采煤沉陷區復墾對土壤細菌群落組裝及固碳功能的影響-以東灘礦區為例

陳 浮 ，宋曉君 ，董文雪 ，朱燕峰 ，尤云楠 ，馬 靜,

（1.河海大學 公共管理學院, 江蘇 南京 211000；2.中國礦業大學 化工學院, 江蘇 徐州 221000；3.中國礦業大學 礦山生態修復教育部工程研究中心, 江蘇 徐州 221116）

0 引 言

東部平原煤礦區井工開采對地表生態系統破壞極為嚴重，地表沉陷積水，土壤潴育化，陸生植被淹死，不利于生態系統功能維持和生物多樣性保護[1-2]?；謴屯寥拦δ苁菛|部平原礦區復墾的核心任務，并最終形成健康、肥沃的土壤生產力，維持農田生態系統的可持續發展[3-4]。然而，復墾土壤功能系統發育和恢復是一個漫長的過程，它取決于恢復微生物群落內不同組分間功能關聯所需的時間[5]。微生物是生態系統分布最廣、又最活躍的組分，驅動地球生物化學循環、能量代謝和土壤-植物相互作用等過程，是生態系統重要過程的調解者和催化劑[6-7]。因此，厘清復墾土壤微生物群落系統發育對認識礦山生態修復中微生物功能和作用至關重要[8]。

近年來，國內外學者非常重視采礦擾動和土地復墾下土壤生態系統演化[9]，微生物群落組成與結構、功能差異和響應模式等一直備受關注[10]。這些研究多集中于不同復墾年份、不同植被類型和復墾技術下土壤微生物群落結構、物種和功能多樣性變化及其影響因素的考察。例如，采礦污染導致固碳和硫酸鹽還原相關的功能基因豐度降低，而反硝化相關的功能基因豐度得到提升[11-12]。此外，微生物相互作用（如共生或競爭）可能會改變微生物群落結構以適應這些不利的環境，同時這些變化可直接影響群落穩定性[13]。解開礦區微生物群落組裝過程對于理解微生物如何應對和適應采礦環境的演替至關重要。微生物的組裝過程，即確定性過程（環境選擇）和隨機過程（如擴散和漂移）已被用于闡明各種生態系統中的微生物群落組裝，如農業土壤，河水和水庫沉積物[14-15]。隨機漂移和擴散過程被發現是未受干擾的森林土壤中微生物群落組裝的關鍵驅動因素。在重金屬污染的農業生態系統中，確定性過程主導著微生物群落的組裝，且其影響隨著重金屬濃度的增加而增加[16]。然而，礦區復墾影響細菌群落組裝及機制方面仍存在認知缺口，且群落組裝過程如何重塑細菌群落的結構分布和功能尚未研究清楚，不利于充分理解功能性微生物的生態組合及其對礦區生態修復的貢獻。東部采煤沉陷區土地復墾方向主要為恢復耕作，但復墾土壤結構差、肥力相對低下，且先前研究集中于監測復墾土壤理化動態和微生物群落結構與組成，對微生物群落組裝及固碳功能極少關注。因此，探明東部平原礦區復墾土壤微生物群落組裝機制及其生態響應對于采礦生態系統的管理和恢復至關重要。

那么，東部平原礦區復墾及時長究竟如何影響微生物群落結構變化？復墾土壤微生物群落組裝到底受確定性過程控制，還是隨機性過程主導?復墾如何影響土壤碳固持？為此，選擇山東省鄒城市東灘煤礦沉陷復墾區為研究對象，采集9 a、12 a、15 a 和18 a 4 個復墾年限和1 個對照樣共65 個土樣，利用高通量測序和零模型分析方法，探索復墾及時長對土壤微生物群落結構、構建機制及固碳基因豐度的影響，為東部平原礦區沉陷復墾土壤發育和生態恢復提供新見解。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

東灘煤礦沉陷復墾區位于山東省鄒城市（35°25'52''N、116°52'39''E），屬于暖溫帶季風氣候區，年降水量752.9 mm，年均氣溫14.1 ℃。該區為典型的山前沖積平原，土壤類型為黃潮亞土，砂粒（＞0.02 mm）、粉 粒（0.002～0.02 mm）和 黏 粒（＜0.002 mm）分別占22.3%、65.9%和11.8%。2002—2011 年，分4 次采用表土剝離、煤矸石充填（200～400 cm），再覆蓋表土（60～80 cm）和機械壓實，每次客土來源一致。復墾后土地由礦山企業的農業開發公司統一種植小麥-大豆，一年兩熟。小麥單季施底肥600 kg/hm2（常規復合肥），撥節時施氮肥150 kg/hm2，機械收割時一般留茬高15～20 cm。大豆單季施底肥450 kg/hm2（常規復合肥），機械收割時自動粉碎還田。除復墾時間不同外，研究區地形、氣候、水文、土壤母質、種植模式和田間管理等完全一致，構成一個完善的“空間換時間”復墾序列。

1.2 樣品采集與測試

2020 年8 月22 日，采用隨機五點采樣法從復墾9 a、12 a、15 a 和18 a 樣地分別采集13 個表土（0～20 cm）混合樣，分別記為R9、R12、R15 和R18。并選取附近未受采礦影響、由農業開發公司統一種植農田隨機收集13 個表土樣作為對照（CK），共采集土樣65 個（圖1）。樣品采集后現場剔除根系、殘體和礫石等，充分混勻后分為2 份。一份通過風干、研磨后過2 mm 篩，用于測定土壤理化性質和部分土壤酶活性；另一份鮮土樣無菌密封儲存于-20 ℃冰箱中，用于微生物相關信息測定。土壤pH 是通過測定25 mL 水摻1 g 土的水懸液獲得。易氧化有機碳（EOOC）通過高錳酸鉀氧化法測定。有機碳（SOC）采用重鉻酸鉀氧化法和硫酸鐵銨滴定法測定。用碳酸氫銨萃取后用鉬銻鈧比色法測定土壤有效磷（AP）。通過凱爾文蒸餾滴定法測定土壤全氮（TN），用氯化鈣浸提后用分光光度法測定硝態氮（AN）。過氧化氫酶（CAT）酶活采用高錳酸鉀滴定法測定，堿性磷酸酶（PO）采用磷酸苯二鈉比色法測定，多酚氧化酶（PPO）酶活采用鄰苯三酚比色法測定，β-葡萄糖苷酶（BG）酶活采用硝基酚比色法測定，脲酶（UE）酶活采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定，亮氨酸氨基肽酶（LAP）酶活采用S-LAP 試劑盒測定，脫氫酶（DH）酶活采用氯化三苯基四氮唑法測定，蛋白酶（PRO）酶活采用加勒斯江法測定，FDA 水解酶（FDA）酶活通過熒光素比色法測定[17-18]。

圖1 研究區位置和采樣區分布Fig.1 Location of study area and sampling area distribution

1.3 微生物信息測定

根據E.Z.N.A.?soil 試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行土壤總DNA 提取，使用微量紫外分光光度計NanoDrop one 測定所得DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量。利用細菌通用引物515F（5′-GTGCCAGCCGGTAA-3′）和907R（CCGTCAATTCMTTRAGTT）對細菌16S rRNA 的V4 和V5 區進行PCR 擴增，擴增產物等物質的量比混勻后，利用NEBNext? UltraTM II DNA Library Prep Kit 制備測序文庫。構建好的文庫經Qubit 和Q-PCR 定量確認文庫合格后，使 用Illumina Nova 6000 平 臺 對 擴 增 子 文 庫 進 行PE250 測序。

土壤碳循環功能基因豐度采用QMEC（Quantitative Microbial Element Cycling）基因芯片進行定量化測定。具體方法如下：按照MagaBio 土壤DNA 提取試劑盒方法，取0.25 g 土壤樣品，提取土壤DNA，進行總量及純度檢測。檢測合格后分別將樣品板和引物板試劑添加至高通量qPCR 芯片SmartChip MyDesign Chip（ Takara Biomendical Technology，Clontech）微孔中，在SmartChip 實時PCR 系統中執行qPCR 反應及熒光信號檢測，自動生成擴增曲線和溶解曲線。使用Canco 軟件獲得各基因在樣本中的檢出情況和擴增循環數（Ct 值），并以16SrRNA 作為內參數據進行標準化獲得各基因相對定量信息。再根據Roche 檢測16SrRNA 基因相對定量信息，最終換算其他基因的絕對定量信息。

1.4 微生物群落構建機制分析

利用R studio 中的“picante”包計算平均最近物種距離（MNTD），β-平均最近物種距離（βMNTD）和β-最近物種指數（βNTI）等參數來評估樣品間系統發育。當βNTI 值大于2 或者小于-2，表示群落組裝過程為確定性過程（分別表示異質性選擇過程和同質性選擇過程）。相反，當|βNTI|值小于2，群落組裝則以隨機性過程為主。為進一步確定隨機性過程的分類，利用“vegan”包計算了基于群落的Bray-Curtis 矩陣的 Raup-Curtis 矩 陣（ Raup-Curtis matrix， 簡 稱RCbray）。RCbray 值 大 于+0.95、|RCbray|值 小 于0.95 和RCbray 值小于-0.95 分別代表擴散限制、漂移和同質性擴散[19]。

1.5 數據處理與統計分析

利用美格基因云平臺進行微生物信息分析。土壤理化性狀和酶活性采用SPSS 26.0 軟件（IBM，美國）進行ANOVA 分析，使用mantel test 檢驗評估物理化學因素對細菌群落結構的影響。采用R studio（MathSoft，美國）構建中性群落模型和隨機森林模型[20]，利用ggplot2 包進行柱形圖繪制。利用Amos 21.0 軟件擬合結構方程模型（Structural Equation Model，SEM）分析土壤理化性質、酶活性以及群落組裝生態過程和碳循環功能基因豐度的關系。其中，對土壤碳循環功能基因豐度進行歸一化處理[21]，劃分為碳降解、碳固定和甲烷代謝3 大功能類群，具體公式如下：

式中：xi為樣本單個基因豐度；x'為碳降解、碳固定和甲烷代謝微生物功能類群歸一化豐度；i、n分別為樣本數量和基因數量。

2 結果與分析

2.1 不同復墾年限下土壤理化性狀和酶活性變化特征

圖2 顯示了不同復墾年限下土壤理化性質和酶活性變化。復墾土壤偏弱堿性，pH 隨復墾時長先升后降，復墾處理與CK 呈極顯著差異（P＜0.001）。土壤有機碳、有效磷及硝態氮含量隨復墾年限表現為下降趨勢，且復墾土壤SOC 含量均低于CK。銨態氮與復墾時長呈正相關，R12 中AN 含量已略高于CK。復墾時長對CAT 影響顯著，與PO 一樣隨復墾時長持續增加，但復墾處理PO 活性仍顯著低于對照（P＜0.001）。PPO 活性先升后降，逐漸與CK 持平。復墾處理LAP 均高于CK，且與CK 呈極顯著差異（P＜0.001）。UE、BG 和PRO 活性與復墾時長呈負相關關系，但R18 中UE 活性仍極顯著高于CK（P＜0.001）。綜上，與CK 比，隨復墾年限增加，土壤酶活性總體呈上升趨勢（PO、DH、PRO 除外）；土壤有機碳、有效磷及硝態氮含量則呈下降趨勢。

圖2 不同復墾年限下土壤理化性狀和酶活性變化Fig.2 Changes of soil physicochemical properties and enzyme activities under different reclamation years

2.2 不同復墾年限下土壤細菌群落構建過程

根據零模型，|βNTI|＜2 被劃定為土壤微生物群落構建的隨機性過程。本研究中，不同復墾處理組|βNTI|＜2 的數據約占90%，故不同復墾時間土壤細菌群落構建以隨機性過程為主導（圖3）。為進一步探究群落組裝機制，根據RCbray 值細分顯示，隨機過程中擴散限制對群落組裝的貢獻最大，并隨復墾時長增加而擴大。NCM 模型中R2值越高擬合效果越好，越接近中性群落模型，即群落構建受隨機性過程的影響越大，受確定性過程的影響越小。本研究評估結果表明土壤細菌群落隨機過程的相對貢獻隨復墾時長增加先升后降，解釋方差均高于80.0%，反映OTU 頻率及其相對豐度之間關系擬合程度較好，說明復墾土壤細菌群落構建受隨機性過程影響大（圖4，圖中Xr,mean為平均相對豐度），這與零模型分析所得結果一致。

圖3 不同復墾年限下細菌群落βNTI 值和組裝過程Fig.3 βNTI and assembly process of bacterial community under different reclamation years

圖4 不同復墾年限下土壤細菌群落結構的中性群落模型Fig.4 Neutral community model of soil bacterial community structure under different reclamation years

2.3 不同復墾年限下土壤碳循環功能基因豐度變化

圖5 顯示（圖中Xa為基因的絕對豐度），不同復墾年限下淀粉、半纖維素、纖維素、幾丁質、果膠和木質素等6 類物質降解過程及相關基因有顯著差異（P＜0.05）。其中，與淀粉降解相關的基因apu、amyA和amyX在R18 中豐度最高，復墾處理組豐度遠高于CK（圖5a）。與半纖維素降解相關的基因abfA、xylA和manB及與纖維素降解相關的CDH（編碼纖維二糖脫氫酶基因）隨復墾時長增加呈上升趨勢（圖5a）。與幾丁質降解相關的chiA和與木質素降解相關的基因mnp、glx、pox和lig在R18 中豐度最高，遠高于CK（圖5a）?？傮w上R18 中碳降解相關功能基因豐度最高。碳固定相關的基因acsA、mct和rbcL豐度最高，acsB最低（圖5b）。參與卡爾文循環的rbcL基因豐度隨復墾時長呈增加趨勢，除R9 外，均高于CK。參與還原三羧酸循環的korA基因和參與還原乙酰輔酶A 途徑的acsA和acsB豐度在R18 中最高，約比CK 高一倍（圖5b）。甲烷代謝功能基因豐度（pqq-mdh、pmoA、mxaF和mmoX基因）不同處理組幾乎無顯著差異（圖5c）。

圖5 不同復墾年限下土壤碳循環功能基因豐度的變化Fig.5 Variations of abundances of soil carbon cycling functional genes under different reclamation years

2.4 土壤碳循環微生物功能基因豐度與環境因素的相關性分析

利用隨機森林模型評估了環境因子對碳循環功能基因豐度影響的重要性（圖6），發現土壤固碳功能基因與土壤理化性狀差異具有相關性。如圖6c 所示，土壤pH 與甲烷代謝功能基因豐度相關，但其與碳降解、碳固定功能基因豐度并無顯著相關性（圖6a和圖6b）。整體來看，BG、SOC、UE、TN、NN、CAT、AP、AN 與碳降解、碳固定和甲烷代謝功能基因具有相關性，且這些土壤理化性質和土壤酶活性可能是預測固碳功能的重要變量。

圖6 環境因子對碳循環功能基因的潛在貢獻Fig.6 Potential contribution of environmental factors to carbon cycle function genes

利用結構方程模型，建立土壤理化及酶活性、群落組裝生態過程與碳循環功能基因豐度之間潛在的直接和間接聯系，擬合分析理化性狀對碳循環功能基因豐度的貢獻。結果表明，復墾時長既可以直接影響SOC 含量和BG 酶活性，也可以通過不同生態過程對碳降解功能基因豐度產生間接影響（圖7a）。此外，復墾時長能夠影響土壤SOC 含量和BG、UE酶活性，進而間接影響碳固定過程功能基因豐度。同時，不同復墾年限通過影響SOC、BG 和UE 酶活性，再通過擴散限制、同質選擇和異質選擇間接影響碳固定相關功能基因豐度（圖7b）。復墾及時長直接影響土壤AP、SOC 含量和BG 酶活性，再通過同質選擇、擴散限制間接影響甲烷代謝相關功能基因豐度（圖7c）。綜上分析表明，復墾顯著改善了礦物土壤SOC 和BG 酶活性，從而調控確定性過程和隨機性過程占比，最終影響碳循環功能基因豐度。

圖7 復墾過程中不同路徑影響碳循環功能基因豐度的結構方程模型Fig.7 Structural equation models of rehabilitation affecting soil carbon cycle functional gene abundance through different ways

3 討 論

3.1 復墾對土壤理化性質和酶活性的影響

東部平原礦區土壤偏弱堿性，豐富的降水導致Ca2+和Mg2+向下淋溶淀積強烈。沉陷復墾將下層土壤翻至上層，導致復墾土壤pH 增加。但耕作利用后pH 會下降[22-23]。這可能是本研究中土壤pH 變化趨勢的主要原因。復墾土壤SOC（有機碳）不斷下降，一方面是復墾改善了土壤通氣，加速土壤碳釋放；另一方面是大量氮肥引入，加速有機碳分解[24]。研究表明，土壤酶活性影響土壤養分有效性[25-26]。脲酶與氮循環相關，本研究中脲酶活性下降，可能與耕作大量施用氮肥有關，降低了對含氮有機物水解的需求[27]。復墾土壤PO（堿性磷酸酶）和PRO（蛋白酶）顯著低于對照，表明重構土壤肥力遠達不到未受采礦影響的耕地，這與張振佳等[28]研究結論一致。煤矸石充填帶來大量金屬離子，易與土壤中磷反應，形成不可溶性磷酸鹽[27]。土壤PO 隨復墾時長持續增加，說明復墾土壤需要大量PO 將不溶性磷轉化為可溶性磷酸鹽，提高磷的生物利用率和滿足農作物生長[29]。土地復墾改善土壤理化和酶活性，養分供給、水分及物質循環[5]，這與于亞軍等[30]的研究結果一致。本研究中復墾土壤銨態氮、全氮、過氧化氫酶、亮氨酸氨基肽酶活性等持續增加，說明復墾后種植管理改善了土壤水肥狀況，并隨復墾時間持續積累，農田生態環境不斷改善。

3.2 復墾年限對細菌群落組裝過程的影響

了解微生物群落的組裝過程能夠識別微生物群落對復墾活動的響應[31]。確定性過程和隨機性過程共同作用于微生物群落的構建，但二者相對重要性的大小由各種環境因素介導[32]。如資源供應充足可以增加隨機性過程的重要性，大部分物種能夠較好的生長時，隨機性過程起主導作用。LAN 等[33]發現森林土壤細菌群落組裝主要以隨機性過程為主。隨著外界環境變得苛刻，確定性過程起主導作用。本研究發現東部平原礦區復墾土壤細菌群落組裝以隨機性過程為主（圖3 和圖4），說明東部平原礦區土壤細菌群落結構與功能受隨機選擇操控，反映東部平原礦區自然環境限制并不十分苛刻。但不同處理組隨機性組裝過程中擴散限制不同，說明隨復墾時長增加，微生物易利用資源不斷增加，營養脅迫和環境選擇壓力逐漸削弱，改善了土壤環境，從而驅動群落組裝過程中擴散限制增強[34]。此外，礦區土地復墾僅屬局部擾動，不同于溫度、降水等大尺度空間過程的影響，進一步證實了隨機性過程通常發生于局部環境變化的小尺度空間[10]。

3.3 復墾年限對細菌群落固碳功能的影響

微生物功能基因編碼參與物質循環的酶，能夠反映土壤養分循環活動的強度。在本研究中，與碳降解相關的功能基因均在R18 中豐度最高，表明復墾及復墾時長提高碳降解酶對易分解和難分解碳的分解潛力，包含淀粉、半纖維素和纖維素的降解。復墾土壤中大量外源碳被土壤碳降解酶分解，釋放出低分子的糖，為微生物生長代謝提供碳源和能量[35]。本研究發現除R9 外，復墾土壤rbcL基因豐度均高于CK，rbcL基因可作為分子標記用來反應微生物的固碳能力[36]，可見長期復墾活動可以有效提高土壤的碳固持能力。研究表明，復墾活動通過改善土壤理化性質、微生物群落多樣性等，進而影響土壤碳循環過程[37-39]。趙姣等[35]對黃土高原露采礦山排土場不同植被恢復下土壤碳循環功能基因研究，發現BG 和AN 含量是操縱碳循環相關功能基因豐度的主要因素。同樣地，本研究發現BG、SOC、NN、CAT、AP 和AN 是預測固碳功能基因的重要變量，表明復墾介導的土壤養分狀況密切影響土壤固碳微生物的活性和功能。結構方程模型結果進一步驗證，復墾及時長可直接影響土壤SOC 含量和BG 酶活性，或通過SOC 含量和BG 酶活性間接影響擴散限制和同質選擇過程，從而影響碳循環相關功能基因豐度。未來應持續監測復墾土壤SOC、BG 酶活性等參數，嘗試田間管理措施調節這些參數達到影響微生物群落組裝過程和提高固碳基因豐度的目的，促進復墾土壤的固碳潛力，提升礦區生態碳匯功能，同時為預測采礦干擾后土壤生態系統恢復提供了新的見解，對東部礦區生態復墾方案的提出和管理策略提供了理論依據。

4 結 論

1）東部平原礦區復墾對土壤理化性狀和酶活性影響顯著，復墾處理組土壤pH、銨態氮、過氧化氫酶及磷酸酶隨復墾時間增長呈顯著增加，有機碳、有效磷、硝態氮及脲酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶則顯著下降。

2）復墾改變土壤環境，從而影響細菌群落多樣性、結構和分布模式。隨機性過程主導了不同復墾年限土壤細菌群落的組裝過程，且擴散限制的貢獻最大。

3）有機碳、硝態氮、銨態氮、有效磷、β-葡萄糖苷酶及過氧化氫酶與復墾土壤固碳功能基因豐度之間相關性顯著，東部平原礦區復墾活動有效增強土壤碳固持能力。

4）復墾或直接影響土壤有機碳含量和β-葡萄糖苷酶活性，或通過有機碳含量、β-葡萄糖苷酶活性間接影響擴散限制和同質性選擇，進而影響碳降解、碳固定及甲烷代謝功能基因豐度。