小膠質細胞表型和功能研究進展

魏曉佟,郭 瑞,張啟春

(南京中醫藥大學 1.藥學院、2.醫學院·整合醫學學院,江蘇 南京 210023)

上世紀初,研究人員在中樞神經早期發育和特定病理條件下的大腦中發現小膠質細胞的存在[1-2]。在中樞神經的發育早期,小膠質細胞以“變形蟲樣”形態存在,隨著發育成熟,小膠質細胞逐漸轉化為“分支或靜息”形態。在一系列內源性和外源性因素刺激下,包括病原相關分子模式( pathogen-associated molecular pattern,PAMP)、損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP),小膠質細胞被激活,形態逐漸向變形蟲表型轉化,釋放多種因子,如炎性細胞因子、活性氧及酶,可導致神經元和膠質細胞損傷。事實上,在幾乎所有神經退行性疾病或障礙中,包括阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease ,AD)、帕金森病(Parkinson′s disease,PD)、亨廷頓舞蹈病和肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、額顳癡呆(frontotemporal dementia,FTD)以及多發性硬化癥(multiple sclerosis,MS)等炎癥性病變中,都存在大量激活的小膠質細胞,該現象也出現在腦血管性疾病和精神系統疾病中。小膠質細胞的激活正逐漸成為腦損傷和病理學的標志,被視為“病理傳感器”。因此,小膠質細胞在各種神經損傷病理條件下的作用一直是廣泛研究的焦點。隨著新技術的發展,在經典的致炎和抗炎表型的基礎上,科學家發現了更多的與特定腦區、病理條件和微環境相關的具有特異性標志物和專屬功能的小膠質細胞表型,進一步豐富了小膠質細胞的譜系結構。

1 小膠質細胞的傳統表型

在正常生理狀態下,小膠質細胞一般處于靜息狀態(M0), 呈現胞體較小、突起較長的分枝狀形態。它們不斷地伸展和收縮其突起以監測中樞神經系統組織。小膠質細胞對外界刺激十分敏感,在大腦損傷條件下小膠質細胞即可被激活。激活后的小膠質細胞形態由靜止的分枝狀變成活化的阿米巴狀,發揮損傷后突觸修剪、吞噬凋亡和受損傷的細胞、炎癥反應以及組織修復等功能。小膠質細胞激活后對中樞神經系統損傷具有雙重作用,長期以來研究人員在小膠質細胞的研究中使用巨噬細胞的極化術語,將小膠質細胞分為M1和M2表型。M1型小膠質細胞具有強大的吞噬作用,主要分泌促炎因子,發揮促炎功能,引起細胞凋亡及繼發損傷,過度活化的M1型小膠質細胞具有明顯的神經毒性作用。M1小膠質細胞標志物包括CD86、CD16、CD32、MHC-Ⅱ、iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL-3、CCL-5。M2型小膠質細胞又分為M2a、M2b、M2c 3種亞型,可分泌抗炎細胞因子,在血管生成、促進炎癥修復方面起重要作用。M2小膠質細胞標志物有Arg-1、Fizz-1、IL-10、YM1/2和CD206、TREM2、TGF-β、CCL22[3-7]。M1/M2的定義源自于將分離的細胞暴露于體外純化的刺激物(凋亡細胞、脂多糖、炎性細胞因子或聚集蛋白等),在這個范例中,小膠質細胞確實分泌極化巨噬細胞的典型因子,但根據最近研究的發現,M1和M2狀態在體內不能作為孤立的現象出現。近年來單細胞組學、時空組學、高精度分子成像技術的應用大大拓寬了科研人員的視野,使得人們能夠深入了解組織中細胞構成的多樣性和基因表達狀態。這些新技術的應用揭示了小膠質細胞的不同狀態。

2 新發現的特定小膠質細胞亞型

小膠質細胞是中樞神經系統的常駐免疫細胞,它的亞型是由微環境以時間和區域依賴的方式不斷塑造的[8-9],并不構成定型的細胞群;它們的形態、分子結構甚至超微結構在不同的細胞亞型中都有很大的不同。實際上小膠質細胞在中樞神經系統發育、應激和疾病的不同階段分化為多種表型[10]。已經發現了許多小膠質細胞亞型,如CD11c+小膠質細胞、暗小膠質細胞(dark microglia,DM)、疾病相關小膠質細胞(disease-associated microglia,DAM)、白質相關小膠質細胞(white matter-associated microglia,WAMs)等。

2.1 CD11c+小膠質細胞大腦中存在出生前吞噬凋亡神經元形成的CD11c+的小膠質細胞亞群,是一個穩定的亞群。小膠質細胞在吞噬凋亡細胞時會促使其由CD11c-轉變成CD11c+,小膠質細胞受體與凋亡神經元之間的作用增強。CD11c+小膠質細胞在胚胎晚期出現,然后在年輕成鼠中下降到幾乎無法檢測到的水平。然而,CD11c+小膠質細胞在年齡較大(6～9月齡)的小鼠中又重新出現。這表明CD11c+小膠質細胞不是一種簡單的、短暫的激活型小膠質細胞表型,而是一類穩定的小膠質細胞。小膠質細胞CD11c+的穩定表達需要骨橋蛋白(osteopontin,OPN)的共表達[11]。OPN是一種分泌性細胞外基質糖蛋白,在正常腦組織的神經元和小膠質細胞中表達較低,但在許多神經系統疾病中過度表達(如AD、ALS、PD等)[12-13]。CD11c+小膠質細胞是中樞神經系統中唯一可以產生OPN的小膠質細胞。OPN對CD11+亞群的穩定性以及吞噬和促炎癥反應的執行是必需的,OPN促進CD11c+小膠質細胞對突觸的吞噬及增殖能力[14]。CD11c+OPN+亞群在穩定狀態下表現出穩定的表型,并表達獨立于小膠質細胞激活的核心遺傳程序。產生OPN的CD11c+小膠質細胞定義為一個功能亞群而非瞬時激活表型,可以深入了解小膠質細胞分化對大腦發育的貢獻。

將產生OPN的CD11c+小膠質細胞定義為功能性小膠質細胞亞群,有助于深入了解健康和疾病中的小膠質細胞分化,而CD11c+OPN+小膠質細胞在腦內的空間分布、與神經退行性疾病間的關系還有待進一步研究。

2.2 DM利用高空間分辨率電鏡,發現大腦中存在另一種類型的小膠質細胞。與正常的小膠質細胞相比,這一類型細胞的超微結構具有一些獨特的特征。這些細胞總是表現出氧化應激的跡象,呈現濃縮的電子密集的細胞質和核質,伴有細胞質收縮、高爾基體和內質網擴張,以及線粒體改變。電鏡下,這一類型的小膠質細胞幾乎與線粒體一樣暗,被命名為DM[15]。

DM很少在健康個體中被發現,它與衰老、慢性應激和AD等退行性過程有關。這種表型在正常穩態條件下很少出現,但在慢性應激、衰老、分形信號缺乏(Cx3cr1敲除小鼠)和AD病理學(APP-PS1小鼠)期間增多。最近在大鼠和人類中也發現了DM[16-18]。免疫染色結果顯示DM表達4D4、CD11b和TREM2,而不表達Cx3cr1、Iba1和P2RY12。DM具有較高的吞噬活性,廣泛吞噬樹突棘、軸突終末和整個突觸。目前DM只能通過電鏡來識別,對它們的研究重要的是尋找能夠精確識別DM的選擇性標志物。

2.3 促血管生成修復相關小膠質細胞在腦血管損傷后重塑過程中,一個獨特的小膠質細胞亞群促血管生成,將CD45lo、Cx3cr1+、P2RY12+、CD24+定義為修復相關小膠質細胞(repair-associated microglia,RAM)。借助活體顯微鏡,在Cx3cr1GFP/+小鼠中觀察到小膠質細胞在腦血管損傷后立即向損傷血管投射突起,形成“玫瑰花結”樣完全包裹住血管的管狀結構。小膠質細胞包住受損或凝結的血管,使纖維蛋白局限于小灶簇而不是分布在整個損傷的腦實質,限制了滲漏到實質的程度,從而提供了腦血管損傷后的第一線保護。研究表明[19],小膠質細胞花環結構形成和抑制血腦屏障泄漏是星形膠質細胞ATP釋放和隨后的P2RY12信號傳導調控的(Fig 1a)。抑制P2RY12受體或CX43半通道可使小膠質細胞花環結構減少。

RAM在腦血管損傷過程中,通過形成“玫瑰花環”結構限制損傷程度,又發揮著促進血管生成作用。在急性出血性血管損傷的情況下,小膠質細胞的這些作用,超過了其吞噬狀態或釋放促炎分子的能力所產生的負面作用。

2.4 DAM在5XFAD(AD轉基因小鼠)模型分析鑒別出一種與AD相關的小膠質細胞稱為DAM。首先從5XFAD小鼠的大腦中篩選了所有(CD45+)免疫細胞,然后進行單細胞RNA測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)分析。對6只野生型和AD模型小鼠的8 016個單細胞進行了分類,創建了10個轉錄差異最大的亞群的詳細譜系。分析確定兩個小群體的細胞,即集群Ⅱ和Ⅲ,代表AD中觀察到的獨特小膠質細胞狀態,將這種狀態定義為DAM。DAM位于不可溶性淀粉樣蛋白β斑塊(amyloid β plaques,Aβ)附近,在中樞神經系統的其他區域不存在。但DAM不僅存在于AD中,在髓鞘碎片堆積的情況下,也存在于脫髓鞘和ALS,多發性硬化癥,中風等其他神經退行性疾病中。

DAM的形成通過TREM2依賴和TREM2非依賴路徑進行。小膠質細胞在接收到AD病理學、衰老和ALS病理學相關信號后,會導致TREM2獨立的DAM中間狀態(階段1),階段1主要涉及體內平衡小膠質細胞檢查點基因(Cx3cr1和P2ry12/P2ry13)表達的減少和B2m等基因的上調。這種中間DAM階段可被TREM2依賴的二級激活信號進一步激活(階段2),階段2涉及吞噬細胞和脂質代謝基因的上調(Fig 1b)。但是,在沒有TREM2獨立階段的情況下,沒有觀察到具有TREM2依賴階段的細胞,這表明DAM激活是一種機械耦合的時間事件,必須首先在TREM2獨立途徑中啟動,然后激活TREM2依賴程序。DAM的基因表達發生顯著變化,脂質代謝途徑和吞噬相關基因升高[20](Tab 1),對應于AD中斑塊清除的需要,DAM是保存在小鼠和人類中的AD相關吞噬細胞。DAM積極參與淀粉樣斑塊的分解和消化,在AD中起積極作用,是一種新的保護性小膠質細胞亞型。

Fig 1 New subtypes of microglia

2.5 斑塊相關小膠質細胞(plaque-associated microglia,PAM)另一種與AD相關的小膠質細胞稱為PAM。在AD大腦中,PAM聚集在Aβ斑塊周圍,在健康的大腦中,小膠質細胞和巨噬細胞很容易區分。在神經炎癥期間,如在AD中,活化的小膠質細胞和外周巨噬細胞改變了它們各自的形態和標記表達模式,混淆了它們的區別。CD11a在包括巨噬細胞在內的外周免疫細胞上高度表達,但在小鼠小膠質細胞上不表達。CD11a可用作區分小鼠小膠質細胞和浸潤性外周免疫細胞的標志物。利用CD11a陰性標志物,表明AD轉基因小鼠大腦中的PAM細胞完全由小膠質細胞組成[21]。Aβ斑塊吸引小膠質細胞遷移到附近,斑塊周圍的小膠質細胞形成功能和形態學改變的獨特小膠質細胞群。PAM在其基因表達中表現出進行性變化(Tab 1)。小膠質細胞從“穩態”狀態轉化為“DAM”或“小膠質神經變性”表型[22-23]。

Tab 1 New subtypes of microglia

AD大腦中, PAM與DAM同樣聚集在Aβ斑塊周圍,但PAM與DAM不同,PAM具有更高的轉錄性,流動性和吞噬活性低,不能通過吞噬作用有效清除Aβ,所以對此類小膠質細胞功能進行調節可能是治療AD的突破。

2.6 白質相關小膠質細胞年齡是最常見的神經退行性疾病的主要風險因素,衰老會導致灰質和白質變性?；虮磉_研究表明,衰老的小膠質細胞在白質中發展出更具炎癥的表型。利用飛行時間質譜(time of flight mass spectrometer,CyTOF)分析不同腦區的小膠質細胞表型,比較了灰質和白質之間不同小膠質細胞免疫標志物的表達,此方法在蛋白質水平上證實了scRNA-seq檢測到的人白質和灰質小膠質細胞的區別,白質小膠質細胞表達的HLA-DR、CD68、ApoE和EMR1水平高于灰質小膠質細胞[24]。利用單細胞RNA測序和UMAP分析將老化的白質與老化的灰質小膠質細胞分離。白質小膠質細胞特異性簇由特定基因特征定義。利用白質小膠質細胞基因特征,區分了兩個白質特異性簇,稱之為WAMs和激活的小膠質細胞。WAMs的特征是體內平衡基因的下調,和檢查點基因以及DAM相關基因的上調(Tab 1)。激活的小膠質細胞以編碼許多代謝基因的上調為標志,主要是核糖體亞基和線粒體基因,其中許多是小膠質細胞對衰老反應的一部分。將激活的小膠質細胞與WAMs進行比較, WAMs中最豐富的途徑是缺氧誘導因子信號、溶酶體和膽固醇途徑[25]。WAMs標記基因隨著白質老化而增加,在白質內,小膠質細胞多聚集在含有髓鞘碎片的結節內,這些結節負責清除白質中的髓鞘碎片(Fig 1c)。WAMs在髓鞘碎片降解中具有重要功能。WAMs參與清除退化的髓鞘。因此,WAMs可能代表清除白質老化和疾病期間積累的變性髓磷脂所需的潛在保護性反應。

WAMs與DAM的形成都依賴于髓樣細胞2 (TREM2)信號上表達的觸發受體,但WAMs似乎代表一種小膠質細胞狀態,顯示DAM基因特征的部分激活, WAMs和DAM狀態可能是連續的細胞身份,可以相互融合。在衰老中,小膠質細胞的激活似乎向WAMs狀態轉移,而在AD中,則向DAM狀態轉移。在老年小鼠中,WAMs似乎是通過ApoE非依賴性途徑產生的,而在AD模型中,具有DAM和WAMs基因特征的小膠質細胞的產生需要ApoE功能。并且WAMs具有一個主要特征：參與白質髓鞘碎片清除。

2.7 膠質瘤相關小膠質細胞和膠質瘤瘤周相關小膠質細胞在惡性膠質瘤中,局部小膠質細胞和循環單核細胞遷移到腫瘤微環境并分化為腫瘤支持細胞,膠質瘤中髓樣細胞亞群的細胞異質性和功能表型仍不清楚。使用scRNA-seq和CyTOF技術對來自對照大腦和腦腫瘤的人類小膠質細胞的基因和蛋白表達進行聯合評估。發現人類膠質瘤中存在相關的小膠質細胞簇(glioma-associated myeloid,GAM)。膠質瘤相關簇的差異基因表達分析顯示,小膠質細胞核心基因的表達較低,而代謝、炎癥和干擾素相關基因的表達更高(Tab 1)。GAM的mRNA表達譜顯示促炎性M1和抗炎性M2極化標志物因子的上調。該證據表明,人類膠質母細胞瘤含有混合的M1/M2樣極化GAM[26](Fig 1d)。在腫瘤周圍組織樣本中還確定了一個離散的髓樣細胞簇,將瘤周GAM(peritumoral GAM ,PGAM)確定為GAM的一個獨特亞群。PGAM富含趨化性和促炎性程序,CCL2、CCL3、CCL4、CCL3L1、CXCL12、CSF1、TNF-α和IL-1β的表達相對較高。PGAM表現出促炎癥和趨化表型,與外周血單核細胞募集相關,并降低總體存活率[27]。PGAM和GAM可用P2RY12區分, P2RY12僅在腫瘤-基質界面標記小膠質細胞。

GAM促進膠質母細胞瘤細胞的生存、增殖、代謝、遷移和自我更新,還可以通過刺激血管生成等間接方式促進膠質母細胞瘤進展[28]。PGAM可能是腫瘤微環境的細胞靶點。

2.8 脂滴蓄積小膠質細胞(lipid-droplet-accumulating microglia,LDAM)通過聯合透射電鏡、相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes raman scattering,CARS)和流式細胞分析技術,研究者比較3月齡和20月齡鼠小膠質細胞的胞漿內容物,發現20月齡鼠小膠質細胞出現明顯的脂滴蓄積,約是3月齡的4倍,主要存在于海馬腦區,并以PLIN3和Iba1聯合標識鑒定出新的小膠質細胞表型-LDAM。LDAM中脂滴構成主要是中性脂質TAGs、DAGs、MAGs和CEs。進一步的高脂滴和低脂滴小膠質細胞轉錄組比較發現,LDAM高表達的基因,主要富集在吞噬功能負調控途徑,促ROS生成、致炎因子生成和β氧化等通路[29]。

LDAM是少有的以代謝變化為主要特征的小膠質細胞亞型。代謝重編程是髓系細胞系調控自身功能的典型生化過程。借鑒于外周的巨噬細胞吞噬脂質在動脈粥樣硬化中的作用和變態炎性反應中的嗜酸性粒細胞,脂滴蓄積被認為是一種炎性標記和細胞器結構,LDAM被認為是一類致炎細胞,參與衰老和神經退行性疾病的發生和進展。同時,轉錄組分析發現,在LDAM下調的基因如AXL、CD74、CLEC7A和CYBB,在另一類依賴TREM2激活的DAM亞型則上調,而DAM被認為是有利于改善AD病理過程。從代謝調控的角度,干預脂滴蓄積是對LDAM亞型功能修復的潛在措施[30]。

3 結語與展望

我們現在知道,大腦中存在小膠質細胞的不同亞群,即小膠質細胞在腦內空間分布上表現出細胞密度、基因和蛋白表達、功能的不同和形態上的差異。在有害刺激存在下會改變單個亞群,并誘導新亞群的出現[31]。了解其形態、轉錄和空間異質性是發現其在神經退行性病變中作用的關鍵。組學的應用能夠對更多小膠質細胞亞型進行詳細描述,越來越多的功能特異性小膠質細胞亞群通過表達一個或兩個獨特的特征基因進行鑒定。明確區分小膠質細胞細胞亞群將加速確定治療藥物靶點和優化藥物輸送方法。短暫的小膠質細胞耗竭后再重新填充小膠質細胞的獨特表型以及其他有利表型,揭示了治療神經疾病的新機會。另一方面,我們對小膠質細胞的研究越來越深入,面臨的亞型區分和功能標識也就越復雜。最初的M1/M2極化概念確實是有用的,雖然特異性標記物發現的越來越多,但是特定亞型細胞功能仍舊圍繞早期的定義,采用這種模式是為了簡化數據解釋,將研究重點放在小膠質細胞轉變為有益的表型上。表征特定小膠質細胞表型的功能具有挑戰性,但對于將科學發現轉化為臨床應用至關重要。新的研究可以針對性地分析特定大腦區域而不是整個大腦的基因表達。

目前小膠質細胞亞型的分類主要來源于人和小鼠,但CD11c+細胞亞型的分類主要來源于小鼠。人類和小鼠之間的物種差異限制了我們對人類小膠質細胞的功能探索。最新研究證明胎兒小膠質細胞的動態靜息/活動狀態轉換在人類和小鼠之間非常相似,但在人類和小鼠的小膠質細胞發育過程中存在分子差異。該研究將為人體小膠質細胞的研究奠定堅實有力的基礎、為小鼠小膠質細胞研究結果向人體醫療轉化提供了理論依據[32]。