAATAAATCCTCCATCTC;上游引物序列2:TTTTAAGTAGTTGGGGTTATAGAT,下游引物序列2:ACCTACAATCCTAACACTTTC AA。以亞硫酸氫鹽修飾后的患者基因組DNA為模板,根據TaKaRa EpiTaqTMHS說明書要求擴增目標序列。PCR反應體系為50 μL,包括亞硫酸氫鹽修飾后DNA模板2 μL,TAKARA EpiTaqTMHS(5 U/μL) 0.25 μL,10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5 μL,25 mM MgCl25 μL,2.5 mM dNTP Mixture 6 μL,上下游引物各2 μL,其余用無菌水補足。PCR條件為94 ℃,1 min;98 ℃,10 s;57 ℃,30 s;72 ℃,30 s;40個循環;72 ℃ 終延伸10 min;終止在4 ℃。將PCR產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳后對目的條帶進行切膠,使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行純化回收;使用HieffCloneTMZero TOPO-TA Cloning Kit試劑盒對目的片段進行目的片段TA克隆;使用生工質粒提取試劑盒SK8191 UNIQ-10 柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒DNA;將質粒使用PstⅠ單酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小,確定是否含有目的片段,鑒定陽性克隆子;將陽性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列分析。

1.5統計學處理 采用Chromas(Version 2.3)軟件分析測序峰圖,使用甲基化分析軟件BIQ Analyzer分析目標序列CpG位點甲基化情況,并將BSP測序結果以圓圈圖輸出。目標序列中有13個CpG島位點,計算CpG島甲基化位點數占總CpG島位點的百分比,計算甲基化率。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1ABO血型鑒定 患者ABO 血型正定型結果為O型,反定型結果為A型,正反定型結果不一致,4 ℃時試管法可見A1c凝集。見表1。不規則抗體篩查試驗結果顯示,患者血漿與3種抗體篩查細胞均無凝集。見表2。DAT結果顯示,抗-IgG+C3d、抗-IgG、抗-C3d均為陰性。吸收放散試驗結果顯示,患者紅細胞表面存在A抗原。見表3。

表1 ABO血型鑒定正反定型結果

表2 不規則抗體篩查試驗結果

表3 受檢者吸收放散試驗結果

2.2PCR-SSP法檢測 ABO基因分型檢測出患者PCR-SSP基因分型格局1、2、4、6、8、9、11孔為陽性,3、5、7、10孔為陰性。對照人類紅細胞 ABO 血型基因分型試劑盒(天津秀鵬生物技術開發有限公司)結果分型表判定患者基因型為AO1,表型為A型。見圖1。

注：片段大小從下至上依次為100、250、500、750、1 000 bp和2 000 bp;檢測目的條帶均同時檢測內參質控帶,內參為人類生長激素基因的保守片段,大小約為1 000 bp。

2.3ABO基因啟動子區甲基化檢測 經BSP檢測ABO基因啟動子區部分序列的甲基化水平,待檢測標本DNA經亞硫酸氫鹽試劑盒轉化處理后甲基化的胞嘧啶不發生改變,經PCR擴增和TA克隆測序檢測到該CG位點仍為CG;而未甲基化修飾的胞嘧啶則轉化為尿嘧啶,經PCR擴增和TA克隆測序檢測到該CG位點轉化為TG。檢測標本的甲基化率指檢測區域中甲基化的CpG數量與該區域CpG總數量的比值。將ABO基因啟動子富含CpG島區域檢測片段大小為175、160 bp序列進行TA克隆測序。見圖2～4。甲基化狀態分析結果顯示,患者標本ABO基因啟動子區甲基化率為66.7%,高于隨機選取的5例正常對照組標本平均甲基化率(<25%),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：箭頭表示該CG位點的C為甲基化的堿基。

注：箭頭表示CG位點的C未被甲基化,CG轉化為TG。

注：DZ1、DZ2、DZ3、DZ4、DZ5為對照組標本,SC為受檢白血病患者標本;○為非甲基化位點,●為甲基化位點;圖中分別為患者標本和正常對照組標本ABO基因啟動子175 bp和160 bp區域甲基化狀態分析情況。

注：與正常對照組比較,aP<0.001。

3 討 論

白血病是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病,由于發生病變的白細胞失去分化成熟的能力,停滯于其發育的不同階段,進而引起患者骨髓和其他造血組織中病變細胞大量增殖積聚并浸潤其他器官和組織,導致患者造血功能異常,出現病態造血而無法產生足量的正常血細胞,臨床表現為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀,輸血是白血病非常重要的輔助治療手段之一[1-2]。在臨床輸血治療過程中ABO血型的正確鑒定尤為重要。人類ABO血型抗原由ABO基因編碼,ABO基因位于人類第 9號染色體的長臂,屬于常染色體顯性遺傳,一般情況下不會發生變化[11]。有研究表明,急性髓系白血病患者處于其病情發作期可能出現紅細胞血型抗原減弱、消失或變異,其原本的ABO血型抗原無法正常檢出,導致ABO正/反定型不一致,極易引起血型誤判,影響輸血安全[12]。近年來,分子生物學基因分型技術、血型基因甲基化檢測技術在ABO疑難血型鑒定中的廣泛應用,其將新技術與傳統血型血清學鑒定技術相結合,可快速、準確地鑒定疑難ABO血型,并且進一步合理解釋疾病狀態下抗原減弱的原因,為更加安全、合理地解決臨床疑難血型鑒定問題提供了新思路。

本例患者使用微柱凝膠法進行ABO血型鑒定試驗結果顯示,正定型結果為O型,反定型結果為A型,正反定型結果不一致。排除微柱凝膠卡、反定型試劑、離心設備運行及其他人為因素的干擾后采用試管法分別于室溫、4 ℃和37 ℃條件下重復ABO正反定型試驗,結果顯示,3個溫度下正定型均為O型,而反定型在4 ℃時試管法可見A1c凝集,推測患者產生不規則抗-A1抗體。微柱凝膠法進行不規則抗體篩查和試管法進行直接抗人球蛋白試驗結果均為陰性,排除是自身抗體造成的ABO正反定型不符[13]。結合患者處于白血病發作期,其ABO血型鑒定正反定型不符可能是紅細胞本身所致,經吸收放散試驗后檢出患者紅細胞表面存在弱 A 抗原?；谘好庖邔W檢測試驗,由白血病疾病狀態下導致受試者A抗原減弱與ABO亞型引起的紅細胞抗原數量減少的試驗檢測結果較為相似,難以鑒別,需進一步結合其他檢測技術加以鑒別。本研究使用分子生物學血型基因分型PCR-SSP法進行檢測,本例患者ABO基因分型結果為AO1,表型為A型,即可排除ABO亞型的可能,而其正定型結果為弱A表型,有研究在髓系惡性腫瘤[4]、骨髓增生異常綜合征[14-15]、急性髓系白血病[15-16]、慢性粒細胞白血病[17]、膀胱癌[18]和口腔癌[8,19]等患者中均檢測到ABO抗原減弱的現象,與本研究結果一致。

目前,對于血型抗原減弱的確切原因尚未明確,且患者出現ABO抗原減弱的現象不是持續的,在疾病緩解后還有可能恢復血型抗原表達[20]。推測為機體在白血病狀態下的ABO基因表達調控機制發生了改變,而這種調控機制目前尚未明確。近年來,甲基化已成為腫瘤研究的熱點,甲基化是一種表觀遺傳修飾方式,參與機體疾病狀態下的基因表達調控。有研究發現,白血病患者ABO抗原減弱與DNA甲基化導致ABO基因沉默的關系更為密切[18]?；诖?推測患者ABO基因啟動子區CpG島甲基化狀態的異?？赡芘c其A抗原表達減弱有關。本研究對患者標本ABO基因啟動子區175、160 bp 2個區域甲基化狀態進行檢測,結果顯示,檢測區域患者標本ABO基因啟動子區甲基化率為66.7%,明顯高于隨機選取的5例正常對照組標本平均甲基化率(<25%),差異有統計學意義(P<0.05)。有研究表明,ABO基因啟動子CpG島甲基化程度與ABO抗原表達呈負相關,甲基化程度越高ABO基因表達越不活躍,從而導致A、B抗原表達均減少[5,8,18];且白血病患者存在不同程度A、B抗原減弱[21],與本研究結果一致。提示患者白血病狀態下ABO基因啟動子區甲基化程度增高可能與ABO抗原減弱之間存在較為密切的相關性,因機體抗原減弱的調控機制是多因素共同作用的結果,而ABO啟動子甲基化導致的基因表達下調僅可能只是ABO抗原減弱的其中一個因素,其機制還需進一步探索。

本研究結果提示,本例白血病患者在疾病發作期,其ABO基因啟動子區甲基化狀態異?？勺鳛閷е翧BO抗原減弱的重要因素之一,從而干擾ABO正反定型鑒定。在臨床輸血實踐中開展血清學疑難血型鑒定的同時進行分子生物學基因分型和血型基因甲基化檢測可作為血清學方法的有效輔助手段,有效縮短了輸血相容性試驗檢測時間,保障臨床用血安全、合理、有效,為實現患者個體化血液管理、做到精準輸血提供了新思路。