基于分子模擬技術篩選具有潛在治療非小細胞肺癌的ROS1激酶抑制化合物

劉飛遠 梁佳龍,2 孫智勇△ 陳偉 劉建青

(1.中國人民解放軍陸軍第946醫院,新疆 伊寧 835000;2.空軍軍醫大學藥學院,陜西 西安 710032;3.包頭師范學院生物科學與技術學院,內蒙古 包頭 014030)

受體酪氨酸激酶的胰島素受體家族是一個龐大的家族,其中肉瘤致癌因子c-ros(ROS proto-oncogene 1,ROS1)是家族成員之一,該因子參與調節細胞的存活、細胞分化、細胞轉化、細胞增殖、細胞遷移和細胞凋亡等生命各個過程。不但在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中發現ros1基因重排可以使ROS1激酶被持續激活,從而使ros1基因陸續在直腸癌、卵巢癌、胃癌、膽管癌等惡性腫瘤中發現重排,最終使RAS/MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT 等多種信號通路受到干擾,導致腫瘤發生。因此,ROS1激酶已經被確定為腫瘤治療的重要靶點[1]。本文旨在通過分子模擬方法篩選出能夠抑制ROS1的先導化合物。

1 材料與方法

1.1 數據來源波士頓塔夫茨大學醫學院Al Charest[2]課題組的研究表明,PF-06463922 是最有效和最具選擇性的新一代小分子ROS1抑制劑。文中詳細闡述了兩者之間的結合作用模式,其中的小分子抑制劑見圖1。在RCSB PDB蛋白質數據庫中,該化合物與ROS1激酶的復合物晶體結構編號為4UXL。

圖1 PF-06463922

1.2 實驗條件分子模擬實驗在聯想P920塔式工作站上進行,該服務器搭載雙路英特爾至強5218CPU、英偉達P5000計算加速卡、內存配備128G、Windows10操作系統,分子模擬實驗在Discovery Studio 3.5中進行。

1.3 構建藥效團模型T.M.Kumar等[3]的研究闡明[3],藥效團模型具有良好的篩選準確性和藥物制備性,在眾多藥效團模型構建方法中,本研究采用了當前主流的藥效團模型構建方法,即基于配體和受體相互作用的藥效團模型。解析4UXL中ROS1融合蛋白與PF-06463922之間的相互作用,構建配體—受體的藥效團模型,用于后續的先導化合物篩選。

1.4 虛擬篩選使用Discovery Studio3.5-build 3D database工具進行虛擬篩選。實驗以加州大學舊金山分校藥化系設計、更新的ZINC15數據庫為基礎,該數據庫是全球最大的化合物數據庫[4],被各大藥物研發機構用于虛擬篩選[5]。本課題組選用可購買的全部化合物數據庫,用于構建藥效團模型,并進行虛擬篩選。

1.5 分子對接本課題組通過對4UXL晶體復合物結構中PF-06463922小分子抑制劑與受體蛋白之間進行對接預實驗,分別對Discovery Studio3.5軟件中的CDOCKER、Libdock、Ligandfit三種對接方法進行了可靠性驗證[6-7]。

1.6 分子動力學模擬[8]該方法可有效反映配體藥物分子與受體靶蛋白之間的關系[9-10],從而以最佳對接構象當做起始狀態,使用Discovery Studio3.5軟件中的solvation計算方法,溶劑化的初始條件是以對接結果最佳的化合物和受體蛋白間的結合作用模式為標準。使用標準動力學流注算法(SDC算法)進行分子動力學模擬,基準溫度為300K,恒溫恒壓,時間間隔2fs,持續時間500 ps[11-12]。

2 結 果

2.1 PF-06463922與ROS1激酶相互作用模式和藥效團模型本研究將4UXL晶體結構進行解析可知PF-06463922與ROS1激酶之間形成的多種相互作用關系,其三維結構見圖2。PF-06463922下端的氨基基團與Glu2027形成了一組氫鍵相互作用,距離為1.97 ?;雜環與Met2029形成了兩組氫鍵,距離分別為1.97 ?、2.19 ?;遠端雜環上的N與Glu2030形成了一組氫鍵,距離為2.60 ?;上端甲基基團與Leu1951形成了一組氫鍵,距離為2.96 ?。以該結構中PF-06463922與ROS1激酶之間的相互作用模式,構建出1種藥效團模型,其結構如圖3所示。其中包含,合計4個藥效團模型特點。

圖2 PF-06463922與ROS1激酶相互作用結構 圖3 PF-06463922與ROS1激酶藥效團模型

2.2 基于虛擬篩選的結果共得到符合藥效團模型的化合物611 0340個,再以藥效團打分分數自高向低排序,選擇得分前100名的化合物。

2.3 分子對接方法評估與對接結果選用重現4UXL復合物中配體受體結合作用模式最優的CDOCKER的對接方法,將表1中的化合物逐一與4UXL受體蛋白進行對接。對接結果發現:75號化合物在打分函數最高的前10個構象之中占了8個,得分最高構象見圖4。該化合物上端雜環與Arg2083、Asn2084、Asp2102形成了五組氫鍵,距離分別為2.66 ?、2.91 ?、2.29 ?、2.53 ?、2.77 ?;近端的O與Lys1980形成了一組氫鍵,距離為2.43 ?;下端與Gly2101形成了一組氫鍵,距離為2.59 ?;上端的O與Gly2032、Asp2033號形成兩組氫鍵,距離分別是2.88 ?、2.94 ?;上端雜環與Asp2102形成了一組鹽橋,距離為2.05 ?。

圖4 化合物ZINC000065025270與ROS1激酶相互作用結構 圖5 分子動力學溫度能量圖

2.4 分子動力學模擬結果在500 ps的全過程過程中,75號化合物與4UXL蛋白結合態的整體能量在-80,156.10～-81,259.50 kcal/mol間波動,體系溫度在294.623～305.527 K間波動,模擬過程中溫度、體系能量波動見圖5?？砂l現含297個氨基酸受體蛋白與75號化合物結合能量波動較小,說明該模擬所確定的初始狀態相對穩定。受體蛋白的各氨基酸殘基均方根漲落(RMSF)值見圖6。RMSF值較小,說明結合作用是穩定的,動力學模擬的500 ps期間,活性袋中化合物75呈現穩定狀態,各幀構象中化合物75母核結構與受體蛋白之間結合作用模式穩定,整體RMSD在5 ?以內,可見化合物75與4UXL之間的結合作用模式是穩定可靠的(圖7)。

圖6 受體蛋白各氨基酸殘基均方根漲落(RMSF)圖 圖7 受體蛋白均方根偏差(RMSD)圖

3 討 論

肺癌是常見致病、致命癌癥之一,在我國非小細胞肺癌在肺癌中最為常見,約占發病的80%～85%[13],近年來,非小細胞肺癌主要以靶向藥物吉非替尼為主要治療手段,但該類藥物的靶基因主要針對的是EGFR和ALK,一旦產生了耐藥性或基因發生了突變,靶向藥物的治療效果也將大打折扣,因此亟待找到一種可能代替吉非替尼的新型藥物, ROS1相對于EGFR和ALK的陽性率較低,但它可為肺癌患者的靶向治療提供新的靶點,且迅速成為研究熱點[14]。

課題組通過實驗得到的75號化合物可能是潛在的ROS1抑制劑,但受限于實驗環境,目前僅進行了分子模擬的實驗,亟需進一步的生物活性實驗驗證。如可對ROS1進行定點氨基酸突變:對4UXL蛋白進行定點突變,對Lys1980、Gly2032、Asp2033、Arg2083、Asn2084、Gly2101、Asp2102等氨基酸進行定點突變,觀測突變前后75號化合物與受體蛋白之間的親和力變化,通過復合物晶體結構的電泳實驗進行衡量:如結合較好,則復合物較重,反之則較輕。

雖然75號化合物在對接結果、分子動力學模擬等方面都展現出了其在抑制ROS1活性方面可能具有一定的效果,但這種結果僅僅是基于計算機模擬的結果,到底是否具有藥理活性,還需要進行包括動物實驗在內的大量后續研究來進行驗證,新型抗癌藥物的研發需要長期不懈的研究,往往花費巨大,耗時漫長,本研究最大的意義在于嘗試利用計算機的輔助篩選技術來尋找新藥,從而達到降低研究時間和成本,提高新藥發現的概率的目的。特別需要指出的是,本研究的結果不是盲目的,是基于藥效團模型的理性設計,尤其是隨著學術界對ROS1的蛋白質晶體結構的深入廣泛研究,在一定程度上為我們發現并精準篩選的ROS1抑制劑化合物方面提供了保證。

化合物75的分子量約為473.26,具有良好的成藥性,但其結構之中具有季銨鹽的結構特征,極性較大易溶于水,且其結構之中包含兩個容易水解的結構,化合物在體液內的穩定性還有待進一步的研究和確認。接下來的活性驗證可著重對其穩定性進行理性設計和改造。

對于ROS1抑制劑的研究,本課題組在現有基礎上,下一步將對得到的75號化合物開展更加深入的理論研究,如:如分子軌道能量、關鍵氨基酸殘基的能量差異以及作用力特征等信息,從而對新藥研發提供更多的理論支撐,盡早開展動物活性實驗也是必不可少的工作。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究不涉及倫理批準及知情同意。