基于網絡藥理學分析中藥治療高脂血癥作用機制 *

徐慧文 徐 玥 姚寒俊 葉曉穎 李詩涵 蔡 羽

（湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065）

血脂是血清膽固醇、三酰甘油和類脂等物質的總稱，與臨床密切相關的血脂主要是膽固醇和三酰甘油。近30年來，我國高脂血癥患病率明顯增加［1］。據統計［2］，我國18歲及以上居民高脂血癥總體患病率高達35.6%，已造成嚴重的疾病負擔。本課題組前期基于數據挖掘研究中醫藥治療高脂血癥的用藥規律，找出5個中藥組合，其中最有效的組合是山楂、何首烏、丹參、決明子、澤瀉。中醫藥治療高脂血癥有獨特的優勢，如藥源豐富，毒副作用小，有多種保肝降脂作用途徑，能夠靈活組方、因人制宜等，具有廣闊的應用前景［3］。網絡藥理學可以分析組方潛在作用機制［4］?；诖?，本研究使用網絡藥理學和分子對接的方法，討論中醫藥治療高脂血癥的作用機制。

1 研究方法

1.1 收集高脂血癥疾病相關靶點使用GeneCards 數據庫和在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫，以“Hyperlipidemia”為關鍵詞進行檢索，獲取與高脂血癥相關的蛋白靶點；合并數據，刪除重復或無效的基因。

1.2 篩選方劑的活性成分及成分靶點使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫，篩選條件為口服生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18，分別以“山楂”“何首烏”“丹參”“決明子”“澤瀉”為關鍵詞進行檢索，獲取所有活性成分，同時收集相應靶點；使用UniProt 數據庫進行靶點、基因名稱的標準化，刪除無注釋及重復靶點。

1.3 篩選藥物成分和疾病共有靶點使用R 軟件將收集到的藥物成分靶點與疾病靶點映射篩選，得出共同靶點并繪制韋恩圖。

1.4 構建蛋白互作（PPI）網絡把共同靶點導入String數據庫，設置研究物種為人類，結果可信度選擇高（High confidence），刪除網絡中未與其他基因靶點有互作關系的基因靶點，構建PPI網絡。

1.5 基因本體論（GO）功能富集運用R 腳本、id2symbol.pl腳本、id.txt 文件，在GO 數據庫里通過每個id 找各基因的功能，并統計每個功能上有多少個基因，行Fisher 檢驗，從而得出各基因是否在某個功能上富集。統計值越小，說明富集程度越高。

1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集向KEGG 網站上傳目標基因的氨基酸序列FASTA 文件，選擇動物物種類別，并用R軟件將結果可視化。

1.7 分子結構對接驗證從中醫藥百科全書數據庫（ETCM）中下載高頻中藥成分的3D 結構式，并從Swissmodel 數據庫中下載關鍵靶點的結構片段。將每一個成分的結構式和靶點的結構片段錄入SwissDock 網站，進行分子對接。

2 結果

2.1 藥物成分與疾病共有靶點的篩選通過TCMSP數據庫，得到中藥組合（山楂、何首烏、丹參、決明子、澤瀉）136個成分、396個靶點；通過GeneCards及OMIM數據庫，得到501個疾病靶點。使用R軟件將具有潛在作用的藥物成分靶點基因同疾病靶點基因進行匹配映射，得到共有靶點基因37個，為該藥物組合治療高脂血癥的潛在作用靶點。

2.2 PPI網絡的構建及核心靶點的篩選藥物-疾病共有靶點PPI 網絡共有37 個節點，核心靶點有腫瘤壞死因子（TNF）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARG）、表皮生長因子受體（EGFR）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）。見圖1。

圖1 藥物-疾病共有靶點PPI

2.3 GO富集分析GO 功能富集主要分為生物學過程、細胞組成以及分子功能3個部分，根據矯正后P-value 值進行從小到大排序，分別選取前10個富集條目。生物學過程主要包括生物質量的調節、脂質代謝過程、對外刺激的反應等；細胞組成主要包括膜約束的細胞器；分子功能主要包括類固醇綁定、激素結合、脂質結合等。

2.4 KEGG富集通路分析對該藥物組合治療高脂血癥的37個關鍵靶點基因進行KEGG通路富集分析，共得到63條通路，其關鍵靶點主要富集于過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路和流體剪應力與動脈粥樣硬化。

2.5 分子對接驗證把選取的3 個關鍵靶點激素敏感脂酶（LIPE）、PPARG、EGFR 和已有的高頻中藥成分的3D 結構錄入SwissDock 網站，進行分子對接。靶點與高頻中藥成分配體結合的構象穩定時，能量越低發生的作用可能性越大，通常結合能＜-7.0 kcal/mol 表示具有較好的結合活性［5］。而在統計的高頻中藥與這3 個靶點的2889 種結合方式中，有1679 種分子對接結果的結合能＜-7.0 kcal/mol，這說明有一半及以上的分子對接有較好的結合活性。其中結合性最強的，是與PPARG靶點結合的橙皮素-7-氧-蘆丁苷。見表1。

表1 關鍵靶點與其結合最緊密成分的分子對接

3 討論

中醫將高脂血癥納入“血瘀”“痰濕”“脂膏”等范疇，認為其病因為飲食不節、嗜食油膩甘甜等，造成肝、脾、腎三臟功能失調，體內液體代謝失常，最終致?。?］。本研究采用網絡藥理學的方法分析藥物的活性成分、靶點，疾病的靶點，并通過疾病與藥物的交集靶點進行功能和通路的分析。結果顯示，治療高脂血癥的中藥組合（山楂、何首烏、丹參、決明子、澤瀉），其最核心的交集靶點是TNF，其次是PPARG、EGFR。TNF作用于血管內皮細胞，損傷內皮細胞或導致血管功能紊亂，使血管受損，形成血栓［6］。PPARG基因編碼的蛋白質PPAR-γ 是脂肪細胞分化的調節器［7］。EGFR 下降時，平均動脈壓力（MAP）也下降［8］。GO 富集分析發現，該組合最主要的生物學過程是生物質量的調節，最主要的細胞組成是膜約束的細胞器，最主要的分子功能是脂質結合。將交集靶點進行KEGG 通路分析，發現該藥物組合作用于高脂血癥最主要的通路是對脂肪細胞脂溶解的調節。其中三酰甘油被脂肪酶水解釋放出甘油和游離脂肪酸，甘油磷脂通過磷脂酶A1、A2、C、D生成甘油和脂肪酸；甘油經甘油激酶和3-磷酸甘油脫氫酶生成磷酸二羥丙酮，脂肪酸則主要通過β-氧化生成二氧化碳、水和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）［9］。其次是胰島素抵抗、流體剪應力與動脈粥樣硬化。流體剪應力為與血管壁平行的血液流動的單位表面積的摩擦力，流區低水平剪應力（＜4 dynes/cm2）可促進粥樣硬化的發生及斑塊形成，而某一范圍內的高水平剪應力（10～70 dynes/cm2）則會對抗動脈粥樣硬化的發生［10-12］。此外，分子對接結果顯示，關鍵靶點LIPE為激素敏感脂酶，能水解多種酯，并在?；视偷闹舅岽x中起關鍵作用，極大地促進脂類物質的代謝［13］。而PPARG 基因編碼的蛋白質PPARγ 可以調節脂肪細胞的分化，當脂肪細胞分化受到抑制時，人體的脂肪組織和脂肪細胞的體積會相應減少［7］。EGFR 可以擴張血管使血壓降低，從而使脂類物質不易堆積在血管中，進而減輕高血脂堵塞血管的危害。所有高頻中藥中，一半以上的成分都可以與高脂血癥的關鍵靶點很好地結合，說明每個高頻中藥對治療高脂血癥均有不同程度的作用，為后續使用單味中藥治療高脂血癥以及后人用這些高頻中藥重組新方治療該病提供了一定的指導意義。而高頻中藥陳皮中的橙皮素-7-氧-蘆丁苷與PPARG靶點的結合性最強，提示其對高脂血癥可以發揮最穩定的藥理作用?；⒄戎械奶J丁與LIPE靶點也能較好結合，提示其治療高脂血癥的特征成分有蘆丁及蘆丁類似物，同時它們可以防治血管內皮損傷，減少甚至消除高血脂對血管內皮的損傷［14］。

綜上所述，文章采用網絡藥理學和分子對接的方法，分析了治療高脂血癥最有效中藥組合（山楂、何首烏、丹參、決明子、澤瀉）可能作用的潛在靶點、生物學過程、細胞組成、分子功能、信號通路，并進一步總結出其可能存在的作用機制，驗證了高頻中藥成分和關鍵靶點分子對接具有良好的契合度。該藥物組合可能通過促進脂質代謝、抑制脂肪細胞分化來減少脂質、擴張血管，從而減少血管堵塞，緩解高血脂對血管內皮的損傷。