基于網絡藥理學探討柴胡-黃芩藥對治療病毒性肺炎的作用機制

蔣總 唐芳 馬武開 姚血明 劉正奇 蘭維婭 周靜

(貴州中醫藥大學第二附屬醫院,貴州 貴陽 550002)

病毒性肺炎是一種可由多種病毒侵襲導致肺實質炎癥的呼吸系統疾患[1]。因此,臨床缺乏治療病毒性肺炎安全有效藥物。中醫藥作為我國傳統文化的瑰寶,傳承千年而不衰,在防治疾病中起著舉足輕重的地位。著名醫家錢乙所創六味地黃丸、《傷寒論》所著小柴胡湯因其療效顯著,目前臨床應用廣泛。柴胡-黃芩來源于小柴胡湯,研究[2-3]表明,小柴胡湯可降低大鼠炎癥因子表達,還可下調病毒性肺炎患者體溫,在呼吸系統疾病中有良好治療作用。柴胡-黃芩是小柴胡湯主要君藥,早有研究報道柴胡-黃芩配伍有較好清熱與抗病毒之功效[4],但是其作用機制仍不清楚。網絡藥理學通過構建“藥物成分-靶點與疾病靶點”相互作用關系,本研究應用網絡藥理學研究方法探討柴胡-黃芩藥治療病毒性肺炎潛在的作用機制,為臨床應用中醫藥治療病毒性肺炎提供依據。

1 資料與方法

(1)數據準備:從TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)查找柴胡-黃芩的主要化學成分,查詢條件設置OB≥30%且DL≥0.18進行篩選,獲得有效成分和靶點蛋白。(2)藥物靶點轉換和疾病靶點的篩選:通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)將所得藥物靶點進行標準化注釋。以“viral pneumonia”作為關鍵詞,在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、Pharm Gkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)收集病毒性肺炎相關基因。將柴胡-黃芩藥對靶點基因與病毒性肺炎靶點基因互相映射篩選出共同靶點,獲得柴胡-黃芩治療病毒性肺炎的作用靶點。(3)活性成分-癌癥靶點網絡構建:將柴胡-黃芩藥對學成分與病毒性肺炎靶點通過Cytoscape3.8.0建立藥物主要成分成分靶點-疾病靶點群網絡,化合物節點度(Degree)表示藥對對應的治療病毒性肺炎靶點個數,并對Degree較大值進行分析。(4)靶蛋白相互作用(PPI)網絡構建:將藥對-疾病相關靶點基因上傳至在線String10.0軟件(https://string-db.org/),通過設置分值高于0.9置信度進行分析數據,生成靶點PPI網絡,并且利用RStudio Version 1.2.1335對PPI網絡中的蛋白繪制條形圖,進一步說明靶蛋白的核心作用。(5)GO功能富集與KEGG通路富集分析:為了說明柴胡-黃芩藥對病毒性肺炎靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用,本研究通過RStudio Version 1.2.1335軟件對PPI網絡靶點蛋白進行GO、KEGG通路富集分析。

2 結 果

2.1 活性化合物的篩選通過TCMSP數據庫根據篩選條件共篩選出53個活性化合物。見表1。

2.2 疾病基因篩選通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數據庫搜索病毒性肺炎相關的疾病基因,最后得出GeneCards數據庫4212個基因,OMIM數據庫共91個基因,PharmGkb數據庫共6個基因,DrugBank、TTD沒有病毒性肺炎相關基因,去除重復基因后共篩選出4238個基因。見圖1。

2.3 柴胡-黃芩藥對靶點與病毒性肺炎靶點相互作用韋恩圖依據GeneCards數據庫按Relevance score≥1.0標準篩選目標靶蛋白,通過UniProt數據庫轉換為基因名稱,把GeneCards、OMIM、PharmGkb數據庫將疾病靶基因整合,最后將柴胡-黃芩藥對與疾病靶點相關基因映射,共發現143個共同基因,確定為柴胡-黃芩藥對治療病毒性肺炎的靶基因。見圖2。

2.4 柴胡-黃芩藥對靶點病毒性肺炎相互作用網絡將藥物主要化學成分與病毒性肺炎靶點通過Cytoscape3.8.0建立藥物成分靶點-疾病靶點群網絡,其中紅色表示柴胡,紫色表示黃芩,淺藍色表示病毒性肺炎靶點,每條邊則表示藥物活性成分與疾病靶點之間的相互作用關系(圖3)。在藥物靶點-疾病靶點網絡中充分體現了其多成分、多靶點的作用特點。

圖3 柴胡-黃芩活性成分-病毒性肺炎靶點網絡圖

2.5 靶點PPI網絡、關鍵基因分析隱藏游離點后PPI網絡包含115個靶蛋白節點,各靶點蛋白具體連線見圖4,其中連線越多代表靶點關聯越大,再利用RStudio Version 1.2.1335根據所有所得基因進行過濾篩選得到核心基因(過濾條件基因degree≥中位值),再通過Cytoscape3.8.0進行核心基因作圖分析,重復兩次,最終得到核心基因JUN(degree=20),MAPK14(degree=16),FOS、TP53、FOS、TNF、RELA(degree=14),AKT1、MYC(degree=12),CCND1(degree=9),IL6(degree=8)。見圖5。

圖4 柴胡-黃芩治療病毒性肺炎靶蛋白PPI網絡

圖5 柴胡-黃芩治療病毒性肺炎關鍵基因

圖6 柴胡-黃芩GO生物過程富集柱狀圖

2.6 GO生物過程分析通過RStudio Version 1.2.1335把藥對與疾病共同靶基因symbol轉換基因ID得到136個靶基因,通過在DAVID數據庫進行GO生物過程富集,根據錯誤發現率(FDR)<0.05篩選出2481個GO生物過程。其中response to oxidative stress、reactive oxygen species metabolic process、response to toxic substance、response to reactive oxygen species、response to metal ion、response to molecule of bacterial origin、response to lipopolysaccharide等位于GO生物過程富集的前面。具體見6及圖7?？梢?病毒性肺炎的發生發展涉及對氧化應激的反應、活性氧代謝過程、對有毒物質的反應、對活性氧的反應、對金屬離子的反應、對細菌來源的分子的反應、對脂多糖的反應等生物過程,而柴胡-黃芩藥對可通過調節以上生物過程來治療病毒性肺炎。

圖7 柴胡-黃芩GO生物過程富集氣泡圖

2.7 KEGG信號通路分析通過DAVID數據庫將柴胡-黃芩的136個靶基因在KEGG信號通路中富集,根據FDR<0.05篩選出與病毒性肺炎密切相關的信號通路。結果共有123個靶點基因參與KEGG富集通路,包括AGE-RAGE、IL-17、TNF signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、C-type lectin receptor signaling pathway等信號通路,主要與氧化應激、炎癥、病毒感染等158條信號通路相關,其中每一條通路都有相對應的通路圖,部分通路見圖8。

圖8 柴胡-黃芩藥對KEGG信號通路圖

3 討 論

病毒感染性肺炎一直是肺部感染高發病率和高死亡率的主要原因,通常在幾十年內呈季節性變化[5-6]。在近二十年內,全世界范圍內前后總共經歷了6次重大病毒性感染,其中呼吸道病毒感染有4次,最近一次是自2019年至今的新型冠狀病毒肺炎,具有發病率更高、傳染性更強、受累人群更多、經濟損失最大、侵犯地域更廣的特點,嚴重危害人類身心健康[7]。然而,病毒性肺炎的發病機制尚不清楚,導致臨床治療的盲目性,目前對病毒性肺炎的治療主要是對癥支持治療,由于呼吸道病毒的高度變異性、耐藥菌株的出現、抗病毒藥物的不良反應導致許多抗病毒藥物的療效顯著降低甚至無效,給治療病毒性肺炎帶來巨大的難題。

中醫藥具有多環節、多靶點、副作用小的特點治療呼吸道疾病已有數千年,具有有獨特的優勢。柴胡-黃芩經典配伍見于小柴胡湯,除此之外,尚有許多柴胡黃芩配伍,如清熱解毒的普濟消毒飲,辛涼解表、解肌清熱的柴葛解肌湯等。早有研究表明[8],柴胡與黃芩配伍不僅能抑制抑制雞胚內流感病毒,還可降低小鼠病毒性肺炎肺指數和死亡率,具有較好的抗病毒作用。此外,黃錦標[9]在一臨床觀察中發現,在病毒唑進行抗病毒的基礎上聯用柴胡和黃芩可有效增強抗病毒的效果。

本研究通過網絡藥理學分析得出柴胡-黃芩藥對可多靶點治療病毒性肺炎的機制研究。柴胡-黃芩藥對治療主要有53種活性成分、143個靶點和158條生物學信號通路。通過PPI網絡分析得出藥物靶點與疾病靶點的核心基因包括JUN、MAPK14、FOS、TP53、FOS、TNF、RELA、AKT1、MYC、以及IL-6等關鍵靶點,柴胡-黃芩通過這些關鍵靶基因抑制細胞增殖、應激、炎癥、功能同步化、凋亡等途徑從而發揮病毒性肺炎的作用。通過對GO的分析發現柴胡-黃芩藥對主要通過參與病毒性肺炎的氧化應激的反應、活性氧代謝過程、金屬離子的反應等治療病毒性肺炎的分子機制。最后通過KEGG富集分析得出,柴胡-黃芩藥對可通過調控AGE-RAGE、IL-17、TNF signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、C-type lectin receptor signaling pathway等信號通路介導的氧化應激、炎癥、病毒感染等機制治療病毒性肺炎。

本研究通過網絡藥理學初步揭示柴胡-黃芩治療病毒性肺炎的主要作用靶點以及生物學效應,但由于病毒性肺炎的發病機制尚未明確,柴胡-黃芩藥對配伍治療病毒性肺炎的用藥劑量、生物學效應未明確,本研究僅作為理論的探討性,還需進一步的實驗進行驗證。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本文不涉及倫理批準及均知情同意。