當歸芍藥散對血管性癡呆模型大鼠炎癥反應、神經凋亡、Aβ 轉運相關細胞因子的影響

曲美潔 唐詠春 臧運華 于 淼 王瀟慧 周喜燕

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東濟南 250199；2.青島大學附屬海慈醫院，山東青島 266033）

隨著我國老齡人口的增加，血管性癡呆（vascular dementia，VaD）的發病率與日俱增，我國VaD患者占據全球VaD患者總數的四分之一。本病作為血管性認知障礙，是由腦血管疾病引起腦區低灌注引起，以語言、情感功能、認知功能的障礙及記憶力下降為主要臨床表現[1]。當前VaD發病機制尚不明確，主要集中在炎癥反應、神經元凋亡、氧化應激、神經元細胞鈣超負荷等方面[2]。作為僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類型，也是目前唯一可以預防治療的癡呆類型[3]，本病目前主要的治療方法是采用多種藥物聯合，控制炎癥反應、保護腦神經[4]，但尚未取得理想的治療效果。因此，臨床針對VaD的研究重點主要以早期防治為主，延緩病情進展，減輕VaD患者痛苦。相關研究表明，炎癥反應、神經元凋亡等機制是VaD形成的關鍵[5]。腦組織缺血缺氧，導致局部內皮細胞、神經元等被激活，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子κB（NF-κB）等炎性因子，促進腦組織β-淀粉樣蛋白（Aβ）產生，引發炎癥級聯反應，促進細胞凋亡，損傷腦組織，從而引起認知障礙[6-7]。因此，減少炎性因子釋放和Aβ產生、抑制神經細胞凋亡、改善神經損傷是防治血管性癡呆發生、發展的關鍵分子機制。

當歸芍藥散出自《金匱要略》，具有養血柔肝、健脾祛濕等功效?，F代藥理學研究證實，當歸芍藥散中含有抗炎、調節免疫、保護神經等多種有效成分[8]，可以起到明顯的擴張末梢血管、改善微循環、促進腦代謝活化功效[9]，對VaD患者的癥狀具有較好的改善作用。因此本實驗研究基于炎癥因子釋放、神經元凋亡等因素，通過永久性結扎雙側頸總動脈建立VaD動物模型，觀察當歸芍藥散對VaD模型大鼠空間學習和記憶能力、海馬組織細胞凋亡的影響，及其對TNF-α/NF-κB信號通路，以及B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、兔抗人單克隆抗體（Bax）蛋白和低密度脂蛋白受體（LRP1）、糖基化終末產物受體（RAGE）基因的調控作用，探索其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 封閉群純種SPF級SD雄性健康大鼠，體重180～220 g，由青島市實驗動物中心提供，動物飼養及實驗過程遵循實驗動物3R原則。本研究經青島大學附屬海慈醫院倫理委員會審批通過（倫理審批編號：2022HC05LS013）。大鼠在安靜環境下分籠飼養，自由飲水、攝食，室溫（23±1）℃，相對濕度60%，光線自動控制，每12 h明暗交替，統一使用符合規定的大鼠飼料和水喂養。

1.2 實驗藥物 當歸芍藥散，藥物組成：當歸9 g、白芍48 g、川芎24 g、茯苓12 g、澤瀉24 g、白術12 g，所有藥品均購自青島市中醫院中藥房，且均為道地藥材。藥液制備方法：藥物使用超純水浸泡1 h后，大火煮沸，轉文火再煮沸30 min，收集藥液，剩余藥材重復上述步驟再次煎煮，收集并混合2次藥液，60 ℃濃縮，分裝，置于-20 ℃冰箱中保存備用，使用前加熱并用超純水稀釋成濃度分別為72 mg/mL（高劑量）、18 mg/mL（低劑量）的藥液。

尼莫地平片，拜耳醫藥保健有限公司生產，批號：H20003010，規格20 mg，研磨成粉，用超純水配置成濃度16.8 mg/mL的溶液，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3 主要試劑 二甲苯、無水乙醇、碳酸鋰、冰醋酸、30%H2O2（批 號：10023418、10009218、20022818、10000218、10011218），購自國藥集團化學試劑有限公司；蘇木素伊紅（批號：G1004），購自武漢塞維爾生物科技有限公司；Bax兔抗人單克隆抗體（1∶1000，批號：PAB46088）、兔Bcl-2 單克隆抗體（1∶1000，批號：A00040-1），購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠TNF-α抗體、兔抗大鼠NF-κB抗體，購自英國abcam公司；TNF-α酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒、NF-κB ELISA試劑盒、蛋白Marker、DAB顯色液、2×Tap聚合酶鏈式 反 應（PCR）master Mix（批 號：QYH-12018、P12103、G1022、G3302-01），購自武漢塞維爾生物科技有限公司；PVDF轉移膜、化學發光試劑（批號：IPVH00010、WBKLS0500），購自上海未熹生物科技有限公司；DAB濃縮試劑盒、封閉山羊血清、終止液（批號：DA1010、SL038、C1058），購自北京索萊寶科技有限公司；20×Tris-EDTA修復液、TBE電泳緩沖液（批號：G1203、G3002），購自武漢塞維爾生物科技公司；PBS緩沖液，購自山東西亞化學有限公司；枸櫞酸緩沖液（批號：BL604A），購自福州奧研實驗器材責任公司；溴酚藍指示劑（批號：115-39-9），購自湖北興琰新材料科技有限公司。

1.4 主要儀器 正置顯微鏡、石蠟切片機（型號：DM1000、RM2235），購自徠卡纖維系統有限公司；移液器（型號：P100、P200），購自吉爾森P型移液器公司；恒溫烘箱（型號：DHG-9023A），購自上海一恒科學儀器有限公司；攤片烤片機、自動組織脫水機（型號：TKD-TK、TKD-TSF），購自湖北康強醫療器械有限公司；穩壓DNA電泳儀（型號：mini protean 3 cell），購自伯樂生命醫學產品有限公司；恒溫烘箱（型號：TY-HX），購自臺?？萍脊?；水迷宮（型號：BW-MWM101），購自上海軟隆科技發展有限公司；實時免疫熒光PCR儀（型號：MiniAmp），購自美國ABI公司；全自動化學發光儀（型號：HISCL-5000），購自上海繼圣醫療器械有限公司；離心機（批號：SMP-2），購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 SD大鼠適應性飼養2周后，行Morris水迷宮測試，剔除120 s內找不到平臺者。測試結束3 d后采用雙側頸總動脈永久性結扎法建立VaD動物模型[10]：造模前禁食12 h，注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，確保手術期間大鼠有自主呼吸；保持仰臥姿勢，固定頭部，去毛備皮，消毒后沿頸正中切開，分離出雙側頸總動脈后選用0號慕絲線結扎，縫合傷口。另取12只SD大鼠作為假手術組，假手術組大鼠不結扎頸總動脈，只做皮膚切口和組織分離處理后縫合皮膚。手術后各組大鼠均予青霉素10萬單位肌注3 d防感染，觀察大鼠待活動正常后放回實驗室繼續喂養。術后3 d，所有造模大鼠再次行水迷宮測試，逃避潛伏期＞55 s，跨越平臺頻率＜1 次/60 s，且出現精神較差、反應遲鈍、活動減少、舌質暗紅等表現者，表明造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組和當歸芍藥散低、高劑量組，每組12只。

2.2 給藥 造模完成1 周后開始灌胃給藥。陽性對照組灌胃給予尼莫地平片1.68 g/（kg·d），當歸芍藥散低、高劑量組分別灌胃給予中藥溶液1.8、7.2 g/（kg·d），假手術組、模型組每日灌胃給予等體積蒸餾水。各組均每日灌胃1次，灌胃體積為1 mL/10 g，連續4周。

2.3 取材 末次灌胃后次日，每組隨機取8只大鼠進行Morris水迷宮測試；測試結束后次日，每組大鼠再隨機取8只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，于腹主動脈處取血，離心分離血清，于-20 ℃冰箱中保存擬用于ELISA法檢測；隨后迅速斷頭處死大鼠，取部分海馬組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化、蘇木素-伊紅（HE）染色；另取部分海馬組織放入凍存管，立即轉移到-80 ℃冰箱中凍存，用于實時熒光定量PCR法檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 Morris水迷宮測試行為能力 末次灌胃結束后，各組大鼠禁食禁水24 h，每組隨機選取8只，采用Morris水迷宮測試檢測各組大鼠的學習記憶能力。測試包括兩項：（1）定位巡航試驗檢測逃避潛伏期：每只大鼠連續訓練4 d，按照設計好的順序將其面向池壁，從各入水口放入水中，記錄60 s內找到平臺的實際時間（即逃避潛伏期），如果大鼠在60 s內找不到平臺，則由實驗者引導找到平臺，記錄逃避潛伏期為60 s。每次找到平臺后，均使其于平臺停留20 s。（2）空間探索試驗檢測穿越平臺數：定位巡航試驗結束后次日，使大鼠面向池壁，輕輕放入水中，入水口選在平臺對角處，測試時間60 s，記錄其穿越平臺位置的次數，判斷大鼠記憶存儲和再現能力。

2.4.2 HE染色檢測海馬神經元組織病理形態變化 取浸泡于4%多聚甲醛中固定的各組大鼠海馬組織，按常規步驟脫水浸蠟包埋，沿矢狀面切片，厚度約4 μm，嚴格參照試劑盒說明進行HE染色，中性樹脂膠封片，光鏡下觀察海馬組織病理形態，評價神經元損傷程度。

2.4.3 免疫組化法檢測海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達 取每組8只大鼠海馬組織按常規步驟脫水、浸蠟、包埋后切片，厚度4 μm，65 ℃烤片1 h后脫蠟水化；用枸櫞酸緩沖液進行抗原修復；3%H2O2濕盒孵育10 min，PBS緩沖液沖洗，阻斷后置于封閉山羊血清中室溫封閉，分別滴加Bax（稀釋比為1∶200）、Bcl-2抗體（稀釋比為1∶100），4 ℃冰箱孵育過夜，復溫45 min后滴加二抗，DAB顯色后，經蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片。于光學顯微鏡下拍照觀察，并采用Image J軟件分析OD值。

2.4.4 ELISA法 檢 測 大 鼠 血 清TNF-α、NF-κB含量 取每組8只大鼠血清，按ELISA試劑盒說明書上的操作步驟進行檢測，于多功能酶標儀450 nm波長處讀取OD值并進行分析，根據標準曲線計算大鼠血清TNF-α、NF-κB含量。

2.4.5 實時熒光定量PCR法檢測海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA表達 取凍存的各組大鼠海馬組織約100 mg，使用Trizol法提取細胞總RNA，電泳確定RNA完整性，并檢測RNA純度及濃度，將RNA逆轉錄合成cDNA，進行實時定量PCR，嚴格按照試劑盒說明書操作，以適量cDNA進行PCR擴增反應，反應條件為：95 ℃預變性持續1 min，95 ℃變性持續5 s，60 ℃退火持續10 s，72 ℃延伸30 s，連續循環40次。系列反應結束后得到Ct值，采用2-△△Ct計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 大鼠海馬組織LRP1、RAGE mRNA引物序列

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計學分析。本研究所有計量資料均滿足正態分布，采用均值±標準差（±s）表示，經檢驗（檢驗水準為0.05），資料均滿足方差齊性，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠行為能力比較 定位巡航試驗結果顯示：模型組大鼠每日逃避潛伏期均明顯長于假手術組（P＜0.01）；各給藥組大鼠每日逃避潛伏期均明顯短于模型組（P＜0.01），其中當歸芍藥散高劑量組每日逃避潛伏期均明顯短于低劑量組和陽性對照組（P＜0.05，P＜0.01），當歸芍藥散低劑量組第4天逃避潛伏期與陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）?？臻g探索試驗結果顯示：模型組大鼠穿越平臺次數明顯少于假手術組（P＜0.01）；各給藥組大鼠穿越平臺次數均明顯多于模型組（P＜0.05，P＜0.01），其中當歸芍藥散高劑量組穿越平臺次數明顯多于低劑量組和陽性對照組（P＜0.01），當歸芍藥散低劑量組穿越平臺次數與陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮測試行為能力比較（±s）

表2 各組大鼠Morris水迷宮測試行為能力比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與當歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

逃避潛伏期/s穿越平臺數/次第1天 第2天 第3天 第4天假手術組 8 22.36±1.00 13.39±0.84 10.93±0.37 9.63±0.75 2.72±0.46模型組 8 56.43±3.09** 48.20±3.59** 42.18±3.58** 39.17±2.68** 1.35±0.09**陽性對照組 8 29.44±2.15△△ 27.43±1.62△△ 20.52±1.24△△ 12.08±1.08△△ 1.51±0.11△△當歸芍藥散低劑量組 8 42.44±2.10△△## 37.03±1.88△△## 28.08±1.30△△## 12.03±0.68△△ 1.40±0.05△當歸芍藥散高劑量組 8 25.71±2.07△△##☆☆ 19.08±2.60△△##☆☆ 13.61±1.58△△##☆☆ 9.94±0.94△△#☆☆ 2.89±0.32△△##☆☆組別 動物數/只

3.2 各組大鼠海馬組織病理形態比較 假手術組大鼠海馬組織CA1區細胞數量多，體積大，排列整齊，結構正常，邊界清晰，胞膜、核膜清晰，胞核明顯。模型組大鼠海馬組織CA1區細胞數量明顯減少，排列稀疏，部分細胞腫脹，結構不齊，胞核變小、固縮、凋亡，細胞膜、核膜界限不清。與模型組比較，各給藥組大鼠神經元病理改變均較輕，其中當歸芍藥散高劑量組大鼠海馬組織CA1區細胞數量顯著多于模型組，排列分布相對齊整，結構形態基本正常。詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織病理形態（HE染色，×100）

3.3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達比較 模型組大鼠海馬組織Bcl-2 蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax值均明顯高于假手術組（P＜0.01），Bax蛋白相對表達量明顯低于假手術組（P＜0.05）。各給藥組大鼠海馬組織Bcl-2 蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax值均明顯低于模型組（P＜0.01），Bax蛋白相對表達量明顯高于模型組（P＜0.01）。當歸芍藥散高劑量對上述指標的改善作用顯著優于低劑量和陽性藥物（P＜0.01），當歸芍藥散低劑量組Bcl-2 蛋白相對表達 量、Bcl-2/Bax值 與 陽 性 對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖2、表3。

表3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax值比較（±s）

表3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax值比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與當歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動物數/只 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax假手術組 8 0.19±0.04 0.13±0.03 1.46±0.25模型組 8 0.28±0.03** 0.08±0.02** 3.54±0.66**陽性對照組 8 0.18±0.02△△ 0.19±0.01△△ 0.96±0.09△△當歸芍藥散低劑量組 8 0.18±0.02△△ 0.15±0.01△△# 1.18±0.11△△當歸芍藥散高劑量組 8 0.11±0.03△△##☆☆ 0.33±0.05△△##☆☆ 0.35±0.05△△##☆☆

3.4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較 模型組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量均顯著高于假手術組（P＜0.01）；各給藥組大鼠血清上述指標含量均顯著低于模型組（P＜0.01），其中當歸芍藥散高劑量組大鼠上述指標水平均顯著低于低劑量組和陽性對照組（P＜0.01）。詳見表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較（±s）

表4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，##P＜0.01；與當歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動物數/只 TNF-α/（pg/mL） NF-κB/（pg/mL）假手術組 8 50.16±10.10 26.81±4.11模型組 8 339.05±36.32** 180.13±11.64**陽性對照組 8 176.08±11.14△△ 90.97±5.32△△當歸芍藥散低劑量組 8 236.96±14.9△△## 118.58±7.70△△##當歸芍藥散高劑量組 8 117.90±19.34△△##☆☆ 59.94±6.76△△##☆☆

3.5 各組大鼠海馬組織LRP1、RAGE mRNA相對表達量比較 模型組大鼠海馬組織LRP1 mRNA相對表達量顯著低于假手術組（P＜0.01），RAGE mRNA相對表達量顯著高于假手術組（P＜0.01）。各給藥組大鼠海馬組織LRP1 mRNA相對表達量顯著高于模型組（P＜0.01），RAGE mRNA相對表達量顯著低于模型組（P＜0.01）。當歸芍藥散高劑量對大鼠海馬組織上述基因表達的改善作用顯著優于低劑量和陽性藥物（P＜0.05，P＜0.01），當歸芍藥散低劑量對大鼠海馬組織LRP1 mRNA表達的提升作用顯著優于陽性藥物（P＜0.01）。詳見表5。

表5 各組大鼠海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA相對表達量比較（±s）

表5 各組大鼠海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA相對表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與當歸芍藥散低劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動物數/只 LRP1 mRNA RAGE mRNA假手術組 8 8.55±0.24 0.20±0.02模型組 8 0.85±0.07** 13.18±1.50**陽性對照組 8 1.66±0.31△△ 1.00±0.07△△當歸芍藥散低劑量組 8 2.10±0.12△△## 7.92±0.52△△##當歸芍藥散高劑量組 8 9.79±0.53△△##☆☆ 0.30±0.03△△#☆☆

4 討論

研究表明，VaD疾病進程與NF-κB、TNF-α等炎性因子激活炎癥反應，Bax、Bcl-2等凋亡因子加速神經凋亡，LRP1、RAGE等轉運因子調控Aβ沉積等密切相關，治療本病則應基于改善Aβ誘導的膽堿能神經元凋亡，調節Aβ沉積，抑制炎癥信號傳遞，增強血流灌注，在一定程度上減少腦組織損傷。

血管性癡呆屬于中醫學“癡呆”范疇，《雜病源流犀燭·中風源流》中提及“中風后善忘”。本病病機復雜，可因五臟失和、腦竅失養、神失所養、神機失用而發病?，F代醫家基于前人經驗提出本病病因病機為髓海不足、脾腎不足、肝氣郁結、痰濁蒙竅等，以補髓益智、補益脾腎、行氣化郁等為治則，祛邪扶正，改善患者癥狀。當歸芍藥散由當歸、白芍、茯苓、白術、澤瀉、川芎六味藥物組成。方中川芎、當歸、白芍補益氣血，茯苓、澤瀉、白術祛水化濕，其中白芍兼疏肝化瘀[11]。諸藥合用，開斂結合，走守并進，以肝脾兩臟入手，健脾益氣、養血柔肝，增強患者正氣，祛除積留體內濕瘀之邪[12]。VaD患者多因肝脾不足、痰瘀阻滯而腦竅不通、神機失養，故以當歸芍藥散補益肝脾、化痰祛瘀?，F代藥理學研究發現，當歸芍藥散可通過調控凋亡因子、抑制炎癥反應和減少Aβ沉積等途徑，調控炎癥介質分泌，發揮抗炎作用，延緩細胞凋亡，調節免疫[13-15]，與現代醫學藥物治療VaD方向一致。

細胞凋亡受Bcl-2、Bax等凋亡因子影響[16]，控制線粒體膜的通透性，調節凋亡激活物的釋放，激活通道，Bax與Bcl-2形成易聚體，兩者協作調控細胞凋亡，因此逆轉兩種蛋白表達，可減輕腦損傷，一定程度上起到修復腦神經的作用[17-18]。Aβ對神經系統的毒性作用導致血管壁淀粉樣變，進而導致血管硬化、彈性變差，增加血管壁破裂以及血栓形成風險，甚至誘使神經元過早凋亡。相關實驗研究發現，Aβ沉積抑制突觸生長，導致神經變性，降低神經元存活率，進而推動VaD病情進展[19]。LRP1作為大腦中參與代謝的主要受體，廣泛存在于神經元細胞中，不僅參與脂質代謝，而且是清除Aβ的重要轉運體，其功能水平降低與認知性障礙加重密切相關[20]；RAGE作為膜蛋白，則是通過介導多種激酶，激活炎癥信號通路，引起細胞凋亡壞死[21]。LRP1與RAGE均為Aβ重要轉運蛋白，參與調節Aβ沉積[22]，抑制神經膠質細胞激活、神經炎癥發生、神經細胞凋亡過程[23]。NF-κB作為缺血損傷反應最早的關鍵因子，同時又是起關鍵作用的核轉錄因子[24]，在機體炎癥反應和細胞的分裂分化和成熟等方面發揮重要作用[25]，腦缺血組織損傷激活NF-κB[26]，促進TNF-α表達[27]，若抑制NF-κB信號通路發揮作用，減少神經炎癥反應和內質網應激，保護神經元功能，則能延緩VaD疾病進程[28]。

本研究結果表明，模型組大鼠學習記憶能力明顯異常，海馬組織神經元損傷，血清TNF-α、NF-κB表達增加，海馬組織Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達降低，Bcl-2/Bax值增加，LRP1 mRNA表達降低，RAGE mRNA表達增加，炎癥、凋亡及Aβ轉運相關細胞因子均出現異常表現。經當歸芍藥散、尼莫地平治療后，VaD模型大鼠學習記憶能力顯著提高，海馬組織神經元細胞數量、形態明顯恢復，上述細胞因子得到顯著改善，其中當歸芍藥散高劑量效果更為明顯，顯著優于低劑量和陽性藥物尼莫地平。

綜上，當歸芍藥散對VaD模型大鼠有一定的治療作用，且可顯著改善VaD模型大鼠海馬組織細胞形態，其可能的作用機制：通過抑制TNF-α、NF-κB表達緩解大鼠海馬組織炎癥反應，一定程度上減少腦組織損傷，提高認知水平；通過調節Bcl-2、Bax凋亡因子延緩細胞凋亡，改善VaD神經損傷，起到腦保護作用；通過激活LRP1、抑制RAGE兩種轉運蛋白，促進Aβ清除，減少Aβ沉積，促進海馬突觸長時程增強，進而保護神經元，促進神經重塑。且當歸芍藥散上述作用表現出一定的劑量依賴性。由于本研究實驗動物樣本數較少，藥物濃度梯度不足，下一步將增加樣本量，豐富中藥濃度梯度，并進一步分析當歸芍藥散有效成分，探索其他作用靶點，深入研究其作用機制，從而更好地指導臨床運用。