烤煙褪色前后主要化學成分的變化特征及規律

肖友萍，鐘 帥，金保鋒，梁耀星，馮玉龍，郭俊杰，王文輝，蔡一霞，王 維*

1.華南農業大學農學院，廣州市天河區五山路483 號 510642 2.廣東中煙工業有限責任公司，廣州市天河區林和西橫路188 號 510500 3.廣東煙草梅州市有限公司，廣東省梅州市梅江區全燕大道118 號 514011

近些年，廣東、廣西和福建等煙區的初烤煙葉在存放過程中的褪色現象時有發生，原煙褪色的主要原因是煙葉中類胡蘿卜素的降解，褪色煙葉在外觀上表現為銀灰、發白［1］，原煙的外觀特征是煙葉收購、調撥等環節中質量判定的重要依據［2］，而褪色原煙在顏色上的變化將直接影響原煙的外觀特征，導致原煙外觀質量下滑及收購等級降低，進而降低原煙的工業可用性和經濟價值。類胡蘿卜素是原煙桔黃顏色特征得以體現的基本物質［3-5］，邵蘭軍等［6］研究發現在高溫和潮濕環境下原煙中類胡蘿卜素保存率降低，導致原煙顏色發生明顯變化。

原煙的褪色程度可以通過L*、a*和b*顏色指標進行表征［7-8］。劉高［9］研究發現，原煙的L*、a*和b*值均與類胡蘿卜素的質量分數顯著正相關，與褪色程度負相關。賀帆等［10］研究發現煙葉在烘烤過程中的顏色參數色差值的變化與煙葉化學成分具有一定的關聯性。柳均等［11］研究表明，原煙還原糖和總酚的質量分數與顏色參數a*值顯著負相關，與b*值顯著正相關。但目前關于原煙褪色對主要化學成分影響的報道較少，且較少涉及不同品種原煙之間抗褪色能力的比較。為此，本研究中分析了不同品種C3F 和B2F等級原煙褪色前后的顏色參數和主要化學成分的差異，并建立正交偏最小二乘回歸（Orthogonal partial least squares，OPLS）模型，以明確原煙主要化學成分與其顏色參數之間的量化關系，并比較不同品種原煙的抗褪色能力，旨在為煙葉生產上選擇抗褪色烤煙品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

供試材料為2021 年產云煙87、粵煙1 號、HB030、湘煙7 號和NX212 品種的C3F 和B2F 等級的煙葉，產地為廣東省梅州市五華縣。

乙醇（95%，天津市富宇精細化工有限公司）；甲醇溶液（70%，天津市四友精細化學品有限公司）；H3PO4溶液（0.1 mol/L，上海穗試化工科技有限公司）；3,5-二硝基水楊酸（上海麥克林生化科技有限公司）。

WG-01恒溫恒濕箱（湖北恒豐醫療制藥設備有限公司）；Multiskan FC 酶標儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；LC-20A 高效液相色譜儀（上海納锘實業有限公司）；CR-10 色差儀（柯尼卡美能達控股公司）；HZK-FA210S電子天平（感量0.000 1 g，福州華志科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

田間試驗于2021 年在廣東省梅州市五華縣進行，選擇土地平整的田塊進行試驗，前茬作物為水稻，土壤堿解氮為150.02 mg/kg，速效磷為4.45 mg/kg，速效鉀為129.88 mg/kg。試驗品種（品系）為云煙87、粵煙1 號、HB030、湘煙7 號和NX212，其中，云煙87為當地主栽品種。田間試驗采用隨機區組設計，設置3次重復，生產管理措施保持一致。每個品種均選取C3F 和B2F 等級（樣品等級均由專業分級人員按照GB/T 2635—1992［12］中的方法進行判定）的煙葉樣品進行人工褪色試驗，各品種均選取10片煙葉單張平鋪在恒溫恒濕箱中［光強100～120 μmol/（m2·s）、溫度25 ℃、相對濕度60%］，進行15 d褪色試驗。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 化學成分的測定

總糖和還原糖的質量分數采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定［13］；總氮和煙堿的質量分數分別按照YC/T 33—1996［14］和YC/T 34—1996［15］中的方法測定。

將新鮮煙葉或烤后煙葉剪碎并稱取0.200 0 g，置于試管中，加入95%乙醇溶液至20 mL刻度線，封口后避光提取24 h，直至組織變白。采用比色法分別在665、649、470 nm 波長下測定吸光度。依據下列公式分別計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的質量分數［9］：

式中：Ca為葉綠素a的質量分數，mg/g；Cb為葉綠素b的質量分數，mg/g；Ck為類胡蘿卜素的質量分數，mg/g；D665、D649、D470分別為665、649、470 nm波長下的吸光度。

按照張啟發等［16］優化的HPLC 法測定原煙中多酚類化合物的質量分數，色譜柱為Agilent TC-C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

原煙中有機酸類物質質量分數的測定參考易嬌等［17］建立的方法，并進行了優化。優化后的分析條件：

色譜柱：Ultimate AQ-C1反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL；流速：1 mL/min；流動相A：0.03 mol/L NaH2PO4溶液（pH=3.00）；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0 min A∶B=100 ∶0，10 min A∶B=99 ∶1，15 min A∶B=98∶2，18 min A∶B=100∶0。

1.2.2.2 顏色參數

使用色差儀測定原煙的CIE L*a*b*值，參照文獻［8］中的方法設置色差儀的主要參數。L*表示亮度值，限值為0～100，0為黑色，100為白色；a*表示紅度值，限值為±80，紅色為+，綠色為－；b*表示黃度值，限值為±80，黃色為+，藍色為－［18］。

測量時將原煙平展于實驗臺上，在每片煙葉主脈左右兩側的葉尖、葉中和葉基部正面分別取點進行測量，為確保所測數據具有代表性，每個品種測量5片煙葉后計算1次平均值，每個品種重復3次。

1.2.3 外觀質量評價

由廣東中煙工業有限責任公司5名評價人員（行業高級農藝師）對原煙褪色前后各品種的C3F 和B2F等級煙葉進行外觀質量評價。

1.2.4 數據處理

利用Excel 2016整理數據，使用SPSS 26對數據進行方差分析，使用Simca 14.1 建立OPLS 模型，并用Origin 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 原煙褪色前后色差參數分析

不同品種原煙褪色前后煙葉的照片如圖1 所示?？芍?，經人工褪色（下同）處理后，原煙葉片明顯變白，呈銀灰色，其中，NX212煙葉的褪色程度較輕，云煙87褪色情況最為嚴重，即不同品種的原煙褪色程度差異明顯。

圖1 不同品種原煙褪色前后煙葉的照片Fig.1 Photos of cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading

不同品種原煙褪色前后的顏色參數（L*、a*、b*）、色差參數（ΔL*、Δa*、Δb*）及總色差（ΔE）的值如表1所示?？芍?，不同品種原煙的ΔL*均為負值，說明原煙褪色后其亮度值增大，Δa*、Δb*均為正值，說明原煙褪色后紅度值和黃度值均有一定程度的下降。

表1 不同品種原煙褪色前后顏色參數、色差參數及總色差的值①Tab.1 Values of color parameters，color difference parameters and total color difference of cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading

對于所有品種的原煙，相比于B2F等級，C3F等級煙葉的總色差值普遍較大，表明C3F 等級煙葉褪色較為嚴重。不同品種間比較，云煙87的總色差值較大，說明該品種原煙容易褪色；而NX212總色差值較小，表明該品種原煙抗褪色能力較強。

煙葉外觀質量評價中顏色、色度指標與原煙顏色密切相關，褪色前后原煙的顏色和色度值變化如表2 所示?？芍?，不同品種原煙褪色后其顏色值和色度值均有一定程度的下降，其中，云煙87的顏色、色度分值下降最大，而NX212的顏色、色度分值變化最小。結合表1中數據，說明原煙抗褪色能力越強，其原煙外觀質量中顏色、色度值下降越少。

表2 不同品種原煙褪色前后外觀質量的顏色和色度值變化Tab.2 Variations in color and chromaticity values of cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading（分）

2.2 原煙褪色前后化學成分變化分析

2.2.1 常規化學成分變化分析

不同品種原煙褪色前后常規化學成分質量分數的變化情況如表3 所示?？芍?，所有供試品種原煙褪色后，總糖和總氮的質量分數均下降，而還原糖和煙堿的質量分數均增加，但不同等級煙葉中常規化學成分的變化有所不同。C3F 等級煙葉褪色前后，云煙87 總糖質量分數的變化幅度顯著高于其他品種，NX212 還原糖質量分數的變化幅度顯著高于其他品種，粵煙1號還原糖質量分數的變化幅度最小，煙堿和總氮質量分數的變化幅度在不同品種間無顯著差異。B2F 等級煙葉褪色前后，NX212 總糖質量分數的變化幅度最小，還原糖質量分數的變化幅度較大，與其他4個品種均有顯著差異，其中，湘煙7號還原糖質量分數的變化幅度明顯低于NX212；煙堿和總氮質量分數的變化幅度在不同品種間無明顯差異。整體而言，原煙褪色前后參試品種間總糖和還原糖質量分數的變化程度相對較大，而煙堿和總氮較小。

表3 不同品種原煙褪色前后常規化學成分質量分數的變化①Tab.3 Variations in mass fractions of routine chemical components in cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading（%）

2.2.2 多酚類物質變化分析

不同品種C3F和B2F等級原煙褪色前后多酚類物質質量分數的變化如圖2和圖3所示?？芍?，煙葉褪色過程中，綠原酸、蕓香苷及總酚的質量分數均呈下降趨勢。由圖2可知，C3F等級中粵煙1號品種在褪色前后綠原酸、蕓香苷和總酚的質量分數下降幅度最大，分別為55.57%、40.44%和45.70%，NX212品種在褪色后其綠原酸、蕓香苷和總酚的質量分數下降幅度最小，分別為38.09%、30.15%和32.53%，且褪色后NX212 品種中綠原酸、蕓香苷和總酚的質量分數均高于其他品種。由圖3可知，褪色后B2F等級中粵煙1號中綠原酸、蕓香苷和總酚的質量分數下降幅度最大，分別為44.36%、47.66%和41.97%，NX212品種褪色后綠原酸、蕓香苷和總酚的質量分數下降最小，分別為36.50%、34.75%和30.96%。綜上所述，原煙褪色前后，各品種中多酚類物質的質量分數變化情況存在差異，其中，NX212品種中多酚類物質的質量分數變化幅度最小，可能與其具有較強的抗褪色能力有關。

圖2 不同品種C3F等級原煙褪色前后多酚類物質質量分數的變化Fig.2 Variations in mass fractions of polyphenols in cured C3F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

圖3 不同品種B2F等級原煙褪色前后多酚類物質質量分數的變化Fig.3 Variations in mass fractions of polyphenols in cured B2F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

2.2.3 有機酸類物質質量分數變化分析

原煙褪色前后各有機酸類物質的質量分數變化如圖4 和圖5 所示?？芍?，所有供試品種原煙褪色后，有機酸類物質的質量分數均有所增加，但C3F和B2F等級原煙中各有機酸類物質質量分數的增幅有所不同。由圖4 可知，C3F 等級煙葉褪色后，草酸、蘋果酸和檸檬酸的質量分數以及總有機酸質量分數的平均增長幅度分別為9.71%、26.26%、31.10%和24.26%，其中，粵煙1 號褪色后，各有機酸類物質質量分數的增幅均高于平均值，且檸檬酸的質量分數和總有機酸質量分數的增幅最大，分別為41.92%和33.03%；NX212 中除草酸（增幅為20.85%）外，蘋果酸、檸檬酸以及總有機酸質量分數的增幅均低于平均值，分別為17.21%、30.56%和18.81%。由圖5 可知，B2F 等級煙葉褪色后，草酸、蘋果酸和檸檬酸的質量分數以及總有機酸質量分數的平均增幅分別為9.22%、17.42%、20.70%和17.92%，粵煙1 號褪色后各有機酸質量分數的增幅均高于平均值，其中，蘋果酸、檸檬酸以及總有機酸的質量分數的增幅最大，分別為33.47%、30.33%和30.45%；NX212 褪色后蘋果酸和檸檬酸以及總有機酸的質量分數的增幅在所有品種中最小，分別為6.86%、5.19%和9.07%。由以上分析可知，原煙褪色對各品種不同等級煙葉中有機酸類化合物質量分數的影響具有一定的差異，其中，NX212品種的穩定性最好。

圖4 不同品種C3F等級原煙褪色前后有機酸類物質質量分數的變化Fig.4 Variations in mass fractions of organic acids in cured C3F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

圖5 不同品種B2F等級原煙褪色前后有機酸類物質質量分數的變化Fig.5 Variations in mass fractions of organic acids in cured B2F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

2.2.4 類胡蘿卜素質量分數變化分析

不同品種原煙褪色前后類胡蘿卜素質量分數的變化如圖6所示?？芍?，不同品種原煙C3F和B2F等級煙葉經褪色處理后類胡蘿卜素質量分數的降幅均較大，平均降幅分別為74.32%和72.64%。褪色前，NX212 原煙中類胡蘿卜素的質量分數最高，湘煙7號中類胡蘿卜素的質量分數最低。經褪色處理后，NX212 和HB030 原煙中類胡蘿卜素的質量分數較高，云煙87、粵煙1 號和湘煙7 號中類胡蘿卜素的質量分數較低，說明不同品種原煙經褪色處理后類胡蘿卜素質量分數的變化存在一定差異。其中，NX212 中類胡蘿卜素質量分數的降幅最小，且褪色后質量分數較高，這可能與該品種具有較強的抗褪色能力有關。

圖6 不同品種原煙褪色前后類胡蘿卜素質量分數的變化Fig.6 Variations in mass fraction of carotenoid in cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading

2.3 OPLS模型分析原煙褪色程度與化學成分之間的關系

以不同品種原煙化學成分的質量分數作為自變量（X），L*、a*和b*的值作為因變量（Y），建立OPLS 模型，該模型中自變量的R2為0.911，因變量的R2為0.843，說明所建模型分別解釋了X 變量和Y 變量中91.1%和84.3%的信息量（置信區間95%）。初烤煙葉與褪色煙葉中不同化學成分的OPLS 模型如圖7 所示。根據特征值大于1的原則，化學成分（總糖、還原糖、煙堿、總氮、綠原酸、蕓香苷、總酚、草酸、蘋果酸、檸檬酸、總有機酸和類胡蘿卜素）中提取到2個主成分［t1（38.6%）表示對自變量提取的第1 個主成分，t2（16.3%）表示對自變量提取的第2 個主成分］，這2個主成分的累計貢獻率達0.549（>0.5），可以解釋大部分原始變量的基本信息。

圖7 初烤煙葉與褪色煙葉中不同化學成分的OPLS模型Fig.7 OPLS models for different chemical components in cured tobacco leaves before and after color fading

通過OPLS 模型建立得到的主成分的載荷圖如圖8 所示［t1（38.6%）表示對自變量提取的第1 個主成分，u1（35.2%）表示對因變量提取的第1 個主成分，下同］。根據X 變量和Y 變量在t1方向上的投影可知，總糖、總氮、類胡蘿卜素、蕓香苷和綠原酸與L*、a*、b*指標存在較強的正相關關系，還原糖、煙堿、草酸、蘋果酸和檸檬酸與L*、a*、b*指標存在一定的負相關關系。

圖8 OPLS模型主成分載荷圖Fig.8 Principal component load diagram of OPLS model

為進一步明確初烤煙葉與褪色煙葉的化學成分與L*、a*、b*指標間的量化關系，對數據進行OPLS 回歸分析。不同品種原煙化學成分的質量分數（X 變量）與L*、a*、b*指標（Y 變量）的主成分擬合方程的R2為0.759，說明X 變量與Y 變量之間存在較強的線性關系，回歸方程為：

Y=0.30X綠原酸+0.27X總氮+0.25X類胡蘿卜素+0.10X蕓香苷-0.05X還原糖-0.05X煙堿+0.03X總糖-0.04X檸檬酸-0.10X草酸-0.14X蘋果酸

該回歸方程中，綠原酸、總氮、類胡蘿卜素、蕓香苷和總糖的回歸系數均為正值，說明其質量分數與L*、a*、b*指標正相關，上述化學指標的質量分數有所降低；還原糖、煙堿、檸檬酸、草酸和蘋果酸的回歸系數均為負值，說明其質量分數與L*、a*、b*指標負相關，上述化學指標的質量分數有所升高。

將不同品種原煙褪色前后化學成分的質量分數帶入回歸方程可以得出對應的ΔY 值，結果如表4 所示?？芍?，NX212 品種的C3F 和B2F 等級原煙抗褪色能力最強，其次是湘煙7號和HB030，云煙87和粵煙1號品種不同等級原煙的抗褪色能力有所差異，但在所有供試品種中均表現較差。

表4 不同品種原煙的抗褪色能力排序Tab.4 Orders of cured tobacco leaves of different varieties ranked by color fade resistance

3 討論與分析

（1）原煙褪色后其顏色參數L*、a*、b*的值均有所下降，外觀上表現為色澤暗淡，紅度值和黃度值下降。由各品種原煙的總色差變化幅度可知，NX212品種原煙的C3F和B2F等級煙葉褪色前后的總色差最小，說明其抗褪色能力較強；對于所有品種的原煙，C3F 等級煙葉的褪色程度均高于B2F 等級。不同品種和不同等級的原煙褪色前后各化學成分的質量分數變化幅度有所差異，這可能與顏色變化的酶促棕色化反應及美拉德反應等化學變化有關［19-21］。

（2）褪色后原煙的總糖、總氮、總酚、綠原酸、蕓香苷和類胡蘿卜素的質量分數均顯著下降，而還原糖、煙堿、草酸、蘋果酸、檸檬酸和總有機酸的質量分數均有所上升。褪色后煙葉中總糖和總氮質量分數的下降可能與美拉德反應和氨類物質逸散有關［22］。劉高［9］在研究存放時間對原煙化學成分的影響時發現，原煙總氮和煙堿的質量分數與存放時間呈負相關關系，這與本研究中原煙褪色后煙堿質量分數上升有所差異，原因可能是不同品種的原煙表面菌群組成有較大差異［23］，導致微生物分解碳水化合物、含氮物質等的速率不一樣?？偡?、綠原酸、蕓香苷質量分數的減少可能是原煙在褪色過程中，酚類化合物的酶促棕色化反應過程激烈，程度較深，相關化學成分消耗過度有關，而且過度消耗這些物質會使煙葉內在品質變差，還會對煙葉外觀質量造成一定的影響［23］。有機酸質量分數上升可能與原煙中一些物質被氧化成有機酸有關［22］。類胡蘿卜素質量分數下降的原因是煙葉經調制后類胡蘿卜素從原有組織中游離出來，容易受熱和氧等因素的影響而降解［24］，從而導致原煙黃度值下降。值得注意的是，NX212 原煙在褪色后總酚、綠原酸、蕓香苷和類胡蘿卜素的降幅普遍較小，可能與其不易褪色的特性有關。

（3）本研究中通過構建OPLS回歸模型進一步分析了煙葉褪色程度與其主要化學成分的內在聯系。通過分析可知總糖、總氮、類胡蘿卜素、綠原酸和蕓香苷與L*、a*、b*值呈正相關關系，因此，上述指標在原煙褪色后質量分數降低；還原糖、煙堿、草酸、蘋果酸和檸檬酸則表現為負相關，這些指標在原煙褪色后質量分數上升。

本研究可為篩選耐褪色烤煙品種提供參考。

4 結論

（1）原煙褪色后其顏色參數L*、a*、b*的值均有所下降，總糖、總氮、總酚、綠原酸、蕓香苷和類胡蘿卜素的質量分數均顯著下降，而還原糖、煙堿、草酸、蘋果酸、檸檬酸和總有機酸的質量分數均有所上升。

（2）OPLS 模型分析結果表明，總糖、總氮、類胡蘿卜素、綠原酸和蕓香苷與L*、a*、b*的值呈正相關關系，還原糖、煙堿、草酸、蘋果酸和檸檬酸與其呈負相關關系。

（3）NX212各等級原煙褪色前后的總色差最小，褪色后總酚、綠原酸、蕓香苷、蘋果酸、檸檬酸、總有機酸和類胡蘿卜素的降幅均最小，其抗褪色能力較強，不易褪色。