受體結合蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶3及其抑制劑的研究進展

陳 迪,羅秀菊,彭 軍

(1.中南大學湘雅藥學院藥理學系,湖南 長沙 410078; 2. 中南大學湘雅三醫院檢驗科,湖南 長沙 410013)

在機體的生長發育中往往伴隨著細胞的生理性和病理性死亡,因此細胞死亡對機體的發育及形態維持具有重要意義。細胞死亡形式有多種,其中研究最透徹的主要有2種,即凋亡和壞死。凋亡是細胞的一種主動死亡形式,受到信號通路嚴格調控,表現為細胞膜皺縮、染色質固縮、核膜核仁破裂和凋亡小體形成,其中核DNA斷裂是細胞凋亡的主要特征之一。壞死是細胞受到意外傷害或刺激后發生的一種被動死亡形式,表現為膜通透性增高、細胞腫脹、細胞器變形或腫大直至細胞破裂。長期以來,人們普遍認為壞死不受信號通路調控,但已有大量研究表明,部分壞死也是受調控的,稱為調節性壞死。根據調控信號通路的不同,調節性壞死可分為壞死樣凋亡、焦亡、鐵死亡、親環素D依賴性壞死等,其中壞死樣凋亡是目前研究的熱點之一。作為介導壞死樣凋亡信號通路中的關鍵分子,受體結合蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶3(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3,RIPK3)已成為當前研究的熱點分子。隨著研究的不斷深入,人們發現RIPK3不僅參與壞死樣凋亡,還參與了凋亡和細胞焦亡的發生,成為了多種細胞死亡通路中交叉重疊的關鍵分子(Fig 1)。本文旨在對RIPK3及其抑制劑的研究進展作一綜述。

Fig 1 Involvement of RIPK3 in necroptosis, apoptosis and pyroptosis

1 RIPK3的生物學特點

RIPK3是RIP激酶家族的7個成員之一,是一種蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶,具有與其他RIP激酶相似的N-末端激酶結構域和一個獨特的C端RIP同源相互作用結構域(RIP homotypic interaction motif,RHIM)[1]。1999年,研究人員首次發現RIPK3,該基因位于人類和小鼠的14號染色體上,在人類中編碼一個含518個氨基酸的蛋白,分子量為57 ku,在小鼠中編碼一個含486個氨基酸的蛋白,分子量為53 ku[2]。

在細胞內,RIPK3主要位于細胞質,但也可作為核質穿梭蛋白在細胞核和細胞質之間進行轉移。而在人體組織中,RIPK3廣泛表達,且在心臟、腸、腎、肺、胰腺和脾臟中的表達水平要明顯高于肝臟和肌肉組織[3]。

2 RIPK3與壞死樣凋亡

壞死樣凋亡因其既具有壞死的形態學特征又像凋亡一樣受到信號通路嚴格調控而得名, 其中受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting serine/threonine protein kinase 1,RIPK1)、RIPK3 和混合譜系激酶結構域樣蛋白( mixed-lineage kinase domain-like pseudokinase,MLKL)是介導壞死樣凋亡的主要分子。

研究表明,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導的壞死樣凋亡中,腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)招募腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域(TNF receptor associated death domain,TRADD)、RIPK1、TNF受體相關因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)和細胞凋亡蛋白抑制因子1/2(cellular inhibitor of apoptosis protein 1 and 2,cIAP1/2)形成復合體Ⅰ。隨后復合體Ⅰ從膜上釋放到胞質中,當caspase-8活性受到抑制時,其中的RIPK1與RIPK3通過RHIM結合形成壞死小體。經過磷酸化修飾后,壞死小體會招募其下游的效應蛋白MLKL,使MLKL發生寡聚并異位至細胞膜,最終導致細胞膜破裂[4]。但MLKL是如何導致質膜破裂的,仍是目前的研究熱點。此外,有報道稱Z-DNA結合蛋白1(Z-DNA binding protein 1,ZBP1)也能通過其RHIM結構域與RIPK3結合而激活RIPK3,進而介導MLKL的活化,發生RIPK3激酶依壞死樣凋亡與多種疾病的發生發展密切相關,包括心肌梗死、腦卒中、神經退行性疾病、腫瘤等。作為介導壞死樣凋亡的關鍵蛋白,開發靶向抑制RIPK3的藥物可為臨床相關疾病的治療提供思路。

賴性的壞死樣凋亡[5]。另有研究報道,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)誘導的壞死樣凋亡通過β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β,TRIF)的RHIM與RIPK3形成異質裝配體而激活TRIF-RIPK3-MLKL途徑[6]。

3 RIPK3與凋亡

細胞凋亡是細胞內的預存死亡程序,是一種穩態的非炎癥過程,主要包括三條信號轉導途徑：內源性途徑(又稱線粒體凋亡途徑)、外源性途徑(又稱死亡受體凋亡途徑)和內質網途徑。Caspases是細胞凋亡中的一類重要的凋亡蛋白酶,凋亡的過程實際就是Caspases被活化并發生凋亡蛋白酶的級聯反應的過程。在促凋亡的Caspases中,Caspase-2,-8,-9,-10是細胞凋亡的啟動者,參與凋亡的起始;Caspase-3,-6,-7則是細胞凋亡的效應者,執行細胞的凋亡程序。

RIPK3不僅是壞死樣凋亡中的重要分子,同樣也參與凋亡的進程。早期研究表明,無激酶活性的RIPK3 D161N不發生壞死樣凋亡,反而促進RIPK1和Caspase-8依賴性的細胞凋亡[7]。在這兩條平行途徑中,與壞死樣凋亡不同的是,RIPK3誘導的凋亡不依賴于其激酶活性,但RIPK1卻是其中的關鍵分子,它的作用是連接RIPK3和Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)、Caspase-8。RIPK3二聚化后,不會發生磷酸化,在RIPK1的作用下通過RIPK1/RIPK3/FADD/Caspase-8通路激活Caspase-8,最終使Caspase-3活化而發生凋亡[8]。

由于凋亡和壞死樣凋亡有重疊的分子機制,所以人們認為壞死樣凋亡是細胞的一種備用程序性死亡,可在受Caspase調控的凋亡途徑被抑制時啟動細胞的死亡。而關于兩種死亡方式的先后順序,有人認為凋亡和壞死樣凋亡是相互排斥的,也有人認為二者原則上可以同時進行。

4 RIPK3與細胞焦亡

細胞焦亡,又稱細胞炎性死亡,是一種促炎的程序性細胞死亡方式。與引起非炎癥反應的細胞凋亡不同,細胞焦亡也依賴于Caspases,但同時伴有大量促炎因子釋放,表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂,導致細胞內容物釋放進而激活強烈的炎癥反應。目前研究發現,細胞焦亡主要有三條途徑：依賴于Caspase-1的經典途徑、依賴于Caspase-4/5/11的非經典途徑和凋亡相關的Caspase參與的途徑。

Caspase-1是細胞焦亡中的一個重要蛋白,它參與炎癥小體的形成,對Gasdermin-D進行切割,促進IL-1β和IL-18的成熟,最后誘發細胞的死亡。然而有研究表明,Caspase-1也可以RIPK3依賴的方式激活。RIPK3抑制劑HG-9-91-01與RIPK3相互作用后招募RIPK1,激活Caspases,最終導致Gasdermin-E裂解,從而引發RIPK3-RIPK1-Caspase-1-Caspase-8誘導的細胞焦亡[9]。在脂多糖誘導的巨噬細胞和樹突狀細胞中,使用凋亡抑制劑蛋白的拮抗劑或基因缺失后,RIPK3依賴的NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)-Caspase-1和Caspase-8這兩個通路的激活均可促進IL-1β前體的成熟和分泌,從而引發炎癥反應,但RIPK3是如何作用于Caspase-8的目前尚不清楚[10]。然而,在Yersinia中,轉化生長因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)抑制的情況下Caspase-8會誘導Gasdermin-D和Gasdermin-E的裂解,從而抑制凋亡、促進焦亡的發生[11]。因此,RIPK3可能通過Caspase-1和Caspase-8這兩個通路的激活參與細胞焦亡的發生。

細胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經系統相關疾病和動脈粥樣硬化性等的發生發展,對細胞焦亡的深入研究有助于為臨床防治提供新思路。因此,RIPK3通過Caspase-1和Caspase-8誘發細胞焦亡或將成為一個新靶點,但三者之間的關系還有待進一步闡明。

5 RIPK3介導的組織器官損傷

RIPK3參與介導炎癥和多種細胞死亡形式(包括壞死樣凋亡、凋亡和細胞焦亡)。TNFR1、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體、Fas受體、TLR3/4、干擾素受體1、ZBP1等的激活均可使RIPK3激活,從而導致細胞死亡和炎癥的發生[12]。

由于RIPK3在機體各組織中廣泛分布,其與肝損傷、缺血性腎損傷、心肌缺血/再灌注損傷、腦缺血/再灌注損傷等多種組織器官的損傷密切相關。2015年研究人員發現,NKT細胞中RIPK3的激活可促使磷酸甘油酸變位酶5激活,再通過發動蛋白相關蛋白1和活化T細胞核因子誘導急性肝損傷,而RIPK3-/-小鼠的肝損傷卻顯著降低[3]。近期有研究表明,在急性腎損傷期間RIPK3的表達增加,而RIPK3的缺乏會減少葉酸誘導的急性腎損傷中炎癥介質的釋放[13]。同時在心肌缺血/再灌注中,RIPK3的表達增加會導致心臟重塑,使AMP依賴的蛋白激酶/Parkin介導的線粒體自噬喪失,最終導致線粒體通透性轉換孔的開放增加,從而引發壞死樣凋亡[14]。而在腦缺血/再灌注模型中,腦缺血會迅速激活RIPK3依賴的壞死樣凋亡,同時使TAK1減少促進凋亡的發生,而RIPK3的缺乏可減少腦出血的風險[15]。此外,小鼠創傷性腦損傷后皮質和海馬會發生進行性慢性腦損傷,并伴隨著pMLKL的升高,壞死樣凋亡的增加;而RIPK3缺陷小鼠可顯著減少這種慢性腦損傷,使星形膠質細胞和小膠質細胞的活化減少,從而發揮神經保護作用[16]。

6 RIPK3抑制劑

如前所述,RIPK3涉及多種損傷相關性疾病的發生發展,故靶向抑制RIPK3有助于減輕損傷和炎癥,從而保護組織器官。根據激酶結合模式,可把RIPK3抑制劑分為Ⅰ型、Ⅱ型和其它類型[12](Tab 1)。

Tab 1 Classification of RIPK3 inhibitors

6.1 Ⅰ型抑制劑通過靶向激酶的活性DFG-in構象,Ⅰ型抑制劑包括Dabrafenib和GSK′843。Dabrafenib最初是用于黑色素瘤的治療,但后來發現它還是一種有效的RIPK3抑制劑,小鼠腹腔注射Dabrafenib后可顯著減小腦梗死體積,降低TNF-α水平[17]。GSK′843可與RIPK3的激酶結構域結合而抑制激酶活性,從而以濃度依賴性的方式抑制壞死樣凋亡,但在高濃度時也會激活caspase發生凋亡[18]。

6.2 Ⅱ型抑制劑靶向激酶的DFG-out構象,Ⅱ型抑制劑包括Sorafenib、Ponatinib、HS-1371、GSK′067、GSK′074。Martens等[19]發現抗癌藥Sorafenib可以靶向TNF-α誘導的壞死樣凋亡通路,在低濃度時可與RIPK1和RIPK3結合而抑制激酶活性,干預壞死小體的形成,但在高濃度時有細胞毒性?？拱籽∷嶱onatinib可阻斷TNF-α誘導的壞死樣凋亡中MLKL的磷酸化,其直接靶點是RIPK1、RIPK3和TAK1,可有效抑制細胞死亡[20]。此外,HS-1371是篩選出的一種RIPK3抑制劑,它可與RIPK3結合抑制激酶活性,干擾壞死小體的形成,從而抑制壞死樣凋亡,但由于凋亡不依賴于RIPK3的激酶活性,所以它不會抑制凋亡,相反,它們的結合可能會引起RIPK3構象的改變從而誘導細胞凋亡[21-22]。GSK′074和GSK′067是兩種結構和細胞功能均相似的化合物,Zhou等[23]發現二者對RIPK1和RIPK3有雙重抑制作用,從而抑制壞死樣凋亡,且細胞毒性低,在高濃度時不會引起細胞凋亡。

6.3 其他除上述兩種類型的抑制劑外,還有許多其他的抑制劑,其中包括RIPK3的經典抑制劑GSK′872。與GSK′843一樣,GSK′840和GSK′872也可與RIPK3的激酶結構域結合而抑制其激酶活性,然而這兩種抑制劑在高濃度時均具有較大的細胞毒性[18]。Rodriguez D A等篩選出的抑制劑GW′39B的結構核心與GSK′872非常相似,可以阻斷RIPK3介導的MLKL在小鼠和人細胞中的磷酸化,從而抑制MLKL的寡聚化,但高濃度時是否存在細胞毒性還有待確認[24]。從ZINC數據庫中篩選出的三種化合物ZINC71828321、ZINC72474191和ZINC72454060具有與RIPK3結合的能力而抑制RIPK3,在體外也表現出對缺血后的神經保護作用[25]。

最近,一個新的小分子化合物Zharp-99也顯示出對RIPK3有抑制作用,可有效阻斷死亡受體和Toll樣受體配體誘導的壞死樣凋亡,且這個小分子顯示出良好的體外安全性和體內藥動學參數[26],有望成為新的壞死樣凋亡抑制劑。AZ-628也可作為一種潛在的RIPK3抑制劑減弱RIPK3的激酶活性,減少RIPK3介導的骨關節炎的發病機制,同時其細胞毒性也較低[22]。此外,SIKs抑制劑HG-9-91-01也在近期被發現可直接靶向RIPK3激酶活性,抑制RIPK3與下游MLKL的結合,減少MLKL的寡聚,從而抑制壞死樣凋亡,然而HG-9-91-01也被發現會誘導細胞焦亡[9]。在HT-29細胞中,Raf激酶抑制劑TAK-632及其類似物SZM594 通過抑制RIPK1和RIPK3的磷酸化來阻斷壞死小體的形成,同時也會抑制RIPK3和MLKL之間的相互作用,且SZM594對壞死樣凋亡的阻斷作用比已知的經典RIPK3抑制劑更有效[27]。隨后Bcr-Abl抑制劑GNF-7也被發現可以抑制RIPK1和RIPK3的磷酸化而抑制壞死小體的形成[28]。SRC抑制劑PP2可抑制壞死樣凋亡而不觸發細胞凋亡,它通過影響RIPK3的寡聚而影響MLKL的磷酸化和寡聚化[29]。

雖然針對RIPK3抑制劑的開發在不斷進行,但目前仍沒有一種RIPK3抑制劑被臨床選擇用于治療與RIPK3相關的疾病。高劑量藥物的細胞毒性限制了這些抑制劑作為治療藥物的潛力,因此開發更安全有效的RIPK3抑制劑仍在進行中。

7 結語

綜上所述,RIPK3在細胞死亡中發揮著重要的作用,它既可啟動激酶依賴性的壞死樣凋亡,也可參與不依賴于激酶活性的Caspase-8介導的凋亡和焦亡,而這些死亡方式之間往往是協同調控的。如TAK1和ZBP1可共同參與調控RIPK3和Caspase-8,調節RIPK1/RIPK3-FADD-Caspase-8細胞死亡復合體的組裝,執行壞死樣凋亡、細胞凋亡和細胞焦亡[30]。此外,由于RIPK3是Caspase-8蛋白水解酶的底物,而Caspase-8是幾種細胞死亡方式的分子開關,可在細胞死亡信號發出后控制壞死樣凋亡、細胞凋亡和焦亡信號通路,決定其所觸發的死亡類型。因此,作為多種細胞死亡方式的交匯點,RIPK3有可能成為精準調控細胞死亡方式的靶點。在目前已知的RIPK3抑制劑中,雖然部分已用于臨床,但并非通過抑制RIPK3用于疾病治療。雖然通過靶向調節RIPK3用于相關疾病的治療還有相當長的路要走,但并不能否定其廣闊的臨床前景。