circ_0000515靶向miR-924調控卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移及侵襲的機制研究

張瑛琦

（佳木斯市婦幼保健院，黑龍江 佳木斯 154003）

卵巢癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，由于早期臨床癥狀較為隱匿，70%患者確診時已處于晚期，中晚期卵巢癌5年生存率大于為40%，但大多數患者預后差且總體生存率低，為尋找早期診斷的潛在生物學標志物或治療靶點，探究卵巢癌發展的機制是必須的[1-2]。作為一個由3’端與5’端連接形成的閉合環狀RNA，環狀RNA（circular RNA，circRNA）可以參與卵巢癌進展通過靶向微小RNA（miRNA）[3-4]。circ_0000515參與調控腫瘤發生過程。如，其在肝癌組織和細胞中高表達，它的高表達可預示淋巴轉移的高發，并且體外研究指出其低表達能抑制肝癌細胞增殖和遷移，體內研究表明其能加重肝癌惡性進展[5]。生物信息學分析預測miR-924是circ_0000515的候選靶基因之一。證據已指出增加這個miRNA含量能夠減弱肺癌細胞生長和運動能力[6]，提示miR-924介導腫瘤細胞特性。本研究運用SKOV3細胞分析circ_0000515是否通過靶向miR-924介導卵巢癌惡性表型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取2020年3月—7月于佳木斯市婦幼保健院經病理學確診的43例卵巢癌患者腫瘤和癌旁組織標本，并及時儲存在-80℃，病人或其近親屬知情同意。

SKOV3細胞、青霉素（100 μg·mL-1），鏈霉素（100 μg·mL-1）購自上海奧陸生物；E-cadherin、N-cadherin抗體購自美國Santa Cruz；DMEM培養液購自上海碧云天生物；熒光定量PCR試劑盒、胎牛血清、熒光素酶檢測盒、胰蛋白酶、Transwell小室購自北京索萊寶；Trizol與Lipofectamine? 3000購自美國Invitrogen；Matrigel基質膠購自北京索萊寶科技；GAPDH抗體與 IgG二抗購自美國CST；反轉錄試劑購自北京天根生化；CCK-8試劑購自上海酶研生物。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 SKOV3細胞按照說明書培養在5% CO2培養箱內，用顯微鏡觀察細胞生長密度，待其匯合度達到95%左右時，用胰酶消化（用顯微鏡觀察細胞狀態）并鋪在6孔板（1×104個/孔），鋪板后大約16 h（此時細胞密度應當在75%～90%左右）采用脂質體轉染法（轉染siRNAs或miRNA模擬物及抑制劑時不加P3000TM試劑）將si-NC、si-circ_0000515、miR-NC、miR-924 mimics制備成RNA-脂質體復合物，并加入到6孔板中，在培養板上標記si-NC組、si-circ_0000515組、miR-NC組、miR-924組。用減血清培養基稀釋Lipofectamine?3 000，隨后將si-circ_0000515分別與anti-miR-NC或anti-miR-924進行共轉染（密度應當在75%～90%左右），在培養板上標記si-circ_0000515+antimiR-NC組、si-circ_0000515+anti-miR-924組。

1.2.2 qRT-PCR 取80 mg卵巢癌組織和80 mg癌旁組織和1 mL Trizol試劑混合均勻、取1×106細胞樣品和0.4 mL Trizol試劑混合均勻。將各樣品在常溫下裂解15 min完全解離核蛋白復合體。用紫外分光光度計測RNA濃度。取適量RNA樣品根據FastKing RT Kit說明準備反轉錄體系以合成cDNA（加樣過程應在冰上操作，防止RNA降解）。以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增以定量circ_0000515、miR-924表達。

1.2.3 CCK-8實驗 將si-circ_0000515組、miR-924組、si-circ_0000515+anti-miR-924組以及對照組細胞收集并接種于96孔板，隨后添加CCK-8溶液，根據說明書要求在37℃、5% CO2培養箱中培養2 h。最后，各孔樣品經酶標儀評估。

1.2.4 平板克隆形成實驗 在6孔板中，收集的sicirc_0000515組、miR-924、si-circ_0000515+antimiR-924組以及對照組細胞培養2周后，進行固定和結晶紫染色。最后，克隆形成數經顯微鏡分析。

1.2.5 劃痕實驗 在6孔板中，收集的sicirc_0000515組、miR-924、si-circ_0000515+antimiR-924組以及對照組細胞培養至細胞密度達到95%。隨后，細胞單層經移液槍槍頭劃線，繼續培養24 h。最后，遷移距離被分析使用顯微鏡。

1.2.6 Transwell實驗 將si-circ_0000515組、miR-924、si-circ_0000515+anti-miR-924組以及對照組細胞收集并接種于小室的上室，培養48 h，下室加含20%胎牛血清的DMEM，多聚甲醛固定、結晶紫染色后，在顯微鏡下分析細胞侵襲能力。小室的上室加有Matrigel基質膠。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 SKOV3細胞鋪板后大約16 h（此時細胞密度應當在75%～90%左右），將WT-circ_0000515和MUT-circ_0000515采用脂質體轉染法（轉染miRNA模擬物不加P3000TM試劑）與miR-NC或miR-924 mimics共轉染至細胞，48 h后收集并裂解以上轉染細胞，根據熒光素酶檢測盒說明將LAR I加到光度計管中，對光度計進行編程以分析酶活性。

1.2.8 Western blot 將各組SKOV3細胞用溫的PBS沖洗3遍，加入RIPA裂解液，將細胞收集到EP管中，離心取上清，于沸水中孵育10 min，蛋白變性。將所有蛋白樣品調至等濃度后，取40 μg蛋白進行SDS-PAGE（上樣前將膠板下的氣泡趕走），蛋白泳動至距膠下緣1 cm左右結束。將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，將膜從電轉槽中取出并稍加漂洗，牛血清白蛋白封閉PVDF膜（浸沒于封閉液中搖蕩1 h），加入E-cadherin、N-cadherin和GAPDH一抗，TBST洗滌，暗室內曝光顯影。

1.3 統計學方法

這項研究的數據經SPSS 21.0統計學軟件分析，以均數±標準差（±s）表示。2組間和多組間分別做獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 circ_0000515、miR-924在癌旁組織和卵巢癌組織中的表達

見表1。

表1 circ_0000515和miR-924的表達（±s ，n= 43）

表1 circ_0000515和miR-924的表達（±s ，n= 43）

注：與癌旁組織比較，# P＜0.05

組織circ_0000515miR-924癌旁組織1.00±0.141.00±0.09卵巢癌組織4.77±0.32#0.33±0.04#

2.2 circ_0000515對SKOV3細胞增殖的影響

見表2。

表2 circ_0000515對SKOV3細胞增殖的影響（±s ，n= 9）

表2 circ_0000515對SKOV3細胞增殖的影響（±s ，n= 9）

注：與si-NC組比較，# P＜0.05

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2.3 下調circ_0000515表達對SKOV3細胞遷移、侵襲的影響

見圖1、表3。

圖1 下調circ_0000515表達對卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表3 下調circ_0000515表達對卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

表3 下調circ_0000515表達對卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

注：與si-NC組比較，# P＜0.05

組別劃痕愈合率/%侵襲細胞數/個E-cadherin蛋白N-cadherin蛋白si-NC組64.11±5.66116.93±11.050.17±0.020.68±0.05 si-circ_0000515組24.23±2.21# 50.91±4.96#0.57±0.04#0.24±0.03#

2.4 circ_0000515靶向miR-924

circ_0000515含有miR-924互補序列，見圖2。熒光素酶活性值，見表4。circ_0000515調控miR-924的表達，見表5。

表4 熒光素酶活性值（±s，n= 9）

表4 熒光素酶活性值（±s，n= 9）

注：與miR-NC組比較，# P＜0.05

組別WT-circ_0000515MUT-circ_0000515 miR-NC組0.96±0.060.99±0.07 miR-924組0.34±0.03#0.97±0.04

表5 circ_0000515調控miR-924的表達（±s ，n= 9）

表5 circ_0000515調控miR-924的表達（±s ，n= 9）

注：與pcDNA組比較，# P＜0.05；與si-NC組比較，△P＜0.05

組別miR-924 pcDNA組1.00±0.00 pcDNA-circ_0000515組0.45±0.05#si-NC組1.02±0.07 si-circ_0000515組3.09±0.30△

2.5 miR-924對SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響

見圖3、表6。

圖3 miR-924對SKOV3細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表6 miR-924對SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

表6 miR-924對SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響（±s ，n= 9）

注：與miR-NC組比較，# P＜0.05；與si-circ_0000515+anti-miR-NC組比較，△P＜0.05

N-cadherin蛋白miR-NC組1.00±0.000.86±0.0689.21±7.9367.08±5.08118.73±12.420.15±0.020.69±0.05 miR-924組3.28±0.31#0.44±0.05#52.37±5.10#32.58±3.17# 57.38±5.18#0.49±0.04#0.31±0.03#si-circ_0000515+anti-miR-NC組1.00±0.000.36±0.0339.29±3.6622.86±2.53 48.72±4.060.58±0.040.23±0.02 si-circ_0000515+anti-miR-924組0.41±0.04△0.73±0.06△79.22±6.43△55.34±4.67△ 99.45±7.35△0.28±0.03△0.59±0.04△組別miR-924OD值（450 nm）細胞克隆形成數/個劃痕愈合率/%侵襲細胞數/個E-cadherin蛋白

3 討論

circRNA不易被核酸外切酶降解，且具有序列保守性、表達穩定性等特點，表明circRNA可能作為疾病診斷標志物或治療靶點，circRNA主要是由外顯子組成，其可在卵巢癌發生及發展過程中發揮重要調控作用[7-8]。先前的研究已近證實了大多數的circRNAs可以調控卵巢癌細胞進展通過靶向miRNA/mRNA軸[9-10]。

circ_0000515在宮頸癌組織和細胞中高表達，circ_0000515沉默限制宮頸癌細胞侵襲，增加細胞凋亡率[11]。circ_0000515是一種新型環狀RNA，其在乳腺癌組織中上調表達，沉默circ_0000515可減弱乳腺癌細胞的增殖和侵襲[12]。然而circ_0000515對卵巢癌細胞生物學行為的影響尚未可知。此工作證實circ_0000515在卵巢癌組織中低表達，circ_0000515沉默抑制卵巢癌細胞增殖。N-cadherin在卵巢癌中表達上調，而E-cadherin表達下調，進而促進上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）最終促使細胞轉移[13-14]。本研究證實circ_0000515沉默減少N-cadherin蛋白水平，增加E-cadherin表達。此外卵巢癌細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數在circ_0000515敲低后被抑制。本研究進一步證實circ_0000515與miR-924存在靶向調控關系。研究表明，miR-924抑制肝細胞癌細胞遷移及侵襲[15]、抑制胃癌和肝癌細胞的增殖[16-17]。此工作證實了miR-924可以削弱卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲。而且circ_0000515對卵巢癌細胞生長及運動的促進作用涉及其對miR-924靶向調節。

綜上所述，circ_0000515/miR-924分子軸在卵巢癌細胞生長及轉移過程中可發揮重要調控作用。但仍需進行體內實驗驗證circ_0000515/miR-924分子軸對卵巢癌移植瘤生長的影響。